Name: quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach
Uploaded: 2019-12-14T14:00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach at JoVE.com

Ringraziamo Gor Margaryan per il supporto creativo e l'assistenza tecnica. Questo lavoro è stato sostenuto dal 2017/2018 (assegnato a TW) e dal programma di messa a fuoco del DFG 1819 (Grant No. DA1202/2-1 assegnato a TD).

1. Costruzione di un modello di plasmide che porta un gene di resistenza agli antibiotici
NOTA: Il ceppo Escherichia coli K-12 MG1655 è stato utilizzato come organismo modello in tutti gli esperimenti (DSM n. 18039, Collezione tedesca di microrganismi e colture cellulari, DSM). Durante la costruzione del plasmide è stato utilizzato il ceppo E. coli DH5-17.
<ol><li>PCR amplifica la spina dorsale plasmide di vostra scelta e amplificano il gene di resistenza tra cui la regione promotore da PCR (Figura 1).<ol>
<li>La PCR amplifica la spina dorsale plasmide utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà e le oligonucleotidi pBBR1_for (5'-GCGGCCGGGGCTCTCTCT-3') e pBBR1_rev (5'-TACCGGGCGGGCGCGTGACCC-3') sul modello pLC (GenBank acc. MH238456)18.</li>
		<li>PCR amplifica il gene di resistenza nptII, incluso il promotore nativo Tn5 19, utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà e oligonucleotidi nptII_gib_for (5'-GCGCCGGTAGATGCTGCTGTTGAAGCTTCGCTGCCGCA-3') e nptII_gib_rev (5'-CGGTCCGCCAAAGGAGGGAGAGAGAGAGAGA) Il gene nptII codifica per una fosfotransferasi neomicina e conferisce resistenza alla kanamicina. NOTA: Progettare i primer per il gene di resistenza con circa 20 bp di sequenza complementare alla spina dorsale plasmide che sarà fusa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pulire entrambi i frammenti PCR utilizzando un kit di vostra scelta.</li>
	<li>Unisciti al prodotto PCR genetico di resistenza agli antibiotici purificato (compresa la sua regione promotrice) alla spina dorsale del plasmid purificato e fusi le regioni omologhe utilizzando l'assemblaggio isotermico20, a 50 gradi centigradi per 60 min.</li>
	<li>Elettroporrate il prodotto fuso nel ceppo E. coli DH5.<ol>
<li>Introdurre 2 L del prodotto dal punto 1,3 a 40 - L di celle elettrocompetenti in cuvette da 2 mm a 4 e 2,5 kV. Risospendere le cellule in 1 mL di coetamina lisogena (LB).</li>
		<li>Trasferire il volume totale su un tubo di microfuge e incubare 1 h a 37 scosse a 250 rpm in uno shaker orbitale per consentire l'espressione del marcatore di resistenza sul plasmico.</li>
		<li>Piastra 100 -L delle cellule su piastre di agar LB contenenti l'antibiotico appropriato (kanamycin 25 g/mL) da selezionare per il gene di resistenza agli antibiotici e quindi selezionare per le cellule che trasportano il plasmide. Girare verso il basso il resto, rimuovere il supernatante, respendere le cellule in 100 LB e piastra su una piastra di agar selettivo. Incubare le piastre a 37 gradi centigradi per 24 ore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per verificare i cloni, estrarre i plasmidi costruiti tramite lis alcalina utilizzando un kit di mini-prep commerciale.<ol>
<li>Raccogliere 5 mL della coltura stazionaria durante la notte centrifugando a 12.000 x g a temperatura ambiente. Risospendere le cellule in soluzione di sospensione resuspension, quindi lisizzare e neutralizzare la soluzione cellulare. Centrifuga per 5 min a 12.000 x g.</li>
		<li>Trasferire il supernatante nella colonna di legame del DNA fornita nel kit e lavare la colonna due volte con 500 soluzione di lavaggio 2x prima di eluire la membrana della colonna con buffer di eluizione.</li>
		<li>Eseguire il sequenziamento Sanger del plasmide per confermare che la sequenza sia corretta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Una volta verificata la validità del plasmico, elettroporrate il plasmide (ora pCON) nel ceppo E. coli MG1655 come descritto sopra. Questo produce ceppo E. coli MG1655 pCON.</li>
</ol>2. Monitoraggio dei batteri che trasportano il plasmide in varie condizioni nel tempo
NOTA: L'esperimento di evoluzione è condotto con ceppi che trasportano plasmide in condizioni non selettive (supporti LB) in due temperature (37 e 20 gradi centigradi) e tre dimensioni di collo di bottiglia della popolazione. Il progetto sperimentale viene utilizzato per studiare la persistenza plasmide in varie condizioni.
