Name: quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach
Uploaded: 2019-12-14T14:00:00
Duration: 12 min 32 s
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Wir danken Gor Margaryan für die kreative Unterstützung und technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch das ZMB Young Scientist Grant 2017/2018 (an TW verliehen) und das DFG-Schwerpunktprogramm 1819 (Grant-Nr. DA1202/2-1 an TD verliehen).

1. Aufbau eines Modellplasmids mit einem Antibiotikaresistenzgen
HINWEIS: Der Stamm Escherichia coli K-12 MG1655 wurde als Modellorganismus in allen Experimenten verwendet (DSM Nr. 18039, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, DSMZ). Der Stamm E. coli DH5-17 wurde während des Plasmidbaus verwendet.
<ol><li>PCR verstärken das Plasmid-Rückgrat Ihrer Wahl und verstärken das Resistenzgen einschließlich der Promotorregion durch PCR (Abbildung 1).<ol>
<li>PCR verstärken das Plasmid-Rückgrat mit einer Hochtreue-Polymerase und den Oligonukleotiden pBBR1_for (5'-GCGGCCACCGGCTCT-3') und pBBR1_rev (5'-TACCGGCGCGGCAGCGTGACCC-3') auf der Plasmidschablone pLC (GenBank acc. MH238456)18.</li>
		<li>PCR verstärken das Resistenzgen nptII einschließlich des nativen Tn5-Promotors 19 mit einer Hochtreuepolymerase und Oligonukleotiden nptII_gib_for (5'-GCGCCGGTAGATCTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTGCGCGCGCGCGCCCGCGCA-3') und nptII_gib_rev (5'-CGGTGGCCGCCAAAAAGGCCTCTCA Das nptII-Gen kodiert für eine Neomycin-Phosphotransferase und verleiht eine Resistenz gegen Kanamycin. HINWEIS: Entwerfen Sie die Primer für das Resistenzgen mit ca. 20 bp komplementärer Sequenz zum Plasmid-Rückgrat, mit dem es verschmolzen wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinigen Sie beide PCR-Fragmente mit einem Kit Ihrer Wahl.</li>
	<li>Verbinden Sie das gereinigte Antibiotikaresistenzgen PCR-Produkt (einschließlich seiner Promotorregion) mit dem gereinigten Plasmid-Rückgrat und verschmelzen Sie die homologen Regionen mit der isothermen Baugruppe20, bei 50 °C für 60 min.</li>
	<li>Elektropolieren Sie das geschmolzene Produkt in den Stamm E. coli DH5.<ol>
<li>Führen Sie 2 l des Produkts von Schritt 1,3 in 40 l elektrokompetente Zellen in 2 mm Küvetten bei 4 °C und 2,5 kV ein. Resuspend Zellen in 1 ml Lysogeny Brühe (LB) Medium.</li>
		<li>Übertragen Sie das Gesamtvolumen auf ein Mikrofugenrohr und inkubieren Sie 1 h bei 37 °C Schütteln bei 250 U/min in einem Orbitalshaker, um die Expression des Widerstandsmarkers auf dem Plasmid zu ermöglichen.</li>
		<li>Platte 100 l der Zellen auf LB-Agarplatten, die das entsprechende Antibiotikum (Kanamycin 25 g/ml) enthalten, um für das Antibiotikumresistenzgen auszuwählen und somit für Plasmid tragende Zellen auszuwählen. Drehen Sie den Rest, entfernen Sie den Überstand, setzen Sie die Zellen in 100 l LB und Platte auf einer selektiven Agarplatte. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um Klone zu verifizieren, extrahieren Sie die konstruierten Plasmide mittels alkalischer Lyse mit einem kommerziellen Mini-Prep-Kit.<ol>
<li>Ernte 5 ml der stationären Nachtkultur durch Zentrifugieren bei 12.000 x g bei Raumtemperatur. Setzen Sie die Zellen in resuspension Lösung, dann lysieren und neutralisieren die Zelllösung. Zentrifuge für 5 min bei 12.000 x g.</li>
		<li>Übertragen Sie den Überstand auf die im Kit vorgesehene DNA-Bindungssäule und waschen Sie die Säule zweimal mit 500 L Waschlösungzentrifugieren 2x vor der Elution der Säulenmembran mit Elutionspuffer.</li>
		<li>Führen Sie die Sanger-Sequenzierung des Plasmids durch, um zu bestätigen, dass die Sequenz korrekt ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald die Plasmidgültigkeit überprüft ist, elektroporate das Plasmid (jetzt pCON) in den Stamm E. coli MG1655 wie oben beschrieben. Dies ergibt Stamm E. coli MG1655 pCON.</li>
</ol>2. Überwachung von Plasmid-tragenden Bakterien unter verschiedenen Bedingungen im Laufe der Zeit
HINWEIS: Das Evolutionsexperiment wird mit Plasmid tragenden Stämmen unter nicht selektiven Bedingungen (LB-Medien) in zwei Temperaturen (37 °C und 20 °C) und drei Populationsengpassgrößen durchgeführt. Das experimentelle Design wird verwendet, um Plasmid Persistenz unter verschiedenen Bedingungen zu studieren.
