Name: quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach
Uploaded: 2019-12-14T14:00:00
Duration: 12 min 32 s
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हम रचनात्मक सहायता और तकनीकी सहायता के लिए गोर मार्गआर्यन को धन्यवाद देते हैं । इस काम को जेडएमबी यंग साइंटिस्ट ग्रांट 2017/2018 (TW को सम्मानित) और डीएफजी फोकस प्रोग्राम 1819 (ग्रांट नंबर एक) ने सपोर्ट किया था। DA1202/2-1 टीडी को सम्मानित किया गया) ।

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	<li>San Millan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+plasmid-mediated+antibiotic+resistance+in+the+clinical+context.">Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context.</a> Trends in Microbiology. 26 (12), 978-985 (2018).</li><li>Bruto, M., James, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+crassostreae,+a+benign+oyster+colonizer+turned+into+a+pathogen+after+plasmid+acquisition.">Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition.</a> The ISME Journal. 11 (4), 1043-1052 (2017).</li><li>von Wintersdorff, C. J. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicopy+plasmid+instability:+the+dimer+catastrophe+hypothesis.">Multicopy plasmid instability: the dimer catastrophe hypothesis.</a> Molecular Microbiology. 8 (6), 1031-1038 (1993).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Ilhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregational+drift+and+the+interplay+between+plasmid+copy+number+and+evolvability.">Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability.</a> Molecular Biology and Evolution. 36 (3), 472-486 (2019).</li><li>Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. 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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

इस प्रोटोकॉल में, हम एक दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं जो बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध के हठ के लिए प्लाज्मिड विकास की भूमिका की जांच करने के लिए आणविक जीव विज्ञान, प्रयोगात्मक विकास और डीएनए दृश्य में तकनीकों को जोड़ती है। हालांकि प्रस्तुत दृष्टिकोण विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों से तरीकों को जोड़ती है, सभी लागू तकनीकों सीधा कर रहे है और एक मानक माइक्रोबायोलॉजी प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया जा सकता है ।
प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण कदम मॉडल प्रणाली तनाव है कि प्लाज्मिड ले जाने जीनोटाइप के आनुवंशिक सत्यापन भी शामिल है के निर्माण में शामिल हैं । विशेष रूप से, कई प्लाज्मिड स्वाभाविक रूप से एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को एन्कोड करते हैं। इस प्रकार, पाठक प्रोटोकॉल के चरण 1 को छोड़ सकता है और सीधे चरण 2 के साथ आगे बढ़ सकता है। इसके बाद, विकास प्रयोगों में आबादी को दोहराने का एक यादृच्छिक डिजाइन शामिल होना चाहिए ताकि परिणाम गहरी अच्छी तरह से प्लेट में दोहराने वाली आबादी की स्थिति से पक्षपाती न हों। इसके अलावा, विकास प्रयोग में सीरियल ट्रांसफर और कमजोर पड़ने वाले चरणों को सावधानीपूर्वक संचालित करना विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि संदूषण परिणामों को ग़लत साबित करेगा। अंत में, प्रतिकृति चढ़ाना बड़ी सावधानी के साथ आयोजित किया जाना चाहिए। बड़ी कॉलोनी का आकार एक मुद्दा हो सकता है, लेकिन 24 घंटे से कम समय के लिए प्लेटों को इनक्यूबेटकरी करके इससे बचा जा सकता है। इसी तरह, एक प्लेट पर कालोनियों की संख्या प्रतिकृति चढ़ाना परिणाम पूर्वाग्रह हो सकता है । इसलिए, चढ़ाना और प्रतिकृति से पहले आबादी को पतला करने की आवश्यकता है।
हमारे दृष्टिकोण का सबसे बड़ा लाभ यह है कि आसानी से भारी उपकरणों की आवश्यकता के बिना पुन: पेश किया जा सकता है । इसके अलावा, मार्कर जीन का पालन करने के लिए प्रतिकृति चढ़ाना का एक और लाभ यह है कि केवल जीवित कोशिकाओं का मूल्यांकन किया जाता है, प्रवाह साइटोमेट्री या क्यूपीसीआर के विपरीत जिसमें मृत कोशिकाओं को जीवित के रूप में मूल्यांकन किया जा सकता है। इस प्रकार, प्रतिकृति चढ़ाना प्लाज्मिड-ले जाने वाली कोशिकाओं की गिनती के लिए कम पूर्वाग्रह का परिचय देता है। बहरहाल, प्रतिकृति चढ़ाना की एक सीमा जनसंख्या आकार (यानी, सेल संख्या) है कि एक प्रयोगात्मक रन में मूल्यांकन करने के लिए संभव है हो सकता है ।
हमारे दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने हाल ही में दिखाया है कि प्लाज्मिड स्थिरता विकास बैक्टीरिया में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के हठ को शक्तिशाली बनाता है। इस प्रकार, हमने प्लाज्मिड-मध्यस्थता प्रतिरोध हठ का पालन करने के लिए एक उपकरण के रूप में एक दृष्टिकोण विकसित किया है जो एंटीबायोटिक दवाओं की उपस्थिति के बिना विशेष रूप से शर्तों के तहत समय के साथ प्रतिरोध का पालन करने के लिए उच्च महत्व का है।

