Name: quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy
Uploaded: 2020-02-02T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy at JoVE.com

Biz Maurine Hobbs ve Merkezi Zebrafish Hayvan Kaynağı (CZAR) Utah Üniversitesi'nde zebrabalığı yetiştiriciliği, laboratuvar alanı ve ekipman bu araştırmanın bölümlerini yürütmek için sağlamak için kabul etmek istiyorum. CZAR genişlemesi kısmen NIH hibe # 1G20OD018369-01 tarafından desteklenir. Biz de Rodney Stewart, Chloe Lim, Lance Graham, Cody James, Garrett Nickum ve Huntsman Kanser Enstitüsü (HCI) Zebrabalığı Tesisi zebra balığı bakımı için teşekkür etmek istiyorum. Biz R programlama ile ilgili yardım için Kenneth Kompass teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma kısmen Huntsman Kanser Vakfı'nın (P30 CA042014'ün Huntsman Kanser Enstitüsü'ne verilen hibe ile birlikte) ve NIH/NCI R01CA2222570 (KJE) hibeleri ile finanse edilmiştir.

Hayvan çalışmaları Utah Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan prosedürler aşağıdaki yürütülmektedir.
1. Larvaların Sabitlenmesi
<ol><li>3-7 gün sonra döllenme (dpf), triain metansülfonat (%0.03) ile ötanazi larvaları ve cam pipet ve pipet pompası kullanarak 2 mL'lik bir tüpte 15 larva toplayın.</li>
	<li>Larvaları 1 mL soğuk (4 °C) 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez buz üzerinde yıkayın. Her yıkama için, c...