<ol><li>Entwurf eines Evolutionsexperiments zur Verfolgung der Plasmidhäufigkeit im Laufe der Zeit (Abbildung 2)<ol>
<li>Den konstruierten Plasmid tragenden Stamm (E. coli MG1655 pCON) auf LB-Agarplatten, ergänzt durch Antibiotika (Kanamycin 25 g/ml) und über Nacht bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Bereiten Sie 96 Tiefbrunnenplatten mit 1 ml LB Medium in jedem Brunnen vor. Als bakterielle Vorfahren, wählen Sie acht zufällig isolierte Kolonien aus der Agarplatte in unabhängigen Brunnen. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C und 450 Umdrehungen pro Minute auf einem Plattenshaker für 24 h. Bereiten Sie einen gefrorenen Glycerinbestand der Angestammten klone vor.</li>
		<li>Am nächsten Tag übertragen die acht Replizierenpopulationen in neue Tiefbrunnenplatten nach dem experimentellen Design (Abbildung 2). Die Kulturen werden 1:100 (großer Engpass, L), 1:1.000 (mittlerer Engpass, M) oder 1:10.000 (kleiner Engpass, S) in einem Gesamtvolumen von 1 ml LB unter Verwendung von PBS zur Verdünnung verdünnt. Die verdünnten Kulturen werden bei 37 °C und 20 °C inkubiert. HINWEIS: Es ist sehr wichtig, die Kreuzkontamination in der 96-Tiefen-Well-Platte zu kontrollieren. Verwenden Sie daher ein Schachbrettplattendesign, indem Sie geimpfte Brunnen mit einem bakteriellen LB-Medium interkalieren. Verwenden Sie dieses Muster während des gesamten Evolutionsexperiments.</li>
		<li>Die bei 37 °C inkubierten Kulturen werden alle 12 stunden übertragen, während Kulturen bei 20 °C alle 24 h übertragen werden. HINWEIS: Bei jedem Transferereignis wird die Flaschenhalsgrößenbehandlung angewendet und die serielle Übertragung wird über insgesamt 98 Übertragungen wiederholt. Die Anzahl der Übertragungen hängt vom experimentellen Design der Leser ab.</li>
		<li>Bereiten Sie einen gefrorenen Glyzerinbestand aller Populationen regelmäßig, 2x pro Woche.</li>
	</ol></li>
	<li>Überwachung der Plasmidhäufigkeit durch Nachahmung (Abbildung 3) HINWEIS: Während des Evolutionsexperiments wird die Häufigkeit von Plasmid tragenden Zellen in der Population anhand des Anteils der Wirte geschätzt. Das Replikatprotokoll ist in Abbildung 3dargestellt.<ol>
<li>Um die Plasmidhäufigkeit in der Population während des Evolutionsexperiments zu bestimmen, werden stationäre Kulturen seriell verdünnt und auf nicht selektiven LB-Agarplatten plattiert. Passen Sie die Verdünnung nach einem Ertrag von 250-500 Kolonien pro Platte an. HINWEIS: Bereiten Sie dicke LB Agarplatten vor der Beschichtung (ca. 30 ml Agar).</li>
		<li>Die plattierten Populationen werden für das Wachstum über Nacht entsprechend ihrer Wachstumstemperatur im Experiment inkubiert. HINWEIS: Die Kolonien müssen klein sein, also <24 h bei 37 °C brüten.</li>
		<li>Zählen Sie nach dem Wachstum über Nacht alle Kolonien mit einer manuellen oder automatisierten Koloniezählstation und berechnen Sie die Gesamtgröße der bakterienpopulation in den Kulturen. HINWEIS: Kolonien am Rand der Agarplatte sollten nicht in die Gesamtzahl der bakteriellen Zellen einbezogen werden.</li>
		<li>Sterilisieren Sie quadratische Stücke (ca. 20 x 20 cm) aus Baumwollsamt durch Autoklavieren. HINWEIS: Das Samttuch muss 100% Baumwolle sein, um autoklavierbar zu sein. Es ist wichtig, das Tuch nach der Sterilisation zu trocknen.</li>
		<li>Nach der Sterilisation des Samttuchs das Tuch auf einen runden Block legen und mit einem Metallring fixieren. Es ist entscheidend, Falten zu vermeiden. Legen Sie den Teller mit den gewachsenen Kolonien (Agar nach unten) vorsichtig auf die feste Samttuchoberfläche. Stellen Sie sicher, dass alle Kolonien die Samtoberfläche berühren, indem Sie vorsichtig auf die Petrischale in einer kreisförmigen Weise tippen.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die LB-Agarplatte und legen Sie eine selektive Platte, die mit Antibiotika (Kanamycin 25 g/ml) ergänzt wird, auf das Samttuch. Stellen Sie sicher, dass der Teller den ganzen Samt berührt, indem Sie sorgfältig auf die Petrischale tippen, wie zuvor beschrieben. Entfernen Sie anschließend die Platte. Lassen Sie die Platten bei Raumtemperatur für das Wachstum über Nacht.</li>
		<li>Bewerten Sie am nächsten Tag sowohl die LB-Agarplatte als auch die selektive Platte. Kolonien, die auf den selektiven Medien wachsen, werden als Plasmidwirte gezählt (d.h. antibiotikaresistent), während koloniefreie Flecken Kolonien sind, die plasmidfrei waren und daher nicht resistent gegen das Antibiotikum sind (d.h. das Plasmid verloren haben). Dies geschieht, indem die Platten übereinander platziert und das Wachstum verglichen (d. h. fehlende Kolonien markieren) und die Kolonienummer auf beiden Platten gezählt wird. Dies ergibt die Anzahl der Zellen, die das Plasmid während des Evolutionsexperiments verloren haben.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang während des gesamten Evolutionsexperiments regelmäßig (z. B. alle 14 Übertragungen).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Visualisierung von Plasmidmultimeren mittels Gelelektrophorese
HINWEIS: Die Plasmidextraktion von Plasmaplasmiden mit geringer Kopie führt oft zu einer Kontamination mit der chromosomalen IT des Wirts, die vor der Visualisierung enzymatisch verdaut werden muss.
