Name: quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy at JoVE.com

Vi vil gjerne anerkjenne Maurine Hobbs og centralized Zebrafish Animal Resource (CZAR) ved University of Utah for å gi sebrafisk husdyrhold, laboratorieplass og utstyr for å utføre deler av denne forskningen. Utvidelse av CZAR støttes delvis av NIH stipend # 1G20OD018369-01. Vi vil også takke Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum og Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility for sebrafiskomsorg. Vi vil gjerne takke Kenneth Kompass for hjelp med R-programmering. Dette arbeidet ble delvis finansiert av tilskudd fra Huntsman Cancer Foundation (i forbindelse med stipend P30 CA042014 tildelt Huntsman Cancer Institute) (KJE) og NIH/NCI R01CA22570 (KJE).

Dyrestudier utføres etter prosedyrer godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Utah.
1. Feste larver
<ol><li>Ved 3–7 dager etter befruktning (dpf) eutaniserer eutanasi larver med trikainmetansulfonat (0,03 %) og samle opptil 15 larver i et 2 ml rør ved hjelp av en glasspipette og pipettepumpe.</li>
	<li>Vask larver to ganger med 1 ml kaldt (4 °C) 1x fosfatbufret saltvann (PBS) på is. For hver vask, fjern så mye væske som mulig fra røret med en...

<ol>
	<li>Lin, D. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li><li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+hepatocellular+carcinoma:+Epidemiology,+etiology,+and+carcinogenesis.">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).</li><li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+&#946;-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish.">Identification of Chemical Inhibitors of &#946;-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).</li><li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish.">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras(V12)+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish.">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+kras(V12)+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening.">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors.">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li><li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth.">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li><li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18,+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease.">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li><li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish:+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes.">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).</li><li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish.">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae:+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs.">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition &amp; Metabolism. 12, 42 (2015).</li><li>Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin.">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li><li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development.">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).</li><li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling.">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).</li><li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor,+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2,+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish:+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver.">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li></ol>

Kvantifisering av leverstørrelse er avgjørende i studier som tar sikte på å forstå leverutvikling, regenerering og onkogenese. Protokollen som er beskrevet her er en relativt rask, enkel og billig teknikk for leverstørrelse kvantifisering i larval sebrafisk. Utøvelse av passende forsiktighet mens du utfører visse aspekter av protokollen kan hjelpe til med økt nøyaktighet av resultater og redusert frustrasjon.
Riktig fiksering av larver er avgjørende for å få godt bevarte biologisk...

Hepatocellulært karsinom (HCC) er den vanligste primære maligniteten i leveren1 og den tredje ledende årsaken til kreftrelatert dødelighet2. For bedre å forstå mekanismer for hepatokarsinogenese og identifisere potensielle HCC-terapeutiske midler, har vi og andre utviklet transgene sebrafisk der hepatoktino-spesifikt uttrykk for onkogenes som β-catenin3,4, Kras(V12)5,6,Myc7eller Yap18 fører til HCC hos voksne dyr. I disse sebrafiskene er leverforstørrelse notert så tidlig som 6 dager etter befruktning (dpf), noe som gir en facile plattform for å teste effekten av narkotika og genetiske endringer på onkogendrevet leverovervekst. Nøyaktig og presis måling av larval leverstørrelse er avgjørende for å bestemme effekten av disse manipulasjonene.
Leverstørrelse og form kan vurderes semikvantitativt i faste sebrafisk larver ved CY3-SA merking9 eller i levende sebrafisk larver ved hjelp av hepatocytterspesifikke fluorescerende reportere og fluorescensdissekermikroskopi5,6. Sistnevnte metode er relativt rask, og mangelen på presisjon kan løses ved å fotografere og måle området av hver lever ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare7,10. Det kan imidlertid være teknisk utfordrende å jevnt plassere alle levende larver i et eksperiment slik at todimensjonalt leverområde er en nøyaktig representasjon av leverstørrelse. En lignende teknikk for å kvantifisere leverstørrelse innebærer å bruke lysark fluorescens mikroskopi for å kvantifisere larval levervolum8, som kan være mer nøyaktig for å oppdage størrelsesforskjeller når leveren utvides ikke-jevnt i forskjellige dimensjoner. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) kan brukes til å telle antall fluorescerende merkede hepatocytter og andre levercelletyper i larvallever8,11. I denne metoden er larvallever samlet og dissosiert, så informasjon om individuell leverstørrelse og form går tapt. I kombinasjon med en annen metode for bestemmelse av leverstørrelse muliggjør FACS differensiering mellom økt cellenummer (hyperplasi) og økt cellestørrelse (hypertrofi). Alle disse metodene bruker dyr fluorescensteknologi (mikroskop eller cellesortering) og, med unntak av CY3-SA-merking, krever merking av hepatocytter med en fluorescerende reporter.
Her beskriver vi i detalj en metode for å kvantifisere sebrafisk larveleverområde ved hjelp av lyse felt mikroskopi og bildebehandling programvare3,12,13,14. Denne protokollen muliggjør nøyaktig kvantifisering av arealet av individuelle lever in situ uten bruk av fluorescens mikroskopi. Mens du analyserer leverstørrelsen, blinder vi bildeidentiteten for å redusere etterforskerbias og forbedre vitenskapelig rigor15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Camera for dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine (Dumont #5) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J/FIJI</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 9-well round-bottom glass dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for blinding files</td>
			<td>R project</td>
			<td></td>
			<td>R can be downloaded for free: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>200-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very fine (Dumont #55) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy

I flere transgene sebrafiskmodeller av hepatocellulært karsinom (HCC) kan hepamegali observeres under tidlige larvestadier. Kvantifiserende larval leverstørrelse i sebrafisk HCC modeller gir et middel til raskt å vurdere effekten av narkotika og andre manipulasjoner på en onkogen-relatert fenotype. Her viser vi hvordan du fikser sebrafisk larver, dissekerer vevet rundt leveren, fotograferer lever ved hjelp av lyse feltmikroskopi, måler leverområdet og analyserer resultater. Denne protokollen muliggjør rask, presis kvantifisering av leverstørrelse. Siden denne metoden innebærer å måle leverområdet, kan det undervurdere forskjeller i levervolum, og komplementære metoder er nødvendig for å skille mellom endringer i cellestørrelse og endringer i cellenummer. Disseksjonsteknikken som er beskrevet her, er et utmerket verktøy for å visualisere leveren, tarmen og bukspyttkjertelen i naturlige posisjoner for utallige nedstrøms applikasjoner, inkludert immunfluorescensfarging og in situ hybridisering. Den beskrevne strategien for å kvantifisere larval leverstørrelse gjelder for mange aspekter av leverutvikling og regenerering.

Transgen sebrafisk som uttrykker hepatocyttspesifikk aktivert β-catenin (Tg (fabp10a: pt-β-cat) sebrafisk)3 og ikke-transgene kontrollsøsken ble euthanized ved 6 dpf og leverområdet ble kvantifisert ved hjelp av brightfield mikroskopi og bildebehandlingsprogramvare. Transgene sebrafisk har betydelig økt leverstørrelse (0,0006 cm2)sammenlignet med deres ikke-transgene søsken (0,0004 cm2, p < 0,0001; Figur 1).
...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy at JoVE.com

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

Her viser vi en metode for å kvantifisere leverstørrelse i larval sebrafisk, noe som gir en måte å vurdere effekten av genetiske og farmakologiske manipulasjoner på levervekst og utvikling.

Kvantifisere leverstørrelse i Larval Sebrafisk Ved hjelp av Brightfield Microscopy

