Name: quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy at JoVE.com

Vi vill erkänna Maurine Hobbs och centraliserad zebrafisk Animal Resource (CZAR) vid University of Utah för att tillhandahålla zebrafisk hållning, laboratorieutrymme och utrustning för att utföra delar av denna forskning. Utbyggnaden av CZAR stöds delvis av NIH-bidrag # 1G20OD018369-01. Vi vill också tacka Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum och Huntsman Cancer Institute (HCI) Zebrafish Facility för zebrafisk vård. Vi vill tacka Kenneth Kompass för hjälp med R programmering. Detta arbete finansierades delvis genom bidrag från Huntsman Cancer Foundation (i samband med bidrag P30 CA042014 tilldelas Huntsman Cancer Institute) (KJE) och NIH/NCI R01CA222570 (KJE).

Djurstudier utförs efter förfaranden som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid University of Utah.
1. Fastställande Larver
<ol><li>Vid 3–7 dagar efter befruktning (dpf) avliva eekterna med tricainmetensulfonat (0,03 %) och samla upp till 15 larver i ett 2 mL-rör med hjälp av en glaspipett- och pipettpump.</li>
	<li>Tvätta larver två gånger med 1 ml kallt (4 °C) 1x fosfatbuffrad saline (PBS) på is. För varje tvätt, ta bort så mycket vätska som m?...

<ol>
	<li>Lin, D. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li><li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+hepatocellular+carcinoma:+Epidemiology,+etiology,+and+carcinogenesis.">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).</li><li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+&#946;-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish.">Identification of Chemical Inhibitors of &#946;-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).</li><li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish.">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras(V12)+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish.">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+kras(V12)+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening.">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors.">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li><li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth.">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li><li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18,+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease.">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li><li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish:+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes.">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).</li><li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish.">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae:+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs.">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition &amp; Metabolism. 12, 42 (2015).</li><li>Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin.">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li><li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development.">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).</li><li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling.">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).</li><li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor,+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2,+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish:+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver.">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li></ol>

Kvantifiering av leverstorlek är avgörande i studier som syftar till att förstå leverutveckling, förnyelse och onkogenes. Protokollet beskrivs här är en relativt snabb, enkel och billig teknik för leverstorlek kvantifiering i larval zebrafisk. Att iaktta lämplig försiktighet när du utför vissa aspekter av protokollet kan hjälpa till att öka noggrannheten i resultaten och minskad frustration.
Korrekt fixering av larverna är avgörande för att få välbevarade biologiska prover o...

Hepatocellulär karcinom (HCC) är den vanligaste primära maligniteten ilevern 1 och den tredje vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet2. För att bättre förstå mekanismer av hepatocarcinogenes och identifiera potentiella HCC therapeutics, vi och andra har utvecklat transgena zebrafisk där hepatocyte-specifika uttryck för onkogener såsom β-catenin3,4,Kras(V12)5,6, Myc7, eller Yap18 leder till HCC hos vuxna djur. I dessa zebrafisk noteras leverutvidgningen så tidigt som 6 dagar efter befruktning (dpf), vilket ger en facile plattform för att testa effekterna av läkemedel och genetiska förändringar på onkogendriven leveröverväxt. Exakt och exakt mätning av larval leverstorlek är viktigt för att fastställa effekterna av dessa manipulationer.
Leverstorlek och form kan bedömas semikvantitativt i fasta zebrafisklarver med CY3-SA med etiketten9 eller i levande zebrafisklarver med hepatocytespecifika fluorescerande reportrar och fluorescerande dissekering slemhinne imikroskopi 5,6. Den senare metoden är relativt snabb, och dess brist på precision kan åtgärdas genom att fotografera och mäta området för varje lever med hjälp av bildbehandling programvara7,10. Emellertid, Det kan vara tekniskt utmanande att enhetligt placera alla levande larver i ett experiment så att tvådimensionella leverområdet är en korrekt representation av leverstorlek. En liknande teknik för kvantifiering leverstorlek innebär att använda ljusblad fluorescens mikroskopi för att kvantifiera larv levervolym8, vilket kan vara mer exakt för att upptäcka storleksskillnader när levern utökas icke-enhetligt i olika dimensioner. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan användas för att räkna antalet fluorescerande märkta hepatocyter och andra levercelltyper i larvallever8,11. I denna metod, larv lever är poolade och dissociated, så information om enskilda leverstorlek och form går förlorad. I kombination med en annan leverstorlek bestämningsmetod, FACS möjliggör differentiering mellan ökat cellantal (hyperplasi) och ökad cellstorlek (hypertrofi). Alla dessa metoder använder dyra fluorescensteknik (mikroskop eller cellsorterare) och, med undantag för CY3-SA-märkning, kräver märkning av hepatocyter med en fluorescerande reporter.
Här beskriver vi i detalj en metod för kvantifiering zebrafisk larv leverområde med hjälp av ljusa fält mikroskopi och bildbehandling programvara3,12,13,14. Detta protokoll möjliggör exakt kvantifiering av området för enskilda lever på plats utan användning av fluorescensmikroskopi. Medan analysera leverstorlek, blindvi bilden identitet för att minska utredare bias och förbättra vetenskaplig stringens15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Camera for dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine (Dumont #5) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J/FIJI</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 9-well round-bottom glass dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for blinding files</td>
			<td>R project</td>
			<td></td>
			<td>R can be downloaded for free: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>200-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very fine (Dumont #55) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy

I flera transgena zebrafisk modeller av hepatocellulärcarcinom (HCC), hepatomegali kan observeras under tidiga larvstadier. Kvantifiera larval leverstorlek i zebrafisk HCC modeller ger ett sätt att snabbt bedöma effekterna av läkemedel och andra manipulationer på en onkogen-relaterade fenotyp. Här visar vi hur man fixar zebrafisklarver, dissekerar vävnaderna kring levern, fotograferar lever med hjälp av ljusfältsmikroskopi, mäter leverområdet och analyserar resultat. Detta protokoll möjliggör snabb, exakt kvantifiering av leverstorlek. Eftersom denna metod innebär att mäta leverområdet, Det kan underskatta skillnader i levervolym, och kompletterande metoder krävs för att skilja mellan förändringar i cellstorlek och förändringar i cellnummer. Den dissektion teknik som beskrivs häri är ett utmärkt verktyg för att visualisera lever, tarm och bukspottkörteln i sina naturliga positioner för otaliga nedströms applikationer inklusive immunofluorescens färgning och in situ hybridisering. Den beskrivna strategin för kvantifiering av larval leverstorlek är tillämplig på många aspekter av leverutveckling och förnyelse.

Transgena zebrafisk uttrycker hepatocyte-specifika aktiverade β-catenin (Tg (fabp10a: pt-β-katt) zebrafisk)3 och icke-transgena kontroll syskon avlivades vid 6 dpf och leverområde kvantifierades med brightfield mikroskopi och bildbehandling programvara. Transgena zebrafiskar har avsevärt ökat leverstorleken (0,0006 cm2) jämfört med deras icke-transgena syskon (0,0004 cm2, p < 0,0001; figur 1).
<p class="jove_...

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy at JoVE.com

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

Här visar vi en metod för att kvantifiera leverstorlek i larv zebrafisk, vilket ger ett sätt att bedöma effekterna av genetiska och farmakologiska manipulationer på levertillväxt och utveckling.