<ol><li>Extrahieren Sie Plasmid-DNA aus einer 5 ml stationären Nachtzellkultur mit alkalischer Lyse, wie in Schritt 1.5 beschrieben.</li>
	<li>Anschließend behandeln Sie die extrahierte Plasmid-DNA mit einer ATP-abhängigen DNase, die nur chromosomale DNA schneidet, um die chromosomale DNA-Kontamination zu entfernen (siehe Tabelle der Materialien). Inkubieren Sie bei 37 °C für 30 min. Danach reinigen Sie die DNA mit einem Kit Ihrer Wahl.</li>
	<li>Um offene Kreismoleküle aller Plasmidkonatationen (Monomere oder Multimer) zu erzeugen, inkubieren Sie die Plasmid-DNA-Proben mit einem Nicking-Enzym (Nb.BsrDI) und inkubieren Sie 30 min bei 65 °C.</li>
	<li>Verwenden Sie parallel dazu, lineare Plasmidmoleküle zu erzeugen (d. h. für den Plasmagrößenvergleich), ein Restriktionsenzym Ihrer Wahl (z. B. HindIII), das das Plasmid einmal spaltet. HINWEIS: Dies führt zu linearen DNA-Plasmidmonomeren. Open-Circle-Moleküle wandern nicht linear.</li>
	<li>Um die Plasmidgröße und -konformation zu visualisieren, elektrophorese die geknickten und linearen Plasmid-DNA-Proben für 120 min bei 4,3 V/cm in einem 1% (w/v) Agarose-Gel und einem 1-ZOLL-TAE-Puffer. Die Proben sind mit Midori grün gefärbt und das Gel wird auf einem Gel-Bildgebungssystem visualisiert (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie eine 1 kbp Leiter.</li>
</ol>

<ol>
	<li>San Millan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+plasmid-mediated+antibiotic+resistance+in+the+clinical+context.">Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context.</a> Trends in Microbiology. 26 (12), 978-985 (2018).</li><li>Bruto, M., James, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+crassostreae,+a+benign+oyster+colonizer+turned+into+a+pathogen+after+plasmid+acquisition.">Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition.</a> The ISME Journal. 11 (4), 1043-1052 (2017).</li><li>von Wintersdorff, C. J. 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Die Autoren haben nichts zu verraten.

In diesem Protokoll stellen wir einen Ansatz vor, der Techniken in der Molekularbiologie, experimentelleevolution und DNA-Visualisierung kombiniert, um die Rolle der Plasmid-Evolution für die Persistenz von Antibiotikaresistenzen in Bakterien zu untersuchen. Obwohl der vorgestellte Ansatz Methoden aus verschiedenen Forschungsbereichen kombiniert, sind alle angewandten Techniken einfach und können in einem Standardlabor für Mikrobiologie durchgeführt werden.
Zu den wichtigsten Schritten des Protokolls gehört die Konstruktion des Modellsystemstamms, der die genetische Validierung des Plasmid tragenden Genotyps umfasst. Bemerkenswert ist, dass viele Plasmide auf natürliche Weise Antibiotikaresistenzgene kodieren. So kann der Leser Schritt 1 des Protokolls weglassen und direkt mit Schritt 2 fortfahren. Als nächstes sollten die Evolutionsexperimente ein zufälliges Design von Replizieren von Populationen enthalten, damit die Ergebnisse nicht durch die Position der Repliziertenpopulationen in der Tiefbrunnenplatte verzerrt werden. Darüber hinaus ist es besonders wichtig, die seriellen Übertragungs- und Verdünnungsschritte im Evolutionsexperiment sorgfältig durchzuführen, da eine Kontamination die Ergebnisse verfälschen würde. Schließlich sollte die Nachbildung mit großer Sorgfalt durchgeführt werden. Große Koloniegröße kann ein Problem sein, aber es kann vermieden werden, indem die Platten für weniger als 24 h inkubiert werden. In ähnlicher Weise kann die Anzahl der Kolonien auf einer Platte die Replikationsergebnisse verzerrt. Daher müssen Populationen vor der Beschichtung und Replikation verdünnt werden.