प्लाज्मिड गोलाकार होते हैं, जो स्वयं को दोहराने वाले आनुवंशिक तत्व होते हैं जो प्रोकैरियोट्स में सर्वव्यापी होते हैं। वे पार्श्व जीन हस्तांतरण के एजेंट हैं, क्योंकि वे माइक्रोबियल आबादी के बीच लक्षण स्थानांतरित कर सकते हैं, और इस प्रकार माइक्रोबियल विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए माना जाता है । प्लाज्मिड कम समय में विकास-सीमित स्थितियों के लिए तेजी से अनुकूलन के चालक हैं (उदाहरण के लिए, एंटीबायोटिक दवाओं या कीटनाशकों की उपस्थिति में1)और अन्य जीवनशैली मोड में दीर्घकालिक संक्रमण के लिए जिम्मेदार हैं (उदाहरण के लिए, रोगजनकता2का उद्भव)। जीन के हस्तांतरण पर प्लाज्मिड के प्रभाव के लिए सबसे उल्लेखनीय उदाहरण एंटीबायोटिक दवाओं के उतार-चढ़ाव वाले स्तरों के संपर्क में आने वाले पारिस्थितिकी प्रणालियों में प्रलेखित किए जाते हैं, जैसे चिकित्सा क्लीनिक या औद्योगिक खेतों में3। मजबूत सकारात्मक चयन के कारण, कई प्लाज्मिड एंटीमाइक्रोबियल प्रतिरोध जीन के लिए एन्कोड करते हैं और अक्सर अपने बैक्टीरियल होस्ट को बहुप्रतिरोधक प्रदान करने के लिए पाए जाते हैं। प्लाज्मिड आबादी या बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच प्रवास को सक्षम करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप कई रोगाणुरोधी प्रतिरोध का तेजी से प्रचार होता है। अचयनात्मक परिस्थितियों में प्लाज्मिड सेल के लिए आवश्यक नहीं हैं और अक्सर परजीवी तत्वों के रूप में भी जाना जाता है। फिर भी, प्लाज्मिड प्रकृति में सर्वव्यापी हैं और उनका विकास बैक्टीरियल गुणसूत्रों के साथ अत्यधिक जुड़ा हुआ है। प्राकृतिक वातावरण में प्लाज्मिड हठ (उतार-चढ़ाव और गैर-चयनात्मक) खराब समझ में आता है, फिर भी प्रकृति में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के हठ के बारे में हमारी समझ के लिए यह उच्च महत्व का है।
प्रायोगिक विकास माइक्रोबियल आबादी4के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । प्रायोगिक विकास ने दिखादिया कि प्लाज्मिड रखरखाव के लिए मजबूत चयन लगाने से प्लाज्मिड या होस्ट गुणसूत्र का प्रतिपूरक (यानी अनुकूली) विकास होता है जो प्लाज्मिड फिटनेस लागत को कम करता है और बदले में, प्लाज्मिड बहुतायत (यानी प्लाज्मिड हठ)5,6,7की सुविधा प्रदान करता है। इस प्रकार, समय के साथ प्लाज्मिड-होस्ट इंटरैक्शन के बाद दोनों तत्वों के अनुकूलन के महत्वपूर्ण तंत्र प्रकट हो सकते हैं। इसके अलावा, प्रायोगिक विकास8,9,10विभिन्न परिस्थितियों में समय के साथ प्लाज्मिड-ले जाने वाली कोशिकाओं की बहुतायत को निर्धारित करने में सक्षम बनाता है।
विकास प्रयोगों में प्लाज्मिड हठ फ्लोरोसेंट एक्टिवेटेड सेल छंटाई (एफएसीएस)11,मात्रात्मक पीसीआर (क्यूपीसीआर)11,या खेती आधारित तरीकों में प्रवाह साइटोमेट्री सहित कई रणनीतियों द्वारा निगरानी की जा सकती है। फ्लो साइटोमेट्री को प्लाज्मिड पर एक एफएसीएस मशीन और एक डिटेक्टेबल (फ्लोरोसेंट) मार्कर जीन की शुरुआत की आवश्यकता होती है, जैसे कि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), प्लाज्मिड पर। हालांकि, जीएफपी अभिव्यक्ति कई सेलुलर गुणों को बदल सकती है और इसके अलावा सेल12में प्लाज्मिड स्थान को प्रभावित कर सकती है, जो बदले में सेल डिवीजन के दौरान प्लाज्मिड विरासत को प्रभावित कर सकती है। प्लाज्मिड बहुतायत को मापने के लिए एक क्यूपीसीआर दृष्टिकोण प्लाज्मिड कॉपी संख्या से अत्यधिक पक्षपाती हो सकता है, जो बैक्टीरियल विकास चरण औरसमय 13के साथ बहुत भिन्न हो सकता है। अंत में, एक संस्कृति आधारित और चढ़ाना दृष्टिकोण एक चयन मार्कर जीन की शुरूआत की आवश्यकता है । यह एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन हो सकता है, जिसे अक्सर प्राकृतिक प्लाज्मिड पर एन्कोड किया जाता है; इस प्रकार, कोई आनुवंशिक हेरफेर आवश्यक नहीं है। एंटीबायोटिक प्रतिरोध एक पारंपरिक प्रतिकृति चढ़ाना दृष्टिकोण के बाद किया जा सकता है । इस प्रकार, प्राकृतिक प्लाज्मिड गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, प्रतिकृति चढ़ाना प्लाज्मिड-एन्कोडेड एंटीबायोटिक रिसिजिटेंस14की निगरानी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।