<ol><li>Progettazione di un esperimento di evoluzione per seguire la frequenza plasmidnel tempo (Figura 2)<ol>
<li>Piastra il ceppo di plasmide costruito(E. coli MG1655 pCON) su piastre di agar LB completate con antibiotici (kanamycin 25 g/mL) e incubare per tutta la notte a 37 gradi centigradi.</li>
		<li>Preparare 96 piastre di pozzo profondo con 1 mL di lB medio in ogni pozzo. Come antenati batterici, scegli otto colonie isolate casuali dalla placca di agar in pozzi indipendenti. Preparare le piastre a 37 e 450 giri/min su uno shaker per 24 h. Preparare uno stock di glicerolo congelato dei cloni ancestrali.</li>
		<li>Il giorno successivo trasferire le otto popolazioni replicare in nuove piastre di pozzo profondo secondo il progetto sperimentale (Figura 2). Le impostazioni cultura sono diluite 1:100 (collo di bottiglia grande, L), 1:1,000 (collo di bottiglia medio, M) o 1:10.000 (piccolo collo di bottiglia, S) in un volume totale di 1 mL utilizzando PBS per la diluizione. Le colture diluite sono entrambe incubate a 37 e 20 gradi centigradi. NOTA: È molto importante controllare per la contaminazione incrociata nella piastra del pozzo 96-profondo. Così, utilizzare un disegno a scacchiera intercalare pozzi inoculati con supporto LB privo di batteri. Usa questo modello attraverso l'intero esperimento evolutivo.</li>
		<li>Ogni 12 h vengono trasferite le colture incubate a 37 gradi centigradi, mentre le culture a 20 gradi centigradi vengono trasferite ogni 24 ore su 24. NOTA: durante ogni evento di trasferimento viene applicato il trattamento delle dimensioni del collo di bottiglia e il trasferimento seriale viene ripetuto per un totale di 98 trasferimenti. Il numero di trasferimenti dipenderà dalla progettazione sperimentale dei lettori.</li>
		<li>Preparare regolarmente uno stock di glicerolo congelato di tutte le popolazioni, 2 volte a settimana.</li>
	</ol></li>
	<li>Monitoraggio della frequenza del plasmide mediante placcatura di replica (Figura 3) NOTA: Durante l'esperimento di evoluzione, la frequenza delle cellule che trasportano il plasmide nella popolazione è stimata dalla percentuale di ospiti. Il protocollo di placcatura di replica è illustrato nella Figura 3.<ol>
<li>Per determinare la frequenza plasmide nella popolazione durante l'esperimento di evoluzione, le colture stazionarie vengono diluite in serie e placcate su piastre di agar LB non selettive. Regolare la diluizione in base a una resa di 250-500 colonie per piastra. NOTA: Preparare piastre spesse di agar LB prima della placcatura (agar da 30 mL).</li>
		<li>Le popolazioni placcate vengono incubate per la crescita overnight in base alla loro temperatura di crescita nell'esperimento. NOTA: Le colonie devono essere piccole, quindi incubare <24 h a 37 .</li>
		<li>Dopo una crescita durante la notte, contare tutte le colonie utilizzando una stazione di conteggio delle colonie manuale o automatizzata e calcolare la dimensione totale della popolazione batterica nelle culture. NOTA: Le colonie sul bordo della piastra di agar non devono essere incluse nel numero totale di cellule batteriche.</li>
		<li>Sterilizzare pezzi quadrati (20 x 20 cm) di cotone velluto autoclaving. NOTA: Il panno di velluto deve essere 100% cotone per essere autoclavable. È importante asciugare il panno dopo la sterilizzazione.</li>