Einer der größten Vorteile unseres Ansatzes ist, dass es ohne schweres Gerät leicht reproduziert werden kann. Darüber hinaus besteht ein weiterer Vorteil der Nachbildung von Markergenen darin, dass nur lebende Zellen ausgewertet werden, im Gegensatz zur Durchflusszytometrie oder qPCR, in der abgestorbene Zellen als lebendig bewertet werden können. So führt die Nachbildung der Beschichtung zu einer geringeren Verzerrung bei der Zählung von Plasmid tragenden Zellen. Eine Einschränkung der Replikbeschichtung kann jedoch die Grundgesamtheitsgröße (d. h. die Zellennummer) sein, die in einem Versuchslauf ausgewertet werden kann.
Mit unserem Ansatz haben wir vor kurzem gezeigt, dass die Evolution der Plasmidstabilität die Persistenz von Antibiotikaresistenzgenen in Bakterien potenziert. So entwickelten wir einen Ansatz als Werkzeug, um Plasmid-vermittelte Resistenz Persistenz zu folgen, die von hoher Bedeutung ist, um Resistenzen im Laufe der Zeit zu folgen, vor allem unter Bedingungen ohne das Vorhandensein von Antibiotika.

Plasmide sind kreisförmige, sich selbst replizierende genetische Elemente, die in Prokaryoten allgegenwärtig sind. Sie sind Erreger des lateralen Gentransfers, da sie Merkmale zwischen mikrobiellen Populationen übertragen können und daher als eine wichtige Rolle in der mikrobiellen Evolution angesehen werden. Plasmide sind Treiber einer schnellen Anpassung an wachstumsbegrenzende Bedingungen über einen kurzen Zeit (z. B. in Gegenwart von Antibiotika oder Pestiziden1) und sind verantwortlich für den langfristigen Übergang zu anderen Lebensstilmodi (z. B. Entstehung von Pathogenität2). Die auffälligsten Beispiele für den Einfluss von Plasmiden auf den Transfer von Genen sind in Ökosystemen dokumentiert, die schwankenden Antibiotikaspiegeln ausgesetzt sind, wie z. B. in medizinischen Kliniken oder in Industriebetrieben3. Aufgrund der starken positiven Selektion kodieren viele Plasmide für antimikrobielle Resistenzgene und werden oft gefunden, um ihrem bakteriellen Wirt Multiresistenz zu verleihen. Plasmide ermöglichen die Migration zwischen Populationen oder Bakterienarten, was zu einer schnellen Ausbreitung mehrerer antimikrobiellen Resistenzen führt. Unter nicht-selektiven Bedingungen sind Plasmide für die Zelle nicht wesentlich und werden oft sogar als parasitäre Elemente bezeichnet. Dennoch sind Plasmide in der Natur allgegenwärtig und ihre Evolution ist stark mit der von bakteriellen Chromosomen verflochten. Plasmid Persistenz in natürlichen Umgebungen (fluktuierend und nicht selektiv) bleibt schlecht verstanden, aber es ist von hoher Bedeutung für unser Verständnis der Persistenz von Antibiotikaresistenz-Genen in der Natur.
Experimentelle Evolution ist ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von mikrobiellen Populationen4. Die experimentelle Evolution zeigte, dass die Auferlegung einer starken Selektion für die Plasmidpflege zu einer kompensatorischen (d. h. adaptiven) Evolution des Plasmid- oder Wirtschromosoms führt, die die Kosten für die Plasmid-Fitness senkt und wiederum die Plasmid-Fülle (d. h. Plasmidpersistenz)5,6,7erleichtert. So kann nach der Plasmid-Wirt-Interaktion im Laufe der Zeit wichtige Anpassungsmechanismen beider Elemente aufdecken. Darüber hinaus ermöglicht die experimentelle Evolution, die Fülle von Plasmid tragenden Zellen im Laufe der Zeit unter verschiedenen Bedingungen zu quantifizieren8,9,10.
Die Plasmidpersistenz in Evolutionsexperimenten kann durch verschiedene Strategien überwacht werden, einschließlich der Durchflusszytometrie durch fluoreszierende aktivierte Zellsortierung (FACS)11, quantitative PCR (qPCR)11, oder in kultivierungsbasierten Methoden. Die Durchflusszytometrie erfordert eine FACS-Maschine und die Einführung eines nachweisbaren (fluoreszierenden) Markergens, wie z. B. des grünen Fluoreszenzproteins (GFP), auf dem Plasmid. Die GFP-Expression kann jedoch mehrere zelluläre Eigenschaften verändern und darüber hinaus die Plasmidposition in der Zelle12beeinflussen, was wiederum die Plasmidvererbung während der Zellteilung beeinflussen kann. Ein qPCR-Ansatz zur Messung der Plasmid-Fülle kann durch die Plasmid-Kopierzahl stark verzerrt sein, die entlang der bakteriellen Wachstumsphase und im Laufe der Zeit stark variieren kann13. Schließlich erfordert ein kulturbasierter und beschichtungsbasierter Ansatz die Einführung eines wählbaren Markergens. Dies kann ein Antibiotikaresistenzgen sein, das oft auf natürlichen Plasmiden kodiert wird; daher ist keine genetische Manipulation erforderlich. Auf Antibiotikaresistenzen kann ein traditioneller Nachahmungsansatz folgen. Um die natürliche Plasmiddynamik zu untersuchen, eignet sich die Nachbildung der Beschichtung daher gut, um die plasmidcodierte Antibiotika-Resisitance14zu überwachen.