प्लाज्मिड अणुओं की कल्पना करने के लिए (उदाहरण के लिए, प्लाज्मिड आकार का मूल्यांकन करने के लिए) कई विधियां लागू की जा सकती हैं। पीसीआर-आधारित दृष्टिकोण का उपयोग करके पूरे प्लाज्मिड को परिलक्षित किया जा सकता है। हालांकि, इसके लिए विशिष्ट प्राइमर के डिजाइन की आवश्यकता होती है, जो विकास प्रयोग के दौरान चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि प्लाज्मिड अनुक्रम समय के साथ बदल सकता है। इसके अलावा, पीसीआर प्राइमर के लिए कई बाध्यकारी साइटों के कारण पीसीआर आधारित दृष्टिकोण में प्लाज्मिड मल्टीमर्स को बढ़ाना मुश्किल है। बहुमेरिक प्लाज्मिड अणु प्लाज्मिड प्रतिकृति समाप्ति के बाद या प्लाज्मिड अणुओं के पुनर्संयोजन के माध्यम से दिखाई दे सकते हैं और ज्यादातर सिर से पूंछ15उन्मुख होते हैं। प्लाज्मिड विज़ुअलाइज़ेशन का एक और दृष्टिकोण डीएनए एंनोन्यूकलीज द्वारा प्लाज्मिड अणुओं के एंजाइमैटिक पाचन को जोड़ती है जो या तो क्लीव या निक एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस विश्लेषण के साथ एक प्लाज्मिड डीएनए स्ट्रैंड को निक करता है। विभिन्न आकारों (जैसे, मोनोमर बनाम मल्टीमर) का एक ही प्लाज्मिड विभिन्न जेल गतिशीलता में परिणाम देता है जिसे प्लाज्मिड अणुओं की कल्पना करते समय देखा जा सकता है। यह दृष्टिकोण विभिन्न प्लाज्मिड संरचनाओं (यानी मल्टीमराइजेशन राज्यों) के दृश्य और मात्राकरण को सक्षम बनाता है। प्लाज्मिड संरचना को प्लाज्मिड स्थिरता के संकेतक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, क्योंकि सेल डिवीजन16के दौरान प्लाज्मिड मल्टीमर अक्सर खो जाते हैं।
हाल ही में एक काम में, हम शर्तों में प्लाज्मिड हठ का पालन किया है कि प्लाज्मिड बहुतायत के लिए चयनात्मक नहीं थे (यानी, एंटीबायोटिक चयन के बिना) । हमने प्लाज्मिड हठ की तुलना दो अलग-अलग तापमान (20 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस) और तीन जनसंख्या आकार (यानी कमजोर पड़ने की दर) पर की। विभिन्न कमजोर पड़ने की दरों, या जनसंख्या बाधाओं को लागू करना, बैक्टीरियल और प्लाज्मिड विकास पर जनसंख्या आकार के प्रभाव की जांच के लिए अनुमति देता है। हमारे परिणामों के आधार पर, हम प्रस्ताव है कि प्लाज्मिड ्स अपने जीवाणु मेजबान के लिए तटस्थ हो सकता है और किसी भी चयन दबाव8के बिना स्थिरता विकसित कर सकते हैं । विकसित प्लाज्मिड स्थिरता प्लाज्मिड मल्टीमर गठन8की कमी से प्रदान की जाती है ।
यहां, हम एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन के रखरखाव के संबंध में प्लाज्मिड हठ और प्लाज्मिड विकास की जांच की मात्रा के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । विधि में कई कदम हैं, जिनमें एक मॉडल प्लाज्मिड के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन का सम्मिलन शामिल है (जिसे प्राकृतिक प्रतिरोध प्लाज्मिड का उपयोग करते समय छोड़ा जा सकता है), इसके बाद प्लाज्मिड की क्षमता का आकलन करने के लिए प्रायोगिक विकास का उपयोग जारी रहता है प्रतिकृति चढ़ाना का उपयोग करके समय के साथ प्लाज्मिड आवृत्ति गतिशीलता का निर्धारण करते समय गैर-चयनात्मक परिस्थितियों में, और दृश्य द्वारा प्लाज्मिड जीनोम का विश्लेषण। यहां वर्णित प्रोटोकॉल को प्लाज्मिड्स के विकास और दृढ़ता की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, लेकिन इसे समय के साथ गुणसूत्र प्रतिरोध जीन (या अन्य मार्कर जीन) के विकास का पालन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EN07.1</td>
			<td>2 ml, square</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates (cryo)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1702-8400</td>
			<td>Micro-Dilution Tube System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony counter</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SC6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton velvet</td>
			<td>drapery shop</td>
			<td></td>
			<td>100 % cotton required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652089</td>
			<td>0.1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Gel Extraction kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0832</td>
			<td>PCR fragment clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50125852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (plate shaker)</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaker)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052, 3125000028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Capp</td>
			<td>ME8-1250R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Eurofines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F533S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmidSafe enzyme</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>10059400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica block &#38; metal ring</td>
			<td>VWR</td>
			<td>601-3401</td>
			<td>PVC cylinder 69 mm; ring 102cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resctriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach

प्लाज्मिड्स माइक्रोबियल पारिस्थितिकी और विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं क्योंकि पार्श्व जीन हस्तांतरण और माइक्रोबियल आबादी में सहायक जीन कार्यों के जलाशयों के वाहन। यह विशेष रूप से तेजी से बदलते वातावरण के तहत मामला है जैसे कि एंटीबायोटिक दवाओं के जोखिम में उतार-चढ़ाव । हमने हाल ही में दिखाया कि प्लाज्मिड उपस्थिति के लिए सकारात्मक चयन के बिना एस्चेरिचिया कोलाई में एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन बनाए रखते हैं। यहां हम एक प्रायोगिक प्रणाली का वर्णन करते हैं जो दीर्घकालिक विकास प्रयोगों में प्लाज्मिड जीनोटाइप और फेनोटाइप दोनों का पालन करने की अनुमति देता है। हम आणविक तकनीकों का उपयोग एक मॉडल प्लाज्मिड डिजाइन करने के लिए करते हैं जिसे बाद में ई. कोलाई होस्ट में एक प्रयोगात्मक विकास बैच सिस्टम दृष्टिकोण से पेश किया जाता है। हम समय के साथ प्लाज्मिड आवृत्ति का पालन करें ई. कोलाई आबादी की प्रतिकृति चढ़ाना लागू करने के द्वारा, जबकि एंटीबायोटिक प्रतिरोध हठ मात्रा । इसके अलावा, हम प्लाज्मिड निकिंग और अगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा प्लाज्मिड मल्टीमर गठन की सीमा का विश्लेषण करके मेजबान कोशिकाओं में प्लाज्मिड की संरचना की निगरानी करते हैं। इस तरह के एक दृष्टिकोण हमें न केवल विकसित प्लाज्मिड के जीनोम आकार की कल्पना करने की अनुमति देता है, लेकिन यह भी उनके स्थलोलॉजिकल संरचना-प्लाज्मिड विरासत के लिए अत्यधिक महत्वपूर्ण कारक । हमारी प्रणाली पारंपरिक माइक्रोबायोलॉजी दृष्टिकोण के साथ आणविक रणनीतियों को जोड़ती है और लंबे समय से बैक्टीरियल आबादी में प्लाज्मिड का पालन करने के लिए एक सेट-अप प्रदान करती है। प्रस्तुत दृष्टिकोण भविष्य में मोबाइल आनुवंशिक तत्वों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