<ol>
	<li>Lin, D. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+and+Epigenomic+Heterogeneity+of+Hepatocellular+Carcinoma.">Genomic and Epigenomic Heterogeneity of Hepatocellular Carcinoma.</a> Cancer Research. 77 (9), 2255-2265 (2017).</li><li>Ghouri, Y. A., Mian, I., Rowe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+hepatocellular+carcinoma:+Epidemiology,+etiology,+and+carcinogenesis.">Review of hepatocellular carcinoma: Epidemiology, etiology, and carcinogenesis.</a> Journal of Carcinogenesis. 16, 1 (2017).</li><li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Chemical+Inhibitors+of+&#946;-Catenin-Driven+Liver+Tumorigenesis+in+Zebrafish.">Identification of Chemical Inhibitors of &#946;-Catenin-Driven Liver Tumorigenesis in Zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305 (2015).</li><li>Kalasekar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneous+beta-catenin+activation+is+sufficient+to+cause+hepatocellular+carcinoma+in+zebrafish.">Heterogeneous beta-catenin activation is sufficient to cause hepatocellular carcinoma in zebrafish.</a> Biology Open. 8 (10), (2019).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+level+of+liver-specific+expression+of+oncogenic+Kras(V12)+drives+robust+liver+tumorigenesis+in+transgenic+zebrafish.">A high level of liver-specific expression of oncogenic Kras(V12) drives robust liver tumorigenesis in transgenic zebrafish.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (6), 801-813 (2011).</li><li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+inducible+kras(V12)+transgenic+zebrafish+model+for+liver+tumorigenesis+and+chemical+drug+screening.">An inducible kras(V12) transgenic zebrafish model for liver tumorigenesis and chemical drug screening.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 5 (1), 63-72 (2012).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+liver+tumor+model+with+inducible+Myc+expression+reveals+conserved+Myc+signatures+with+mammalian+liver+tumors.">A transgenic zebrafish liver tumor model with inducible Myc expression reveals conserved Myc signatures with mammalian liver tumors.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (2), 414-423 (2013).</li><li>Cox, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yap+reprograms+glutamine+metabolism+to+increase+nucleotide+biosynthesis+and+enable+liver+growth.">Yap reprograms glutamine metabolism to increase nucleotide biosynthesis and enable liver growth.</a> Nature Cell Biology. 18 (8), 886-896 (2016).</li><li>Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+in+zebrafish+identifies+the+mutants+vps18,+nf2+and+foie+gras+as+models+of+liver+disease.">A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease.</a> Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).</li><li>Huang, X., Zhou, L., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liver+tumor+models+in+transgenic+zebrafish:+an+alternative+in+vivo+approach+to+study+hepatocarcinogenes.">Liver tumor models in transgenic zebrafish: an alternative in vivo approach to study hepatocarcinogenes.</a> Future Oncology. 8 (1), 21-28 (2012).</li><li>Yan, C., Yang, Q., Gong, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-Associated+Neutrophils+and+Macrophages+Promote+Gender+Disparity+in+Hepatocellular+Carcinoma+in+Zebrafish.">Tumor-Associated Neutrophils and Macrophages Promote Gender Disparity in Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish.</a> Cancer Research. 77 (6), 1395-1407 (2017).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529 (2017).</li><li>Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ImageJ+ecosystem:+An+open+platform+for+biomedical+image+analysis.">The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis.</a> Molecular Reproduction and Development. 82 (7-8), 518-529 (2012).</li><li>Landis, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+for+transparent+reporting+to+optimize+the+predictive+value+of+preclinical+research.">A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research.</a> Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).</li><li>Dai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+fat+plus+high+cholesterol+diet+lead+to+hepatic+steatosis+in+zebrafish+larvae:+a+novel+model+for+screening+anti-hepatic+steatosis+drugs.">High fat plus high cholesterol diet lead to hepatic steatosis in zebrafish larvae: a novel model for screening anti-hepatic steatosis drugs.</a> Nutrition &amp; Metabolism. 12, 42 (2015).</li><li>Kim, S. -. H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+model+of+tuberous+sclerosis+complex+reveals+cell-autonomous+and+non-cell-autonomous+functions+of+mutant+tuberin.">Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 4 (2), 255-267 (2011).</li><li>Delous, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox9b+is+a+key+regulator+of+pancreaticobiliary+ductal+system+development.">Sox9b is a key regulator of pancreaticobiliary ductal system development.</a> PLoS Genetics. 8 (6), 1002754 (2012).</li><li>Shin, D., Lee, Y., Poss, K. D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+of+hepatic+competence+by+Fgf+signaling.">Restriction of hepatic competence by Fgf signaling.</a> Development. 138 (7), 1339-1348 (2011).</li><li>Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+basic+helix-loop-helix+transcription+factor,+heart+and+neural+crest+derivatives+expressed+transcript+2,+marks+hepatic+stellate+cells+in+zebrafish:+analysis+of+stellate+cell+entry+into+the+developing+liver.">The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver.</a> Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).</li></ol>

Karaciğer gelişimini, rejenerasyonu ve onkogenezini anlamaya yönelik çalışmalarda karaciğer büyüklüğünün sayısallaştırılması çok önemlidir. Burada açıklanan protokol larva zebra balığında karaciğer büyüklüğü niceliği için nispeten hızlı, kolay ve ucuz bir tekniktir. Protokolün belirli yönlerini uygularken uygun dikkatli olunması, sonuçların doğruluğunun artmasına ve hayal kırıklığının azalmasına yardımcı olabilir.
Larvaların doğru fiksasyon...