Zur Visualisierung von Plasmidmolekülen (z. B. zur Bewertung der Plasmidgröße) können mehrere Methoden angewendet werden. Ganze Plasmide können mit einem PCR-basierten Ansatz verstärkt werden. Dies erfordert jedoch das Design spezifischer Primer, was während eines Evolutionsexperiments eine Herausforderung sein kann, da sich die Plasmidsequenz im Laufe der Zeit ändern kann. Darüber hinaus ist es aufgrund mehrerer Bindungsstellen für die PCR-Primer schwierig, Plasmidmultimere in einem PCR-basierten Ansatz zu verstärken. Multimeric Plasmidmoleküle können nach der Plasmidreplikationsbeendigung oder durch Rekombination von Plasmidmolekülen auftreten und sind meist von Kopf bis Schwanz15orientiert. Ein anderer Ansatz der Plasmid-Visualisierung kombiniert die enzymatische Verdauung von Plasmidmolekülen durch DNA-Endonukleasen, die einen Plasmid-DNA-Strang entweder spalten oder nicken, mit der Analyse der Agarose-Gel-Elektrophorese. Das gleiche Plasmid unterschiedlicher Größe (z. B. Monomere vs. Multimer) führt zu unterschiedlichen Gelmobilitäten, die bei der Visualisierung der Plasmidmoleküle beobachtet werden können. Dieser Ansatz ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung verschiedener Plasmidkonatationen (d. h. Multimerisierungszustände). Die Plasmidkonformation kann als Indikator für die Plasmidstabilität verwendet werden, da Plasmidmultimere häufig während der Zellteilung verloren gehen16.
In einer kürzlich enden möchteten Arbeit folgten wir der Plasmidpersistenz unter Bedingungen, die nicht selektiv für die Häufigkeit von Plasmiden waren (d.h. ohne Antibiotikaauswahl). Wir verglichen die Plasmidpersistenz bei zwei verschiedenen Temperaturen (20 °C und 37 °C) und drei Populationsgrößen (d. h. Verdünnungsraten). Die Anwendung verschiedener Verdünnungsraten oder Bevölkerungsengpässe ermöglicht die Untersuchung des Einflusses der Populationsgröße auf die bakterielle und Plasmidentwicklung. Basierend auf unseren Ergebnissen schlagen wir vor, dass Plasmide neutral gegenüber ihrem bakteriellen Wirt sein können und Stabilität ohne Selektionsdruck entwickeln können8. Die entwickelte Plasmidstabilität wird durch die Reduktion der Plasmid-Multimerbildung8verliehen.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Quantifizierung der Plasmidpersistenz und zur Untersuchung der Plasmidentwicklung im Hinblick auf die Aufrechterhaltung von Antibiotikaresistenzgenen vor. Die Methode hat mehrere Schritte, einschließlich der Einführung eines Antibiotikaresistenzgens in ein Modellplasmid (das bei Verwendung eines natürlichen Resistenzplasmids weggelassen werden kann), gefolgt von der Verwendung experimenteller Evolution, um das Potenzial des Plasmids zu bewerten, unter nicht selektiven Bedingungen bei der Bestimmung der Plasmid-Frequenzdynamik im Laufe der Zeit unter Verwendung der Nachareplikundung und der Analyse des Plasmidgenoms durch Visualisierung. Das hier beschriebene Protokoll wurde entwickelt, um die Evolution und Persistenz von Plasmiden zu untersuchen, aber es kann auch angewendet werden, um die Evolution von Chromosomenresistenzgenen (oder anderen Markergenen) im Laufe der Zeit zu verfolgen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EN07.1</td>
			<td>2 ml, square</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates (cryo)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1702-8400</td>
			<td>Micro-Dilution Tube System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony counter</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SC6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton velvet</td>
			<td>drapery shop</td>
			<td></td>
			<td>100 % cotton required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652089</td>
			<td>0.1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Gel Extraction kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0832</td>
			<td>PCR fragment clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50125852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (plate shaker)</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaker)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052, 3125000028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Capp</td>
			<td>ME8-1250R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Eurofines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F533S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmidSafe enzyme</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>10059400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica block &#38; metal ring</td>
			<td>VWR</td>
			<td>601-3401</td>