यहां, हम एक जनसंख्या में प्लाज्मिड हठ मात्रा द्वारा प्लाज्मिड विकास का अध्ययन करने के लिए एक दृष्टिकोण पेश करते हैं । सबसे पहले, हम दिखाते हैं कि ई. कोलाई स्ट्रेन MG1655 pCON को ले जाने वाले प्लाज्मिड का निर्माण कैसे किया जाए जिसे बाद में एक विकास प्रयोग से पेश किया गया है। दूसरा, हम विकसित जीवाणु आबादी में प्लाज्मिड बहुतायत का पालन करने के लिए एक सीधा तरीका पेश करते हैं। अंत में, हम दिखाते हैं कि प्लाज्मिड अणु आकार और संरचना की कल्पना कैसे की जाए।
हमारे पिछलेकाम 8 प्रस्तुत दृष्टिकोण का उपयोग कर में हम एंटीबायोटिक दवाओं की अनुपस्थिति में ई. कोलाई में एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्लाज्मिड्स के हठ के बाद एक विकास प्रयोग आयोजित(चित्रा 4)। हमारे प्रतिनिधि परिणाम 37 डिग्री सेल्सियस पर आबादी के विकास और 10-4की कमजोर पड़ने की दर दिखाते हैं . प्लाज्मिड-ले जाने वाली कोशिकाओं की बहुतायत के बाद, हमने समय के साथ आवृत्ति प्लाज्मिड-ले जाने वाली मेजबान कोशिकाओं(चित्रा 4)में कमी देखी। हमारे दृष्टिकोण ने हमें यह पता लगाने में सक्षम बनाया कि प्लाज्मिड लॉस संघनित प्लाज्मिड जीनोम वास्तुकला का परिणाम था, जिसके कारण प्रतिरोध जीन के प्रतिलेखन और प्लाज्मिड की प्रतिकृति के कारण होने वाले संघर्षों के कारण प्लाज्मिड अस्थिरता हुई। प्लाज्मिड अणुओं की कल्पना ने हमें यह पता लगाने में सक्षम बनाया कि इन संघर्षों ने एक अस्थिर प्लाज्मिड संरचना (यानी, प्लाज्मिड मल्टीमर गठन, चित्रा 5)का नेतृत्व किया। फिर भी, हमने एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क के बिना प्लाज्मिड स्थिरता विकास देखा(चित्र4)। विकसित स्थिरता को एक प्लाज्मिड आंतरिक दोहराव द्वारा प्रदान किया गया था जिसने प्रतिलेखन-प्रतिकृति संघर्षों को समाप्त कर दिया और स्थिर विरासत में मिली प्लाज्मिड के गठन का नेतृत्व किया। इस प्रकार हमारे परिणाम आनुवंशिक तत्वों के अनुकूली विकास में पुनर्संयोजन और जीनोम प्रवर्धन के महत्व को प्रदर्शित करते हैं।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig1.jpg"> चित्रा 1: pCON के प्लाज्मिड डिजाइन। क्लोनिंग रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व प्लाज्मिड पीसीओन बनाने के लिए उपयोग किया जाता है। प्लाज्मिड रीढ़ (pBBR1) और एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन(एनपीटीआई)पीसीआर परिलक्षित होते हैं और आइसोथर्मल फ्यूजन20से जुड़े होते हैं। यह प्लाज्मिड pCON और तनाव MG1655 pCON पैदावार । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig1large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig2.jpg"> चित्रा 2: दीर्घकालिक विकास प्रयोग का डिजाइन। धारावाहिक स्थानांतरण प्रयोग का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्लाज्मिड ले जाने (pCON) आबादी चुनिंदा मीडिया पर चढ़ाया जाता है । पैतृक उपनिवेशों बेतरतीब ढंग से थाली से चुना जाता है और एक धारावाहिक हस्तांतरण प्रणाली के लिए शुरू की जाती है। स्थानांतरण विभिन्न आकारों की जनसंख्या बाधाओं का अनुकरण करने के लिए तीन अलग-अलग कमजोर पड़ने वाले दृष्टिकोणों के साथ आयोजित किए जाते हैं। कमजोर पड़ने को क्रमिक रूप से दोहराया जाता है । यह प्रयोग दो तापमान व्यवस्थाओं में किया जाता है। प्लाज्मिड-होस्ट आवृत्ति प्रतिकृति चढ़ाना के माध्यम से प्रयोग के साथ मापा जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig3.jpg"> चित्रा 3: प्रतिकृति चढ़ाना। बैक्टीरियल आबादी की प्रतिकृति चढ़ाना में उपयोग किए जाने वाले चरणों का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig3large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig4.jpg"> चित्रा 4: समय के साथ प्रतिनिधि pCON आवृत्ति। pCON हठ विकास प्रयोग के दौरान मेजबान (प्रतिनिधि दोहराने आबादी) के अनुपात के रूप में दिखाया गया है । 98 स्थानान्तरण के लिए, पीकॉन प्लाज्मिड आबादी 10-4के कमजोर पड़ने वाले कारक के साथ गैर-चयनात्मक परिस्थितियों में विकसित हुई। प्लाज्मिड pCON ले जाने वाले सभी प्रतिकृतियों की आबादी में कमी आई। बाद में, आबादी रातोंरात ऊष्मायन के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के संपर्क में थे और प्लाज्मिड स्थिरता विकास के लिए परीक्षण करने के लिए गैर चयनात्मक परिस्थितियों में फिर से खेती की गई । इस आंकड़े को वेन एट अल से संशोधित किया गया है।8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig4large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig5.jpg"> चित्रा 5: प्लाज्मिड संरचना का प्रतिनिधि विश्लेषण। मॉडल प्लाज्मिड पकॉन का दृश्य। विजुअलाइज्ड अनइलाज प्लाज्मिड डीएनए सीधे निकालने के बाद, रैखिक प्लाज्मिड डीएनए है, और DNase के साथ इलाज किया जाता है जो केवल गुणसूत्र डीएनए के साथ-साथ एंजाइमैटिक रूप से निकाड डीएनए (यानी, ओपन सर्कल प्लाज्मिड डीएनए) में कटौती करता है। प्लाज्मिड को रैखिक करने से पता चलता है कि सभी प्लाज्मिड एक ही आकार के होते हैं। क्रोमोसोमल डीएनए और निकिंग पीसीओएन को हटाने से डिमर्स और अन्य मल्टीमर की उपस्थिति का पता चलता है। इस आंकड़े को वेन एट अल8से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig5large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