Hepatosellüler karsinom (HCC) karaciğerin en sık görülen primer malignitesi1 ve kansere bağlı mortalitenin üçüncü önde gelennedenidir 2. Hepatokarsinogenezin mekanizmalarını daha iyi anlamak ve potansiyel HCC terapötiklerini belirlemek için, biz ve diğerleri β-catenin3,4,Kras(V12)5,6, Myc7, Yap18 gibi onkogenlerin hepatosite özgü ekspresyonu olan transgenik zebra balığı geliştirdik. Bu zebra balıklarında, karaciğer genişlemesi kadar erken olarak not edilir 6 gün sonrası döllenme (dpf), onkogen güdümlü karaciğer büyümesi üzerinde ilaçların ve genetik değişikliklerin etkilerini test etmek için kolay bir platform sağlayan. Larva karaciğer boyutunun doğru ve kesin ölçümü bu manipülasyonların etkilerini belirlemek için gereklidir.
Karaciğer büyüklüğü ve şekli, sabit zebrabalığı larvalarında 9 veya canlı zebrabalığı larvalarında hepatosite özgü floresan muhabirler ve floresan diseksiyon mikroskopisi kullanılarak yarı kantitatif olarak değerlendirilebilir5,6. İkinci yöntem nispeten hızlı, ve hassasiyet eksikliği fotoğraflama ve görüntü işlemeyazılımı7 kullanarak her karaciğer alanı ölçümü ile ele alınabilir 7,10. Ancak, teknik olarak iki boyutlu karaciğer alanı karaciğer boyutunun doğru bir temsili olduğunu bir deney de tüm canlı larvaları eşit konumlandırmak zor olabilir. Karaciğer boyutunu ölçmek için benzer bir teknik larva karaciğer hacmi ölçmek için hafif levha floresan mikroskopi kullanarak içerir8, karaciğer farklı boyutlarda düzgün olmayan genişletildiğinde boyut farklılıkları tespit etmek için daha doğru olabilir. Floresan aktive hücre sıralama (FACS) larva karaciğerlerinde floresan hepatosit ler ve diğer karaciğer hücre tipleri8,11etiketli sayısını saymak için kullanılabilir . Bu yöntemde, larva karaciğerleri havuza alınır ve ayrıştırılır, böylece bireysel karaciğer büyüklüğü ve şekli hakkında bilgi kaybolur. Başka bir karaciğer boyutu belirleme yöntemi ile birlikte, FACS artan hücre numarası (hiperplazi) ve artan hücre büyüklüğü (hipertrofi) arasında ayrım sağlar. Tüm bu yöntemler pahalı floresan teknolojisi (mikroskop veya hücre ayırıcı) kullanır ve CY3-SA etiketleme dışında, bir floresan muhabiri ile hepatosit etiketleme gerektirir.
Burada ayrıntılı olarak parlak alan mikroskobu ve görüntü işleme yazılımı3,12,13,14kullanarak zebra balığı larva karaciğer alanı ölçmek için bir yöntem açıklar. Bu protokol floresan mikroskopisi kullanılmadan bireysel karaciğerlerin yerinde tam olarak sayısallaştırılmasını sağlar. Karaciğer boyutunu analiz ederken, biz araştırmacı önyargı azaltmak ve bilimsel titizlik geliştirmek için görüntü kimliğini kör15.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Camera for dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Leica, for example</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine (Dumont #5) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass pipets</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>Image J/FIJI</td>
			<td></td>
			<td>ImageJ/FIJI can be dowloaded for free: <a href="https://imagej.net/Welcome" target="_blank">https://imagej.net/Welcome</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl cellulose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M0387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Various suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53502-233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri dishes</td>
			<td>USA Scientific Inc</td>
			<td>2906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex 9-well round-bottom glass dish</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89090-482</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software for blinding files</td>
			<td>R project</td>
			<td></td>
			<td>R can be downloaded for free: <a href="https://www.r-project.org/" target="_blank">https://www.r-project.org/</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scientific graphing and statistics software</td>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spreadsheet program</td>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine methanesulfonate (Tricaine-S)</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>200-226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Very fine (Dumont #55) forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying liver size in larval zebrafish using brightfield microscopy

