Name: quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00
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Nos gustaría reconocer a Maurine Hobbs y el Centrald Zebrafish Animal Resource (CZAR) en la Universidad de Utah por proporcionar cría de peces cebra, espacio de laboratorio y equipo para llevar a cabo porciones de esta investigación. La expansión del CZAR es apoyada en parte por la subvención NIH n.o 1G20OD018369-01. También nos gustaría dar las gracias a Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum, y la instalación de pez cebra del Huntsman Cancer Institute (HCI) para el cuidado del pez cebra. Nos gustaría agradecer a Kenneth Kompass por su ayuda con la programación R. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de la Fundación Huntsman Cancer (en conjunto con la subvención P30 CA042014 otorgada al Huntsman Cancer Institute) (KJE) y NIH/NCI R01CA222570 (KJE).

Los estudios en animales se llevan a cabo siguiendo procedimientos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Utah.
1. Fijación de larvas
<ol><li>A los 3-7 días después de la fertilización (dpf), larvas de eutanasia con tricaína metanoesulfonato (0,03%) y recoger hasta 15 larvas en un tubo de 2 ml utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta.</li>
	<li>Lave las larvas dos veces con 1 ml de frío (4 oC) 1 x solución salina c...

<ol>
	<li>Lin, D. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li><li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+hepatocellular+carcinoma:+Epidemiology,+etiology,+and+carcinogenesis.">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).</li><li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+&#946;-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish.">Identification of Chemical Inhibitors of &#946;-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).</li><li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish.">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras(V12)+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish.">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+kras(V12)+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening.">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors.">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li><li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth.">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li><li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18,+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease.">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li><li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish:+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes.">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).</li><li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish.">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae:+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs.">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition &amp; Metabolism. 12, 42 (2015).</li><li>Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin.">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li><li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development.">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).</li><li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling.">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).</li><li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor,+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2,+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish:+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver.">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li></ol>

La cuantificación del tamaño del hígado es crucial en estudios dirigidos a comprender el desarrollo hepático, regeneración y oncogénesis. El protocolo descrito aquí es una técnica relativamente rápida, fácil y barata para la cuantificación del tamaño del hígado en peces cebra larvaria. Ejercer la precaución apropiada mientras se realizan ciertos aspectos del protocolo puede ayudar a aumentar la precisión de los resultados y disminuir la frustración.
La fijación adecuada de las...

El carcinoma hepatocelular (HCC) es la neoplasia maligna primaria más común del hígado1 y la tercera causa de mortalidad relacionada con el cáncer2. Para comprender mejor los mecanismos de la hepatocarcinogénesis e identificar posibles terapias de HCC, nosotros y otros hemos desarrollado peces cebra transgénicos en los que la expresión específica de hepatocitos de oncogenes tales como la -catenina3,4, Kras(V12)5,6, Myc7, o Yap18 conduce a HCC en animales adultos. En estos peces cebra, el agrandamiento del hígado se observa ya 6 días después de la fertilización (dpf), proporcionando una plataforma fácil para probar los efectos de los fármacos y alteraciones genéticas en el crecimiento excesivo del hígado impulsado por oncógeno. La medición precisa y precisa del tamaño del hígado larvaria es esencial para determinar los efectos de estas manipulaciones.
El tamaño y la forma del hígado pueden evaluarse semicuantitativamente en larvas fijas de peces cebra etiquetando CY3-SA9 o en larvas de peces cebra vivos utilizando reporteros fluorescentes específicos de hepatoparcitos y microscopía de disección de fluorescencia5,6. Este último método es relativamente rápido, y su falta de precisión se puede abordar fotografiando y midiendo el área de cada hígado utilizando el software de procesamiento de imágenes7,10. Sin embargo, puede ser técnicamente difícil posicionar uniformemente todas las larvas vivas en un experimento tal que el área hepática bidimensional es una representación precisa del tamaño del hígado. Una técnica similar para cuantificar el tamaño del hígado implica el uso de microscopía de fluorescencia de láminas de luz para cuantificar el volumen del hígado larvario8, que puede ser más precisa para detectar diferencias de tamaño cuando el hígado se expande de forma no uniforme en diferentes dimensiones. La clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) se puede utilizar para contar el número de hepatocitos etiquetados fluorescentemente y otros tipos de células hepáticas en hígados larvarios8,11. En este método, los hígados larvales se agrupan y se disocian, por lo que se pierde información sobre el tamaño y la forma del hígado individual. En combinación con otro método de determinación del tamaño del hígado, FACS permite la diferenciación entre el aumento del número de células (hiperplasia) y el aumento del tamaño celular (hipertrofia). Todos estos métodos emplean costosa tecnología de fluorescencia (microscopio o clasificador celular) y, a excepción del etiquetado CY3-SA, requieren el etiquetado de hepatocitos con un reportero fluorescente.
Aquí describimos en detalle un método para cuantificar el área del hígado larvario de peces cebra utilizando microscopía de campo brillante y software de procesamiento de imágenes3,12,13,14. Este protocolo permite cuantificar con precisión el área de hígados individuales in situ sin el uso de microscopía de fluorescencia. Al analizar el tamaño del hígado, cegamos la identidad de la imagen para reducir el sesgo del investigador y mejorar el rigor científico15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Camera for dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine (Dumont #5) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J/FIJI</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 9-well round-bottom glass dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for blinding files</td>
			<td>R project</td>
			<td></td>
			<td>R can be downloaded for free: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>200-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very fine (Dumont #55) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy

En varios modelos transgénicos de peces cebra de carcinoma hepatocelular (HCC), se puede observar hepatomegalia durante las primeras etapas larvales. La cuantificación del tamaño del hígado larvario en los modelos de HCC de pez cebra proporciona un medio para evaluar rápidamente los efectos de los fármacos y otras manipulaciones en un fenotipo relacionado con oncogén. Aquí mostramos cómo reparar larvas de peces cebra, diseccionar los tejidos que rodean el hígado, fotografiar hígados usando microscopía de campo brillante, medir el área hepática y analizar los resultados. Este protocolo permite una cuantificación rápida y precisa del tamaño del hígado. Como este método implica medir el área hepática, puede subestimar las diferencias en el volumen hepático, y se requieren metodologías complementarias para diferenciar entre los cambios en el tamaño celular y los cambios en el número de células. La técnica de disección descrita en este documento es una excelente herramienta para visualizar el hígado, el intestino y el páncreas en sus posiciones naturales para innumerables aplicaciones aguas abajo, incluyendo la tinción de inmunofluorescencia y la hibridación in situ. La estrategia descrita para cuantificar el tamaño del hígado larvario es aplicable a muchos aspectos del desarrollo y la regeneración del hígado.

El pez cebra transgénico que expresa balasteo específico de hepatocitos activado (Tg(fabp10a:pt-a-cat) -cat) 3 y los hermanos de control no transgénicos fueron eutanasiados a 6 dpf y el área hepática se cuantificó utilizando microscopía de campo brillante y software de procesamiento de imágenes. El pez cebra transgénico ha aumentado significativamente el tamaño del hígado (0.0006 cm2) en comparación con sus hermanos no transgénicos (0.0004 cm2, ...

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Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

Aquí demostramos un método para cuantificar el tamaño del hígado en el pez cebra larval, proporcionando una manera de evaluar los efectos de las manipulaciones genéticas y farmacológicas en el crecimiento y desarrollo del hígado.

Cuantificación del tamaño del hígado en el pez cebra larvario mediante la microscopía Brightfield