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Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

हमारा प्रायोगिक दृष्टिकोण बैक्टीरियल आबादी में समय के साथ प्लाज्मिड बहुतायत और एंटीबायोटिक प्रतिरोध का पालन करने की रणनीति प्रदान करता है।

एक प्रायोगिक विकास दृष्टिकोण में प्लाज्मिड-मध्यस्थता एंटीबायोटिक प्रतिरोध का परिमाणीकरण

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

प्लाज्मिड्स एक्सट्राक्रोमोमोमल तत्व हैं जो अधिकांश जीवाणु प्रजातियों और आवासों में सर्वव्यापी हैं जहां वे पार्श्व जीन हस्तांतरण के बहुत महत्वपूर्ण एजेंट हैं क्योंकि वे कोशिकाओं और आबादी के बीच माइग्रेट कर सकते हैं। इस तरह के हस्तांतरण के सबसे हड़ताली और प्रमुख उदाहरणों में से एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन का प्रसार है जो प्लाज्मिड पर एन्कोड किए जाते हैं। एक मॉडल प्लाज्मिड बनाने के लिए जो एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को एन्कोड करता है, एक प्लाज्मिड बैकबोन चुनें और पीसीआर एक उच्च निष्ठा पॉलीमरेज और प्राइमर का उपयोग करके रीढ़ को बढ़ाता है जो प्लाज्मिड टेम्पलेट पर बांधता है। हमारे मामले में हम एक pBBR1 प्लाज्मिड रीढ़ का इस्तेमाल किया । इसके बाद, उच्च निष्ठा बहुलक का उपयोग करके देशी Tn5 प्रमोटर सहित प्रतिरोध जीन nptII को बढ़ाना। प्लाज्मिड रीढ़ की हड्डी के अनुक्रम पूरकता के लगभग 20 आधार जोड़े के साथ प्रतिरोध जीन के लिए प्राइमर डिजाइन करें। पीसीआरएस के बाद, शुद्ध प्रतिरोध जीन पीसीआर उत्पाद के होमोलॉजी क्षेत्र को शुद्ध प्लाज्मिड बैकबोन में फ्यूज करें, जो 60 मिनट के लिए 50 डिग्री पर आइसोथर्मल असेंबली का उपयोग करके शुद्ध है। इलेक्ट्रोपॉशन का उपयोग करके फ्यूज किए गए उत्पाद को ई.कोलाई डीएच5-अल्फा में बदल दें। चुनिंदा मीडिया पर मिश्रण की प्लेट 100 माइक्रोलीटर और लगभग 24 घंटे के लिए 37 डिग्री पर इनक्यूबेट। प्लाज्मिड को तब निकाला जा सकता है, मान्य किया जा सकता है और ई.कोलाई जंगली प्रकार तनाव MG1655 में तब्दील किया जा सकता है। यह पैदावार तनाव MG1655 pCON.एंटीबायोटिक जोखिम के दौरान, बैक्टीरिया जीवित रहने के लिए प्लाज्मिड की जरूरत है । इस प्रकार, प्लाज्मिड सकारात्मक चयन के तहत है। गैर-चयनात्मक परिस्थितियों में, इसलिए एंटीबायोटिक दवाओं के बिना, प्लाज्मिड कोशिका के लिए डिस्पोजेबल है। हमारे अध्ययन का उद्देश्य समय के साथ ऐसी गैर-चयनात्मक परिस्थितियों में प्लाज्मिड का पालन करना था। इस उद्देश्य के लिए, हमने छोटे प्लाज्मिड को एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन से लैस किया और इसे एस्चेरिचिया कोलाई से पेश किया। हमने एक विकासवादी प्रयोग किया और प्रतिकृति चढ़ाना के माध्यम से प्लाज्मिड आवृत्ति की निगरानी की। प्लास्मिड ले जाने के तनाव mg1655 pCON अब एक विकास प्रयोग करने के लिए पेश किया है । सबसे पहले, एलबी एगर प्लेटों पर प्लेट mg1655 pCON एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक और ३७ डिग्री पर रात भर इनक्यूबेट । इस प्लेट से बेतरतीब ढंग से 8 पूर्वज कालोनियों का चयन करें और लगातार मिलाते हुए 37 डिग्री पर रात भर इनक्यूबेट करें। अगले दिन, आबादी ९६ गहरी अच्छी तरह से प्लेटों में आयोजित किया जाता है कि प्रयोग करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं । प्लेट में प्रतिकृति को बेतरतीब ढंग से वितरित करना बेहद महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, चेकरबोर्ड दृष्टिकोण में। हमारे प्रयोग में संस्कृतियों को पतला और विभिन्न कमजोर पड़ने दरों के साथ और दो तापमान में स्थानांतरित कर रहे हैं । हर स्थानांतरण घटना के दौरान कमजोर पड़ने उपचार लागू किया जाता है और सीरियल स्थानांतरण कुल 98 स्थानान्तरण पर दोहराया जाता है। विकास प्रयोग के साथ जनसंख्या में प्लाज्मिड की आवृत्ति कोशिकाओं को ले जाने वाले प्लाज्मिड के अनुपात से अनुमानित है। प्रतिकृति चढ़ाना 1950 के दशक में एस्तेर और जोशुआ लेडरबर्ग द्वारा लोकप्रिय किया गया था, जहां वे इसे इस्तेमाल के लिए