Hepatosellüler karsinom (HCC) çeşitli transgenik zebra balığı modellerinde erken larva evrelerinde hepatomegali görülebilir. Zebrabalığı HCC modellerinde larva karaciğer boyutunun ölçülmesi, ilaçların ve diğer manipülasyonların onkogene bağlı fenotip üzerindeki etkilerini hızla değerlendirmek için bir araç sağlar. Burada zebra balığı larvalarının nasıl düzeltilebildiğini, karaciğeri çevreleyen dokuları nasıl inceleyeceğimi, parlak alan mikroskobu kullanarak karaciğerleri nasıl fotoğraflayabildiğimizi, karaciğer bölgesini nasıl ölçtüğünü ve sonuçları analiz edebileceğimizi gösteriyoruz. Bu protokol karaciğer boyutunun hızlı ve hassas bir şekilde ölçülmesini sağlar. Bu yöntem karaciğer alanının ölçülmesini içerdiğinden, karaciğer hacmindeki farklılıkları hafife alabilir ve hücre büyüklüğündeki değişimler ile hücre sayısındaki değişimleri ayırt etmek için tamamlayıcı metodolojiler gereklidir. Burada açıklanan diseksiyon tekniği, immünoresans boyama ve yerinde hibridizasyon dahil olmak üzere sayısız downstream uygulamaları için doğal konumlarında karaciğer, bağırsak ve pankreas görselleştirmek için mükemmel bir araçtır. Larva karaciğer boyutunu ölçmek için açıklanan strateji karaciğer gelişimi ve rejenerasyon birçok yönü için geçerlidir.

Hepatosite özgü aktif β-catenin(Tg(fabp10a:pt-β-cat) zebrabalığı)3 ve transgenik olmayan kontrol kardeşleri 6 dpf'de ötenazi yemi olan transgenik zebrabalıkları brightfield mikroskopi ve görüntü işleme yazılımı kullanılarak ölçüldü. Transgenik zebra balıkları karaciğer boyutunu (0.0006 cm2)transgenik olmayan kardeşlere göre önemli ölçüde artırmıştır (0.0004 cm2, p < 0.0001; Şekil 1)....

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy at JoVE.com

Quantifying Liver Size in Larval Zebrafish Using Brightfield Microscopy

Burada larva zebra balığında karaciğer boyutunu ölçmek için bir yöntem göstermek, karaciğer büyümesi ve gelişimi üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyonetkilerini değerlendirmek için bir yol sağlar.

Brightfield Mikroskobu Kullanan Larva Zebrabalığında Karaciğer Boyutunun Ölçülmesi

In several transgenic zebrafish models of hepatocellular carcinoma (HCC), hepatomegaly can be observed during early larval stages. Quantifying larval ...