			<td>PVC cylinder 69 mm; ring 102cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resctriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach

Plasmide spielen eine wichtige Rolle in der mikrobiellen Ökologie und Evolution als Vehikel des lateralen Gentransfers und Reservoirs von Zubehörgenfunktionen in mikrobiellen Populationen. Dies ist insbesondere in sich schnell verändernden Umgebungen wie schwankenden Antibiotika-Exposition der Fall. Kürzlich haben wir gezeigt, dass Plasmide Antibiotikaresistenzgene in Escherichia coli ohne positive Selektion für die Plasmidpräsenz aufrechterhalten. Hier beschreiben wir ein experimentelles System, das es erlaubt, sowohl dem Plasmidgenotyp als auch dem Phänotyp in Langzeit-Evolutionsexperimenten zu folgen. Wir verwenden molekulare Techniken, um ein Modellplasmid zu entwerfen, das anschließend in einen experimentellen Evolutionsbatch-Systemansatz in einem E. coli-Wirt eingeführt wird. Wir folgen der Plasmidhäufigkeit im Laufe der Zeit, indem wir die Nachbildung der E. coli-Populationen anwenden und gleichzeitig die Persistenz der Antibiotikaresistenz quantifizieren. Darüber hinaus überwachen wir die Konformation von Plasmiden in Wirtszellen, indem wir das Ausmaß der Plasmid-Multimerbildung durch Plasmidnicking und Agarose-Gel-Elektrophorese analysieren. Ein solcher Ansatz ermöglicht es uns, nicht nur die Genomgröße sich entwickelnder Plasmide zu visualisieren, sondern auch deren topologische Konformation - ein Faktor, der für die Plasmidvererbung sehr wichtig ist. Unser System kombiniert molekulare Strategien mit traditionellen mikrobiologischen Ansätzen und bietet eine Einrichtung, um Plasmide in Bakterienpopulationen über einen langen Zeitraum zu verfolgen. Der vorgestellte Ansatz kann in Zukunft angewendet werden, um eine breite Palette mobiler genetischer Elemente zu untersuchen.

Hier stellen wir einen Ansatz zur Untersuchung der Plasmidentwicklung vor, indem wir die Plasmidpersistenz in einer Population quantifizieren. Zunächst zeigen wir, wie man das Plasmid mit dem E. coli-Stamm MG1655 pCON baut, das anschließend in ein Evolutionsexperiment eingeführt wird. Zweitens stellen wir eine einfache Methode vor, um der Plasmid-Fülle in den sich entwickelnden Bakterienpopulationen zu folgen. Schließlich zeigen wir, wie man Plasmidmolekülgröße und Konformation visualisiert.
In unserer vorherigen Arbeit8 mit dem vorgestellten Ansatz führten wir ein Evolutionsexperiment nach der Persistenz von Antibiotikaresistenzplasmiden in E. coli in Abwesenheit von Antibiotika (Abbildung 4). Unsere repräsentativen Ergebnisse zeigen die Entwicklung der Populationen bei 37 °C und eine Verdünnungsrate von 10-4. Nach der Fülle von Plasmid tragenden Zellen beobachteten wir eine Abnahme der Frequenz plasmidtragenden Wirtszellen im Laufe der Zeit (Abbildung 4). Unser Ansatz ermöglichte es uns zu entdecken, dass der Plasmidverlust das Ergebnis der kondensierten Plasmid-Genomarchitektur war, die zu Plasmidinstabilität führte, die durch Konflikte verursacht wurde, die durch die Transkription des Resistenzgens und die Replikation des Plasmids selbst verursacht wurden. Die Visualisierung der Plasmidmoleküle ermöglichte es uns zu entdecken, dass diese Konflikte zu einer instabilen Plasmidkonformation führten (d. h. Plasmid-Multimerbildung, Abbildung 5). Nichtsdestotrotz beobachteten wir eine Entwicklung der Plasmidstabilität ohne die Exposition gegenüber Antibiotika (Abbildung 4). Die entwickelte Stabilität wurde durch eine plasmidintrinische Duplizierung verliehen, die die Transkriptionsreplikationskonflikte beseitigte und zur Bildung von stabil vererbten Plasmiden führte. Unsere Ergebnisse zeigen somit die Bedeutung von Rekombination und Genomverstärkung in der adaptiven Evolution genetischer Elemente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig1.jpg"> Abbildung 1: Plasmid-Design von pCON. Schematische Darstellung der Klonstrategie, die zum Aufbau des Plasmids pCON verwendet wird. Das Plasmid-Rückgrat (pBBR1) und das Antibiotikaresistenzgen (nptII) werden PCR verstärkt und durch isotherme Fusion20verschmolzen. Daraus ergeben sich das Plasmid pCON und der Stamm MG1655 pCON. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig2.jpg"> Abbildung 2: Entwurf des Langzeitentwicklungsexperiments. Schematische Darstellung des seriellen Übertragungsexperiments. Die Plasmid tragenden (pCON) Populationen werden auf selektiven Medien plattiert. Ahnenkolonien werden zufällig aus der Platte ausgewählt und in ein serielles Transfersystem eingeführt. Die Übertragungen werden mit drei verschiedenen Verdünnungsansätzen durchgeführt, um Bevölkerungsengpässe unterschiedlicher Größe zu simulieren. Die Verdünnungen werden seriell wiederholt. Das Experiment wird in zwei Temperaturregimen durchgeführt. Die Plasmid-Host-Frequenz wird entlang des Experiments mittels Nachahmung gemessen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig3.jpg"> Abbildung 3: Replikatbeschichtung. Schematische Darstellung der Schritte, die bei der Nachahmung von Bakterienpopulationen verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig4.jpg"> Abbildung 4: Repräsentative pCON-Frequenz im Zeitverlauf. pCON Persistenz wird als Anteil der Hosts (repräsentative Replizienpopulationen) während des Evolutionsexperiments dargestellt. Bei 98 Übertragungen entwickelten sich pCON-Plasmidpopulationen unter nichtselektiven Bedingungen mit einem Verdünnungsfaktor von 10-4. Alle Repliken, die das Plasmid pCON tragen, verringerten sich in der Population. Danach wurden die Populationen Antibiotika für die nächtliche Inkubation ausgesetzt und wieder unter nicht selektiven Bedingungen kultiviert, um die Entwicklung der Plasmidstabilität zu testen. Diese Abbildung wurde von Wein et al.8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig4large.jpg" target="_blank">geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig5.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Analyse der Plasmidkonformation. Visualisierung des Modellplasmids pCON. Visualisiert wird die unbehandelte Plasmid-DNA direkt nach der Extraktion, linearisierte Plasmid-DNA, und mit DNase behandelt, die nur chromosomale DNA sowie enzymatisch genickte DNA (d.h. offene Kreis-Plasmid-DNA) schneidet. Die Linearisierung des Plasmids zeigt, dass alle Plasmide gleich groß sind. Das Entfernen der chromosomalen DNA und das Nicken von pCON zeigt das Vorhandensein von Dimern und anderen Multimern. Diese Zahl wurde von Wein et al.8geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Unser experimenteller Ansatz bietet eine Strategie, um Plasmid-Fülle und Antibiotikaresistenz im Laufe der Zeit in Bakterienpopulationen zu folgen.

Quantifizierung der Plasmid-vermittelten Antibiotikaresistenz in einem experimentellen Evolutionsansatz

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Plasmide sind extrachromosomale Elemente, die in den meisten Bakterienarten und Lebensräumen allgegenwärtig sind, wo sie sehr wichtige Erreger des lateralen Gentransfers sind, da sie zwischen Zellen und Zwischenpopulationen wandern können. Eines der auffälligsten und prominentesten Beispiele für einen solchen Transfer ist die Verbreitung von Antibiotikaresistenzgenen, die auf Plasmiden kodiert sind. Um ein Modellplasmid zu erstellen, das ein Antibiotikaresistenzgen kodiert, wählen Sie ein Plasmid-Rückgrat und PCR verstärken das Rückgrat mit einer Hochtreue-Polymerase und Primern, die an die Plasmidschablone binden. In unserem Fall haben wir ein pBBR1-Plasmid-Rückgrat verwendet. Als nächstes verstärken Sie das Resistenzgen nptII einschließlich des nativen Tn5-Promotors mit einer Hochtreuepolymerase. Entwerfen Sie die Primer für das Resistenzgen mit ca. 20 Basenpaaren der Sequenzkompleärität zum Plasmid-Rückgrat. Nach den PCRs, verschmelzen Sie den Homologiebereich des gereinigten Resistenzgens PCR-Produkts mit dem gereinigten Plasmid-Rückgrat mit isothermen Baugruppen bei 50 Grad für 60 Minuten. Verwandeln Sie das geschmolzene Produkt in E.Coli DH5-Alpha mittels Elektroporation. Platte 100 Mikroliter der Mischung auf selektiven Medien und inkubieren bei 37 Grad für etwa 24 Stunden. Das Plasmid kann dann extrahiert, validiert und in den E.coli-Wildstamm MG1655 umgewandelt werden. Dies ergibt Stamm MG1655 pCON.Während der Antibiotika-Exposition, Bakterien brauchen das Plasmid zu überleben. Somit befindet sich das Plasmid unter positiver Selektion. Unter nicht-selektiven Bedingungen, also ohne Antibiotika, ist das Plasmid für die Zelle einweg. Das Ziel unserer Studie war es, die Plasmide unter solchen nicht-selektiven Bedingungen im Laufe der Zeit zu verfolgen. Dazu haben wir die kleinen Plasmide mit einem Antibiotikaresistenzgen ausgestattet und in Escherichia coli eingeführt. Wir führten ein evolutionäres Experiment durch und überwachten die Häufigkeit der Plasmide über die Nachbildung. Der Plasmid-Trägerstamm mg1655 pCON wird nun in ein Evolutionsexperiment eingeführt. Erstens, Platte mg1655 pCON auf LB Agar Platten mit Antibiotika ergänzt und inkubieren über Nacht bei 37 Grad. Wählen Sie aus dieser Platte zufällig die 8 Ahnenkolonien aus und brüten über Nacht bei 37 Grad mit ständigem Schütteln. Am nächsten Tag werden die Populationen auf das Experiment übertragen, das in 96 Tiefenbrunnenplatten