बैक्टीरिया में दवा प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए । इस विधि से वे फेनोटाइप के लिए अपनी स्कैनिंग को अपस्केल कर सकेंगे और अध्ययन के अंत में पता चला कि जीनोम में सहज उत्परिवर्तन के कारण बैक्टीरिया में पेनिसिलिन प्रतिरोध पैदा हो सकता है । प्रयोग के दौरान जनसंख्या में प्लाज्मिड आवृत्ति निर्धारित करने के लिए, स्थिर संस्कृतियों को क्रमिक रूप से पतला किया जाता है और गैर-चयनात्मक पौंड आगर प्लेटों पर चढ़ाया जाता है। प्रति प्लेट 250 से 500 कॉलोनियों की उपज के हिसाब से कमजोर पड़ने को एडजस्ट करें। चढ़ाया आबादी 24 घंटे से भी कम समय के लिए ३७ डिग्री पर रात भर की वृद्धि के लिए इनक्यूबेटेड कर रहे हैं । जब वे अभी भी छोटे होते हैं तो उपनिवेशों को सबसे अच्छा दोहराया जाता है। रातोंरात विकास के बाद पाठक की पसंद के एक स्वचालित कॉलोनी काउंटर का उपयोग कर सभी कालोनियों गिनती। यह संस्कृतियों में कुल बैक्टीरिया जनसंख्या आकार पैदावार । ध्यान रहे कि प्लेट के किनारे पर कालोनियों को छोड़ दिया जाना चाहिए। प्लेटों को दोहराने के लिए, आपको एंटीबायोटिक दवाओं, एक गोल ब्लॉक, एक धातु की अंगूठी के साथ पूरक चयनात्मक आगर प्लेटों की आवश्यकता होती है जो ब्लॉक और बाँझ मखमल कपड़े को फिट बैठता है। कपड़े को 100% कपास की आवश्यकता होती है क्योंकि इसे ऑटोक्लेवेशन द्वारा निष्फल किया जा सकता है। कपड़े को ब्लॉक पर रखें और मेटल रिंग से ठीक करें।निश्चित मखमल कपड़े की सतह पर गिने हुए कॉलोनियों के साथ प्लेट को ध्यान से रखें। सर्कल आंदोलनों में प्लेट को टैप करें ताकि सभी प्लेट की सतह कपड़े को छू सके। यह बहुत जरूरी है कि सभी कॉलोनियां मखमल को छूएं। एलबी प्लेट निकालें और मखमल पर चुनिंदा प्लेट रखें। सावधानीपूर्वक टैपिंग दोहराएं। यह फिर से महत्वपूर्ण है कि प्लेट मखमल को पूरी तरह से छू जाए। बाद में, चुनिंदा प्लेट निकालें। रात भर कमरे के तापमान पर प्लेटें इनक्यूबेटेड होती हैं । अगले दिन मूल्यांकन के लिए एलबी और एंटीबायोटिक्स प्लेट दोनों की जरूरत होती है । प्लेटों को एक दूसरे के ऊपर रखें और विकास की तुलना करें। आप आसानी से कॉलोनी मुक्त स्थान हाजिर कर सकते हैं। ये ऐसी कॉलोनियां हैं जो एंटीबायोटिक्स के लिए प्रतिरोधी नहीं हैं । इस तरह इन कॉलोनियों ने प्लाज्मिड खो दिया। अंत में, एंटीबायोटिक दवाओं की प्लेट पर कितनी कॉलोनियां गायब हैं, चिह्नित करें। यह नंबर आपको प्लाज्मिड लॉस देता है। विकास प्रयोग साप्ताहिक के दौरान सभी आबादी की प्रतिकृति चढ़ाना दोहराएं। प्लाज्मिड नुकसान प्लाज्मिड मल्टी कुरूपता के कारण हो सकता है। जब एक प्लाज्मिड निर्माण पर काम कर अपने पसंदीदा मेजबान में एक दिया जीन की अभिव्यक्ति के लिए कहते है पुष्टि एक राज्य ले जा सकते है के संबंध में वीवो में एक प्लाज्मिड के मूल व्यवहार तनाव आमतौर पर कुछ है कि अनदेखी की है । लेकिन एक विकासवादी संदर्भ में परिवर्तन की ऐसी पुष्टि बहुत बड़ा महत्व का हो सकता है । प्लाज्मिड पुष्टि का विश्लेषण एक बहुत ही मुश्किल प्रयास हो सकता है। विशेष रूप से प्लाज्मिड मल्टीमर्स का विश्लेषण करना मुश्किल है क्योंकि उन्हें पीसीआर द्वारा या अनुक्रमण द्वारा ठीक से पहचाना नहीं जा सकता है। दूसरी तरफ, प्लाज्मिड मल्टीमर्स को अपने संभावित बड़े आकार और उनकी धीमी इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता के कारण जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा विश्लेषण करना मुश्किल है। हमारा प्रोटोकॉल प्लाज्मिड मल्टीमर्स की स्क्रीनिंग और पहचान के लिए एक सरल और सरल तरीका प्रदान करता है, जिसमें मैं कहूंगा कि कोई भी प्लाज्मिड तैयारी है। दृश्य प्लाज्मिड अणुओं के लिए क्षारीय लाइसिस का उपयोग करके 5 एमएल स्थिर रात ोंरात सेल संस्कृति से प्लाज्मिड निकालते हैं। कम कॉपी प्लाज्मिड का प्लास्मिड निष्कर्षण अक्सर मेजबान क्रोमोसोमल डीएनए के साथ संदूषण की ओर जाता है जिसे दृश्य से पहले पचाने की आवश्यकता होती है। क्रोमोसोमल डीएनए संदूषण को दूर करने के लिए प्लास्मिड-सुरक्षित के साथ निकाले गए प्लाज्मिड डीएनए का इलाज करें