Bu yöntem larva zebra balığında karaciğer boyutunu ölçmek için bir yol sağlar. Ayrıca karaciğer büyümesi ve gelişimi üzerinde genetik ve farmakolojik manipülasyon etkilerinin değerlendirilmesi için izin verir. Bu teknik, karaciğeri, bağırsak ve pankreası görselleştirmek ve ölçmek için hızlı ve hassas bir yol sağlar.Karaciğer boyutunu niteleme ek olarak, Bu diseksiyon yöntemi in situ hibridizasyon veya konfokal görüntüleme için karaciğer, bağırsak ve pankreas hazırlanması için yararlı olabilir. Deneysel larvalar üzerinde deskinning denemeden önce, deneysel olmayan numuneler üzerinde pratik bol zaman geçirdim ve önemli bir başarı oranına sahip emin olun. Zebrabalığı larvalarının ve çerperlerinin uygun yönünü ve hareketini görselleştirmek ve çevreyi rahatsız etmeden cildi çıkarmak için çok önemlidir.Gübreleme den sonra 3-7 gün, ötanazi larvaları sonra, iki mililitrelik bir tüp içinde 15 larva toplamak için bir cam pipet ve pipet pompası kullanın. Larvaları bir mililitre soğuk 1X PBS ile iki kez buz üzerinde yıkayın. Cam pipet ve pipet pompası kullanarak mümkün olduğunca fazla PBS çıkarın ve PBS'de bir mililitre soğuk yüzde dört PFA ekleyin.En azından bir gecede hafif sallanan dört santigrat derecede kuluçkaya yat. Cam pipet ve pipet pompası kullanarak, PFA'yı tüpten çıkarın ve bir mililitre soğuk PBS ile üç kez durulayın. Durulamaların arasında beş dakika kaya.Pipet pbs birkaç larva dokuz iyi yuvarlak alt cam çanak bir kuyuiçine. Bir mikroskop altında, sırtında bir larva tutmak için ince forceps kullanarak karaciğer çevreleyen deri kaldırmak, mümkün olduğunca hafifçe başın her iki tarafında tutarak. Sonra sadece kalp örten deri kapmak için diğer taraftan çok ince forseps kullanın.Balığın sol veya sağ tarafındaki yemeğin altındaki balığın kuyruğuna doğru çapraz olarak deri çekin. Diğer taraf için tekrarlayın. Deri flepleri kapma ve tüm cilt ve melanoforlar üstveya karaciğer yakın kaldırılana kadar aşağı çekerek devam edin.Eğer gübreleme dangazi sonrası beş ila altı gün boyunca sarısı varsa, balığı sırtında ince forsepslerle tutarak ve sarısı nazikçe dürtmek için çok ince forsepsleri kullanarak sarısını tek parça halinde kaldırın. Üç ila dört DPF larvaları için, sırtında ince forseps ile balık tutun ve ventral taraftan başlayarak sarısı inme için çok ince forseps kullanın. Sarısını parçalara ayırın.Bir cam pipet ve pipet pompası kullanarak iki mililitrelik bir tüp içinde taze, soğuk PBS içine diseksiyon larvayerleştirin. Larvaları monte etmek için, temiz, plastik Petri kabının kapağına yüzde üç metilselüloz birkaç mililitre dökün. Methylcellulose larva eklemek için bir cam pipet ve pipet pompası kullanın, mümkün olduğunca larva ile küçük PBS olarak ekleyerek.Düşük büyütme de bir diseksiyon mikroskop altında, onlar sola bakan sağ tarafında yatıyorböylece balık yönlendirmek için ince çömeçler kullanın. Fotoğraflanacak balığın bir gözüyle diğer gözün tam üzerinde mükemmel bir şekilde hizalandığından onaylayın. Balığın kuyruğu bükülürse, balığın düz yatabilmesi için forceps ile zorla çimdikleyerek kuyruğu çıkarın.Yüksek büyütme ve karaciğer odaklanmak yakınlaştırma, karaciğer anahat açıkça görünür olduğundan emin olun. Resmi tutturmak ve dosyayı kaydetmek için Görüntü Kaydet düğmesine basın. Büyütme her resim için aynı olduğundan emin olmak, tüm balıklar için tekrarlayın.Aynı büyütmeyi kullanarak bir mikrometrenin resmini çek. Potansiyel araştırmacı önyargı önlemek ve bilimsel titizlik teşvik etmek için tüm karaciğer resimleri kör programı R kullanmak için, dosyaları rasgele yeniden adlandırmak ve orijinal dosya adları ve karşılık gelen kör dosya adlarının listesini içeren bir randomizasyon dosyası oluşturmak. Birinci dosyadan başlayarak rasgele dosyaları sırayla açın.Freehand Seçimleri aracını seçin ve her karaciğeri anahat. Her karaciğer alanını ölçmek için Control-M tuşuna basın. Onlar artık deri, sarısı, odak dışında, çünkü doğru ölçülemez herhangi bir karaciğer için, ya da bozulmamış, bir yer tutucu ölçümü ekleyin.Ölçümleri bir metin dosyasına kaydedin. Verileri kör süzmek ve çözümlemek için, bir elektronik tablo programında ölçümler dosyasını ve randomizasyon dosyasını açın. Ölçümler dosyasına yeni bir sütun ekleyin ve Randomization dosyasını kullanarak kör dosyaların özgün dosya adlarını ekleyin.Bu dosyayı Körlenmemiş Ölçümler dosyası olarak kaydedin. Verileri özgün dosya adına göre sıralayın. Resimlerin yeterli olmadığı karaciğer ölçümleri hariç.Gerekirse, ölçüm değerlerini milimetre kare cinsinden istenilen ölçeğe dönüştürün. Görüntü işleme yazılımındaki Ölçek çubuğunu açın. Ölçek çubuğunda bir milimetreyi ölçmek için Düz Çizgi aracını kullanın.Görüntü işleme yazılımı daha sonra karaciğerlerle aynı ünitelerde ölçüler ve bir dönüşüm faktörü verir. Kör olmayan ölçümler dosyasındaki ölçümleri dönüştürmek için dönüşüm faktörlerini kullanın. Ortalama ve standart sapmayı belirleyin ve P değerlerini hesaplayın.Altı gün sonra döllenme, non-transgenik zebra balığı larvaları doğal pozisyon ve karaciğer bağırsak örten şekli gösterdi. Transgenik zebra balıkları, transgenik olmayan kardeşlerine göre karaciğer boyutunu önemli ölçüde artırmıştır. Yetersiz görüntü ve mikrometre bazı örnekler burada gösterilmiştir.Karaciğeri kaplayan deri ile larva, karaciğeri gizleyen larva, karaciğerparçaları koparılmış larva, karaciğer yerinden çıkmış ve düşen larva, karaciğeri eksik olan larva, tespit edilmesi zor karaciğer anahatlı larva ve yanlış konumlandırma ile larva. Bu işlemi denerken, karaciğer hasarı önlemek için küçük ve kontrollü hareketleri kullanmak önemlidir. Parlak alan mikroskobuna ek olarak, bu şekilde incelenmiş larvaları da kullanabiliriz, konfokal mikroskopi için, floresan muhabir proteinleri veya immün-floresan boyamayı görselleştirmek için, ve in situ hibridizasyon için.Formaldehit veya PFA tahriş edici ve şüpheli bir karsinojendir. PfA kullanılırken eldiven giyilmeli ve konsantre çözeltiler kimyasal bir duman kaputunda kullanılmalıdır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Live Imaging of Innate Immune and Preneoplastic Cell Interactions Using an Inducible Gal4/UAS Expression System in Larval Zebrafish Skin