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Este método proporciona una manera de cuantificar el tamaño del hígado en el pez cebra larval. También permite la evaluación de los efectos de la manipulación genética y farmacológica en el crecimiento y desarrollo hepático. Esta técnica proporciona una forma rápida y precisa de visualizar y medir el hígado, así como el intestino y el páncreas.Además de cuantificar el tamaño del hígado, este método de disección puede ser útil para preparar el hígado, el intestino y el páncreas para la hibridación in situ o imágenes confocales. Antes de intentar desfalar en larvas experimentales, asegúrate de haber pasado mucho tiempo practicando en muestras no experimentales y tener una tasa de éxito significativa. Es fundamental visualizar la orientación y el movimiento adecuados de las larvas y fórceps de peces cebra para eliminar la piel sin perturbar los órganos circundantes.A los tres a siete días después de la fertilización, después de eutanasiar larvas, utilice una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta para recoger hasta 15 larvas en un tubo de dos mililitros. Lave las larvas dos veces con un mililitro de PBS frío 1X sobre hielo. Retire tanto PBS como sea posible usando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta y agregue un mililitro de PFA frío de cuatro por ciento en PBS.Incubar a cuatro grados centígrados al menos durante la noche con un suave balanceo. Con una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta, retire el PFA del tubo y enjuague tres veces con un mililitro de PBS frío. Mece durante cinco minutos entre enjuagues.Pipetear varias larvas en PBS en un pozo de nueve pozos de plato de vidrio de fondo redondo. Bajo un microscopio, retire la piel que rodea el hígado usando fórceps finos para sostener una larva en su espalda, agarrándose a cada lado de la cabeza tan suavemente como sea posible. Luego usa fórceps muy finos en la otra mano para agarrar la piel justo sobre el corazón.Tire de la piel hacia abajo diagonalmente hacia la cola del pescado en la parte inferior del plato en el lado izquierdo o derecho del pescado. Repita para el otro lado. Continúe agarrando aletas de piel y tirando hacia abajo hasta que toda la piel y los melanoforos que se extienden o cerca del hígado hayan sido eliminados.Si la yema está presente durante cinco a seis días después de la fertilización, levante la yema en una sola pieza sosteniendo el pez con fórceps finos en su espalda y usando los fórceps muy finos para prodear suavemente la yema. Para tres a cuatro larvas de DPF, sostenga el pez con fórceps finos en su espalda y use los fórceps muy finos para acariciar la yema a partir del lado ventral. Raspa la yema en pedazos.Coloque las larvas diseccionadas en PBS fresco y frío en un tubo de dos mililitros utilizando una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta. Para montar las larvas, vierta unos mililitros de tres por ciento de metilcelulosa en la tapa de la placa limpia y plástica de Petri. Utilice una pipeta de vidrio y una bomba de pipeta para añadir larvas a la metilcelulosa, añadiendo el menor PBS con las larvas como sea posible.Bajo un microscopio diseccionando con un aumento bajo, utilice fórceps finos para orientar a los peces de modo que estén acostados en su lado derecho mirando hacia la izquierda. Confirme que el pez a fotografiar está perfectamente alineado con un ojo directamente encima del otro ojo. Si la cola del pez está doblada, retire la cola pellizcándola con fuerza con fórceps para retirarla de modo que el pez quede plano.Acércate a un aumento alto y concéntrate en el hígado, asegurándote de que el contorno del hígado sea claramente visible. Pulse el botón Capturar imagen para ajustar una imagen y guardar el archivo. Repita el proceso para todos los peces, asegurándose de que el aumento sea el mismo para cada imagen.Tome una foto de un micrómetro usando el mismo aumento. Para utilizar el programa R para cegar todas las imágenes hepáticas para evitar posibles sesgos de investigador y promover el rigor científico, cambiar el nombre de los archivos al azar y crear un archivo de aleatorización que contiene una lista de los nombres de archivo originales y los nombres de archivo cegados correspondientes. Abra los archivos aleatorios en orden, empezando por el archivo uno.Elija la herramienta Selecciones a mano alzada y delinee cada hígado. Presione Control-M para medir el área de cada hígado. Para cualquier hígado que no se pueda medir con precisión porque tienen piel residual, yema, están fuera de foco, o no están intactos, inserte una medida de marcador de posición.Guarde las medidas en un archivo de texto. Para desabromar y analizar datos, abra el archivo de mediciones y el archivo de aleatorización en un programa de hoja de cálculo. Inserte una nueva columna en el archivo de medidas y agregue los nombres de archivo originales para los archivos ciegos mediante el archivo de aleatorización.Guarde este archivo como el archivo De medidas sin ciegos. Ordene los datos por el nombre de archivo original. Excluir cualquier medida hepática para la que las imágenes no fueran adecuadas.Si es necesario, convierta los valores de medición en la escala deseada en milímetros cuadrados. Abra la barra Escala en el software de procesamiento de imágenes. Utilice la herramienta Línea recta para medir un milímetro en la barra de escala.El software de procesamiento de imágenes mide en las mismas unidades que los hígados, dando un factor de conversión. Utilice el factor de conversión para convertir medidas en el archivo Mediciones no ciegas. Determine la media y la desviación estándar y calcule los valores P.A los seis días después de la fertilización, las larvas de pez cebra no transgénicas mostraron la posición natural y la forma del hígado sobre el intestino. El pez cebra transgénico ha aumentado significativamente el tamaño del hígado en comparación con sus hermanos no transgénicos. Aquí se muestran algunos ejemplos de imágenes y micrómetros inadecuados.Larva con piel cubriendo el hígado, larvas con yema que oscurecen el hígado, larvas con partes del hígado pellizcadas, y larvas con hígado dislocado y cayendo, larva con hígado perdido, larva con contorno hepático que es difícil de identificar, y larvas con posicionamiento inadecuado. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar movimientos pequeños y controlados para prevenir daños en el hígado. Además de la microscopía de campo brillante, también podemos utilizar larvas diseccionadas de esta manera, para la microscopía confocal, para visualizar proteínas fluorescentes de reportero o tinción inmuno fluorescente, y para la hibridación en situación.El formaldehído o PFA es un irritante y presunto carcinógeno. Los guantes deben usarse cuando se manipula PFA y las soluciones concentradas deben manipularse en una campana de humos química.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Imágenes en vivo de inmune innata y preneoplásicas Interacciones de celda que utilizan un sistema de expresión / UAS Inducible Gal4 en larvas de pez cebra de la piel

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

La captura de Reparación de Tejidos en pez cebra larvas con Time-lapse Brightfield Estereomicroscopía

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Ablación específico de hepatocitos en pez cebra para estudiar biliar impulsada regeneración hepática

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Análisis para el Desarrollo de riñón de pez cebra con time-lapse de uso de un microscopio de disección equipado para seccionamiento óptico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

La disección de las larvas de pez cebra de tejidos gonadales

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Análisis histológicos de lesiones hepáticas alcohólicas agudas en peces cebra

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Resolución súper correlativo y la microscopia electrónica para resolver la localización de la proteína en la Retina del pez cebra

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...