Kvantifiera leverstorlek i Larval Zebrafisk Med Brightfield Mikroskopi

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Denna metod ger ett sätt att kvantifiera leverstorlek i larv zebrafisk. Det möjliggör också bedömning av effekterna av genetisk och farmakologisk manipulation på levertillväxt och utveckling. Denna teknik ger ett snabbt och exakt sätt att visualisera och mäta levern samt tarmen och bukspottkörteln.Förutom att kvantifiera leverns storlek, denna dissekering metod kan vara till hjälp för att förbereda levern, tarmen, och bukspottkörteln för in situ hybridisering eller confocal imaging. Innan du försöker deskinning på experimentella larver, se till att du har tillbringat riklig tid att öva på icke-experimentella prover och har en betydande framgång. Det är viktigt att visualisera korrekt orientering och förflyttning av zebrafisklarver och tång för att avlägsna huden utan att störa omgivande organ.Vid tre till sju dagar efter befruktning, efter avlivning av larver, använd en glaspipett och pipettpump för att samla upp till 15 larver i ett två milliliterrör. Tvätta larver två gånger med en milliliter kall 1X PBS på is. Ta bort så mycket PBS som möjligt med hjälp av en glaspipett och pipettpump och tillsätt en milliliter kall fyra procent PFA i PBS.Inkubera vid fyra grader Celsius åtminstone över natten med mild gungning. Ta bort PFA-plasten från röret med hjälp av en pipett och pipettpump i glas och skölj tre gånger med en milliliter kall PBS. Rock i fem minuter mellan sköljningar.Pipett flera larver i PBS i en brunn av nio-väl rund-botten glasfat. Under ett mikroskop, ta bort huden som omger levern med hjälp av fina tuttvingar för att hålla en larv på ryggen, gripande på vardera sidan av huvudet så försiktigt som möjligt. Använd sedan mycket fina tlys i den andra handen för att ta tag i huden bara överlying hjärtat.Dra ner huden diagonalt mot svansen på fisken i botten av skålen på vänster eller höger sida av fisken. Upprepa för den andra sidan. Fortsätt greppa klaffar av hud och dra ner tills alla av huden och melanoforer överliggande eller nära levern har tagits bort.Om äggula är närvarande i fem till sex dagar efter befruktning larver, lyft äggulan bort i ett stycke genom att hålla fisken med fina tyliks på ryggen och använda mycket fina typpor för att försiktigt prod äggulan. För tre till fyra DPF-larver, håll fisken med fina tång på ryggen och använd de mycket fina tången för att stroke äggulan börjar från den ventrala sidan. Skrapa av äggulan i bitar.Placera de dissekerade larverna i färsk, kall PBS i ett två milliliter rör med hjälp av en glaspipett och pipettpump. För att montera larverna, häll några milliliter av tre procent metylcellulosa på locket på ren, plast Petriskål. Använd en glaspipett och pipettpump för att lägga till larver till metylcellulosa, lägga till så lite PBS med larverna som möjligt.Under en dissekera mikroskop vid låg förstoring, använd fina tlykningar för att orientera fisken så att de lägger på höger sida vänd åt vänster. Bekräfta att fisken som ska fotograferas är perfekt anpassad till ett öga direkt ovanpå det andra ögat. Om fiskens svans är böjd, ta bort svansen genom att nypa den kraftfullt med tlyckor för att ta bort den så att fisken lägger platt.Zooma in till hög förstoring och fokusera på levern, se till att leverns kontur syns tydligt. Tryck på knappen Ta bild för att fästa en bild och spara filen. Upprepa för alla fiskar, se till att förstoringen är densamma för varje bild.Ta en bild av en mikrometer med samma förstoring. För att använda programmet R för att blinda alla leverbilder för att undvika potentiella prövare bias och främja vetenskaplig stringens, byta namn på filer slumpmässigt och skapa en randomiseringsfil som innehåller en lista över de ursprungliga filnamnen och motsvarande blindade filnamn. Öppna randomiserade filer i ordning, med början med fil ett.Välj freehand val verktyget och skissera varje lever. Tryck Control-M för att mäta området för varje lever. För alla lever som inte kan mätas korrekt eftersom de har kvarvarande hud, äggula, är ur fokus, eller inte är intakt, infoga en platshållare mätning.Spara måtten i en textfil. Om du vill avblinda och analysera data öppnar du måttfilen och randomiseringsfilen i ett kalkylprogram. Infoga en ny kolumn i måttfilen och lägg till de ursprungliga filnamnen för de förblindade filerna med randomiseringsfilen.Spara den här filen som filen Oblinda mått. Sortera informationen efter det ursprungliga filnamnet. Uteslut alla levermätningar för vilka bilder inte var tillräckliga.Om det behövs, omvandla mätvärden till önskad skala i kvadratmillimeter. Öppna skalningsfältet i bildbehandlingsprogrammet. Använd verktyget Rak linje för att mäta en millimeter på skalstrecket.Bildbehandlingsprogramvaran mäter sedan i samma enheter som levern, vilket ger en konverteringsfaktor. Använd konverteringsfaktorn för att konvertera mått i filen Oblinda mått. Bestäm medelvärde och standardavvikelse och beräkna P-värden.Vid sex dagar efter befruktning, icke-transgenic zebrafish larver visade naturliga position och form av lever överlydning tarmen. Transgena zebrafiskar har signifikant ökat leverstorleken jämfört med deras icke-transgena syskon. Några exempel på otillräckliga bilder och mikrometer visas här.Larv med hud som täcker levern, larv med äggula som skymmer levern, larv med delar av levern klämd av, och larv med lever ur led och faller av, larv med saknad lever, larv med leverkontur som är svår att identifiera, och larv med felaktig positionering. När du försöker detta förfarande, Det är viktigt att använda små och kontrollerade rörelser för att förhindra skador på levern. Förutom ljusfältsmikroskopi kan vi också använda larver dissekerade på detta sätt, för konfokalmikroskopi, för att visualisera fluorescerande reporterproteiner eller immunfluorescerande färgning, och för in situ-hybridisering.Formaldehyden eller PFA är en irriterande och misstänkt cancerframkallande. Handskar ska användas vid hantering av PFA och koncentrerade lösningar ska hanteras i en kemisk rökhuva.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Live avbildning av medfödda immun och preneoplastiska Cell interaktioner Använda en Inducerbar Gal4 / UAS Expression System i Larvzebrafish Skin

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Fånga Tissue Repair i Zebrafish Larver med Time-lapse Bright stereomikroskopi

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Hepatocyte specifika Ablation i Zebrafish att studera gallan driven leverregenerering

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analys av zebrafisk njure utveckling med Time-lapse avbildning med ett dissektionsmikroskop Utrustad för optisk Sektione

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Använda ljus Sheet fluorescensmikroskopi till bild Zebrafish Eye utveckling

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Dissekering av Larvernas Zebrafish gonadal Tissue

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Histologiska analyser av akut alkoholhaltig leverskada i sebrafisk

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelat super-upplösning och elektronmikroskopi för att lösa Protein lokalisering i zebrafiskar näthinna

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Etablering av Larval zebrafiskar som ett djur-modell för att undersöka Trypanosoma cruzi motilitet I Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...