Larva Zebra balığı Skin bir İndüklenebilir Gal4 / UAS İfade Sisteminin Kullanılması doğuştan gelen bağışıklık ve preneoplastik Hücre Etkileşimleri Canlı Görüntüleme

Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS ...

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Biliyer odaklı Karaciğer Rejenerasyon Eğitim Zebra balığı hepatosite özgü Ablasyon

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

diseksiyon mikroskobu kullanılarak Time-lapse Görüntüleme ile Zebra balığı Böbrek Kalkınma Analizi Optik Kesit için donatılmış

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Görüntü Zebra balığı Göz Geliştirme Işık Sac floresan mikroskobu kullanarak

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Dissection of Larval Zebrafish Gonadal Tissue

Larva Zebra balığı Gonadal Doku Diseksiyon

Although wild zebrafish possess a ZZ/ZW sex-determination system, domesticated zebrafish have lost the sex chromosome. They utilize a polygenic sex ...

Histological Analyses of Acute Alcoholic Liver Injury in Zebrafish

Zebra balığıda Akut Alkollü Karaciğer Hasarının Histolojik Analizi

Alcoholic Liver Disease (ALD) refers to damage to the liver due to acute or chronic alcohol abuse. It is among the leading causes of alcohol-related ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Kuruluş, larva Zebra balığı bir hayvan modeli araştırmak Trypanosoma cruzi hareketliliği In Vivo olarak

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...