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

डिजाइन और एक कम लागत का उपयोग, बैक्टीरिया की अनुकूली विकास के लिए एंटीबायोटिक दवा चयन के तहत स्वचालित Morbidostat

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

सूक्ष्मजीवों के अनुकूली प्रयोगशाला विकास के लिए प्रक्रिया एक Chemostat का प्रयोग

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL मैपिंग और सीआरआईएसपीआर / सीएस 9 में एक ड्रग प्रतिरोध जीन को पहचानने के लिए संपादन<em&gt; टोक्सोप्लाज्मा गोंडी</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

न्यूक्लियोटाइड एक्साइज मरम्मत में डीएनए घाव पहचान की परमाणु बल माइक्रोस्कोपी जांच

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

एंटीबायोटिक प्रतिरोध के विकास में Multicopy Plasmids की भूमिका का परीक्षण

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

जीनोम-Eukaryotic जीवों में प्रतिलेखन त्रुटियों की व्यापक निगरानी

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

उत्पादत्मक एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट्स के साथ P1 Transduction द्वारा ई कोलाई में जीन विलोपन का उत्पादन

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

रेनीफॉर्म नेमाटोड प्रतिरोध के लिए स्क्रीनिंग कपास जेनोटाइप्स

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Drosophila पुरुष सहायक Glands के माध्यमिक कोशिकाओं से आरएनए अलग करने के लिए एक FACS आधारित प्रोटोकॉल

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...