durchgeführt wird. Es ist sehr wichtig, die Replikationen nach dem Zufallsprinzip auf die Platte zu verteilen. Zum Beispiel in einem Schachbrettansatz. In unserem Experiment werden die Kulturen verdünnt und mit unterschiedlichen Verdünnungsraten und bei zwei Temperaturen übertragen. Bei jedem Transferereignis wird die Verdünnungsbehandlung angewendet und die serielle Übertragung über insgesamt 98 Transfers wiederholt. Entlang des Evolutionsexperiments wird die Häufigkeit von Plasmiden in der Population anhand des Anteils der Plasmid trägerden Zellen geschätzt. Replica Plating wurde von Esther und Joshua Lederberg in den 1950er Jahren populär gemacht, wo sie es verwendet, um Die Drogenresistenz bei Bakterien zu studieren. Die Methode wird es ihnen ermöglichen, ihre Scans nach Phänotypen zu skalieren und am Ende der Studie zeigte, dass Penicillinresistenz in Bakterien aufgrund spontaner Mutationen im Genom entstehen kann. Um die Plasmidhäufigkeit in der Population während des Experiments zu bestimmen, werden stationäre Kulturen seriell verdünnt und auf nicht-selektiven LB-Agarplatten plattiert. Passen Sie die Verdünnung nach einem Ertrag von 250 bis 500 Kolonien pro Platte an. Die plattierten Populationen werden für das Übernachtwachstum bei 37 Grad für weniger als 24 Stunden inkubiert. Kolonien werden am besten repliziert, wenn sie noch klein sind. Nach dem über Nacht Wachstum zählen alle Kolonien mit einem automatisierten Koloniezähler nach Wahl des Lesers. Dies ergibt die Gesamtgröße der Bakterienpopulation in den Kulturen. Beachten Sie, dass Kolonien am Rand der Platte weggelassen werden sollten. Um die Platten zu replizieren, benötigen Sie selektive Agarplatten, ergänzt mit Antibiotika, einen runden Block, einen Metallring, der in den Block passt, und steriles Samttuch. Das Tuch muss 100% Baumwolle sein, da dies durch Autoklavierung sterilisiert werden kann. Legen Sie das Tuch auf den Block und fixieren Sie es mit dem Metallring.Legen Sie den Teller mit den gezählten Kolonien vorsichtig auf die feste Samttuchoberfläche. Tippen Sie auf die Platte in Kreisbewegungen, so dass die gesamte Plattenoberfläche das Tuch berührt. Es ist sehr wichtig, dass alle Kolonien den Samt berühren. Entfernen Sie die LB-Platte und legen Sie die selektive Platte auf den Samt. Wiederholen Sie das sorgfältige Tippen. Es ist wieder wichtig, dass die Platte den Samt vollständig berührt. Entfernen Sie anschließend die selektive Platte. Die Platten werden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag werden sowohl die LB als auch die Antibiotikaplatte für die Bewertung benötigt. Legen Sie die Platten übereinander und vergleichen Sie das Wachstum. Sie können einfach koloniefreie Räume entdecken. Das sind die Kolonien, die nicht gegen Antibiotika resistent sind. So verloren diese Kolonien das Plasmid. Markieren Sie am Ende, wie viele Kolonien auf der Antibiotikaplatte fehlen. Diese Zahl gibt Ihnen den Plasmidverlust. Wiederholen Sie die Nachbildung aller Populationen während des Evolutionsexperiments wöchentlich. Plasmidverlust kann durch Plasmid-Multi-Malformation verursacht werden. Bei der Arbeit an einer Plasmidkonstruktion sagen für die Expression eines bestimmten Gens in Ihrem bevorzugten Wirtsstamm das native Verhalten eines Plasmids in vivo in Bezug auf die Bestätigung, die ein Zustand nehmen kann, ist in der Regel etwas, das übersehen wird. Aber in einem evolutionären Kontext könnte eine solche Bestätigung von Veränderungen von sehr großer Bedeutung sein. Die Analyse von Plasmid-Bestätigungen kann ein sehr schwieriges Unterfangen sein. Besonders Plasmidmultimere sind schwer zu analysieren, da sie nicht durch PCR oder Durch Sequenzierung richtig identifiziert werden können. Auf der anderen Seite sind Plasmidmultimere aufgrund ihrer potenziell großen Größe und ihrer langsamen elektrophoretischen Mobilität durch Gelelektrophorese schwer zu analysieren. Unser Protokoll bietet eine einfache und einfache Methode für das Screening und die Identifizierung von Plasmid-Multimern in, würde ich sagen, jede gegebene Plasmid-Präparation. Um visuelle Plasmidmoleküle extrahieren das Plasmid aus 5 ml stationären Nachtzellkultur mit alkalischer Lyse. Die Plasmidextraktion von Plasmaplasmiden mit niedriger Kopie führt oft zu einer Kontamination mit der chromosomalen DNA des Wirts, die vor der Visualisierung verdaut werden muss. Um die chromosomale DNA-Kontamination zu entfernen, behandeln Sie die extrahierte Plasmid-DNA mit Plasmid-Safe

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Forschung

Genetik

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