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Denne metoden gir en måte å kvantifisere leverstørrelse i larval sebrafisk. Det gjør det også mulig å vurdering av effekten av genetisk og farmakologisk manipulasjon på levervekst og utvikling. Denne teknikken gir en rask og presis måte å visualisere og måle leveren samt tarmen og bukspyttkjertelen.I tillegg til å kvantifisere leverstørrelse, kan denne disseksjonsmetoden være nyttig for å forberede leveren, tarmen og bukspyttkjertelen for in situ hybridisering eller konokkal avbildning. Før du prøver å deskinning på eksperimentelle larver, sørg for at du har brukt god tid på å øve på ikke-eksperimentelle prøver og har en betydelig suksessrate. Det er viktig å visualisere riktig orientering og bevegelse av sebrafisk larver og tang for å fjerne huden uten å forstyrre omkringliggende organer.På tre til syv dager etter befruktning, etter euthanizing larver, bruk en glasspipette og pipettepumpe for å samle opptil 15 larver i et to milliliter rør. Vask larver to ganger med en milliliter kald 1X PBS på is. Fjern så mye PBS som mulig ved hjelp av en glasspipette og pipettepumpe og tilsett en milliliter kald fire prosent PFA i PBS.Inkuber ved fire grader Celsius minst over natten med mild gynge. Bruk en glasspipette og pipettepumpe til å fjerne PFA fra røret og skyll tre ganger med en milliliter kald PBS. Rock i fem minutter mellom skyll.Pipette flere larver i PBS i en brønn av ni-brønn rund bunn glassrett. Under et mikroskop fjerner du huden rundt leveren ved hjelp av fine tang for å holde en larve på ryggen, gripende på hver side av hodet så forsiktig som mulig. Bruk deretter veldig fine tang i den andre hånden for å gripe huden bare overlying hjertet.Trekk huden ned diagonalt mot halen på fisken i bunnen av fatet på venstre eller høyre side av fisken. Gjenta for den andre siden. Fortsett å ta tak i hudklaffer og trekk ned til hele huden og melanophores overlying eller nær leveren har blitt fjernet.Hvis eggeplomme er tilstede i fem til seks dager etter befruktning larver, løft eggeplommen av i ett stykke ved å holde fisken med fine tang på ryggen og bruke de veldig fine tangene til å forsiktig prod eggeplommen. For tre til fire DPF larver, hold fisken med fine tang på ryggen og bruk de veldig fine tangene til å stryke eggeplommen fra ventral side. Skrap eggeplommen av i biter.Legg dissekerte larver i friske, kalde PBS i et to milliliter rør ved hjelp av en glasspipette og pipettepumpe. For å montere larver, hell noen milliliter på tre prosent metylcellulose på lokket på ren, plast Petriskål. Bruk en glasspipette og pipettepumpe for å legge larver til metylcellulose, og legg til så lite PBS med larver som mulig.Under et dissekerende mikroskop ved lav forstørrelse, bruk fine tang for å orientere fisken slik at de ligger på høyre side mot venstre. Bekreft at fisken som skal fotograferes er perfekt justert med det ene øyet rett oppå det andre øyet. Hvis fiskens hale er bøyd, fjern halen ved å klemme den kraftig med tang for å fjerne den slik at fisken legger seg flat.Zoom inn til høy forstørrelse og fokuser på leveren, og sørg for at leverens omriss er godt synlig. Trykk på Ta bilde-knappen for å forankre et bilde og lagre filen. Gjenta for all fisk, og sørg for at forstørrelsen er den samme for hvert bilde.Ta et bilde av et mikrometer ved hjelp av samme forstørrelse. For å bruke programmet R til å blinde alle leverbilder for å unngå potensielle etterforskerbias og fremme vitenskapelig rigor, endre navn på filer tilfeldig og opprette en randomiseringsfil som inneholder en liste over de opprinnelige filnavnene og tilsvarende blindede filnavn. Åpne randomiserte filer i rekkefølge, og start med fil én.Velg Freehand Selections verktøyet og skisser hver lever. Trykk på Control-M for å måle området for hver lever. For lever som ikke kan måles nøyaktig fordi de har gjenværende hud, eggeplomme, er ute av fokus, eller ikke er intakte, sett inn en plassholdermåling.Lagre målene i en tekstfil. Hvis du vil unblind og analysere data, åpner du målefilen og randomiseringsfilen i et regnearkprogram. Sett inn en ny kolonne i målfilen, og legg til de opprinnelige filnavnene for de blindede filene ved hjelp av Randomization-filen.Lagre denne filen som filen Ublindede målinger. Sorter dataene etter det opprinnelige filnavnet. Ekskluder eventuelle levermålinger som bildene ikke var tilstrekkelige for.Om nødvendig konvertere måleverdier til ønsket skala i kvadratimender. Åpne skalalinjen i bildebehandlingsprogramvaren. Bruk rett linje-verktøyet til å måle én millimeter på skaleringslinjen.Bildebehandlingsprogramvaren måler deretter i de samme enhetene som leverene, noe som gir en konverteringsfaktor. Bruk konverteringsfaktoren til å konvertere målinger i filen Ublindede målinger. Bestem gjennomsnittet og standardavviket, og beregn P-verdier.På seks dager etter befruktning viste ikke-transgene sebrafisk larver naturlig posisjon og form av lever overbelying tarmen. Transgen sebrafisk har betydelig økt leverstørrelse sammenlignet med deres ikke-transgene søsken. Noen eksempler på utilstrekkelige bilder og mikrometer vises her.Larve med hud som dekker leveren, larve med eggeplomme som skjuler leveren, larve med deler av leveren klemt av, og larve med lever forstuet og faller av, larve med manglende lever, larve med leveromriss som er vanskelig å identifisere, og larve med feil posisjonering. Når du prøver denne prosedyren, er det viktig å bruke små og kontrollerte bevegelser for å forhindre skade på leveren. I tillegg til lysfeltmikroskopi kan vi også bruke larver dissekert på denne måten, for konfokal mikroskopi, for å visualisere fluorescerende reporterproteiner eller immunfluoreserende farging, og for in situ hybridisering.Formaldehyd eller PFA er et irriterende og mistenkt kreftfremkallende. Hansker bør brukes ved håndtering av PFA og konsentrerte løsninger skal håndteres i en kjemisk røykhette.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Live-Imaging av medfødte immun og preneoplastiske Cell Interaksjoner Bruke en induserbar Gal4 / UAS Expression System i Larvesebrafisk Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Fange Tissue Repair i Sebrafisk Larver med Time-lapse Lysfelt stereomikros

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocytter spesifikke Ablation i Sebrafisk å studere Galledrevet Liver Regeneration

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse av Sebrafisk Nyre Development med Time-lapse Imaging Ved hjelp av en dissekere mikroskop Utstyrt for Optical Seksjonering

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Ved hjelp av lys Sheet Fluorescensmikroskopi til bilde Sebrafisk Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Disseksjon av Larve Sebrafisk Gonadale Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologiske analyser av akutt alkoholskader i sebrafisk

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Correlative super-oppløsning og elektronmikroskop løse Protein lokalisering i sebrafisk netthinnen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering av larver sebrafisk som et dyr-modellen for å undersøke Trypanosoma cruzi motilitet I Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...