		<li>Dopo la sterilizzazione del panno di velluto, posizionare il panno su un blocco rotondo e fissarlo con un anello di metallo. È fondamentale evitare le rughe. Posizionare con cura il piatto con le colonie coltivate (agar rivolto verso il basso) sulla superficie fissa del tessuto di velluto. Assicurati che tutte le colonie tocchino la superficie di velluto toccando con cura il piatto Petri in modo circolare.</li>
		<li>Rimuovere con cura la piastra di agar LB e posizionare una piastra selettiva integrata con antibiotici (kanamycin 25 g/mL) sul panno di velluto. Assicurarsi che il piatto tocchi tutto il velluto toccando con attenzione il piatto Petri come descritto in precedenza. Successivamente, rimuovere la piastra. Lasciare le piastre a temperatura ambiente per la crescita notturna.</li>
		<li>Il giorno successivo, valutare sia la piastra di agar LB che la piastra selettiva. Le colonie che crescono sui mezzi selettivi sono conteggiate come ospiti plasmici (cioè resistenti agli antibiotici), mentre le macchie prive di colonie sono colonie prive di plasmide e quindi non sono resistenti all'antibiotico (cioè hanno perso il plasmide). Questo viene fatto posizionando le piastre l'una sull'altra e confrontando la crescita (cioè segnare eventuali colonie mancanti) e contando il numero di colonia su entrambe le piastre. Questo produce il numero di cellule che hanno perso il plasmide durante l'esperimento di evoluzione.</li>
		<li>Ripetere questa procedura lungo l'intero esperimento di evoluzione in modo regolare (ad esempio, ogni 14 trasferimenti).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Visualizzazione di multimeri plasmici con elettroforesi gel
NOTA: L'estrazione plasmide di plasmidi a bassa copia spesso porta alla contaminazione con DNA cromosomico ospite che deve essere enzimaticamente digerito prima della visualizzazione.
<ol><li>Estrarre il DNA plasmide da una coltura cellulare notturna stazionaria da 5 mL usando la lisi alcalina come descritto al punto 1.5.</li>
	<li>Successivamente, trattare il DNA del plasmide estratto con un DNase dipendente dall'ATP che taglia solo il DNA cromosomico per rimuovere la contaminazione cromosomica del DNA (vedere Tabella dei materiali). Incubare a 37 gradi centigradi per 30 min.</li>
	<li>Per creare molecole a cerchio aperto di tutte le conformazioni plasmiche (monomeri o multimeri), incubare i campioni di DNA plasmide con un enzima nicking (Nb.BsrDI) e incubare per 30 min a 65 gradi centigradi.</li>
	<li>Parallelamente, per creare molecole di plasmide lineari (cioè per il confronto delle dimensioni del plasmide), utilizzare un enzima di restrizione di vostra scelta (ad esempio, HindIII) che smiglia il plasmide una volta. NOTA: Questo si traduce in monomeri plasmici di DNA lineare. Le molecole di cerchio aperto non migrano in modo lineare.</li>
	<li>Per visualizzare le dimensioni e la conformazione del plasmide, elettroforizzare i campioni di DNA plasmico intatta e lineare per 120 min a 4,3 V/cm in un gel di agarose dell'1% (w/v) e un buffer TAE. I campioni sono macchiati di verde Midori e il gel viene visualizzato su un sistema di imaging gel (vedi Tabella dei materiali). Utilizzare una scala da 1 kbp.</li>
</ol>

<ol>
	<li>San Millan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+plasmid-mediated+antibiotic+resistance+in+the+clinical+context.">Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context.</a> Trends in Microbiology. 26 (12), 978-985 (2018).</li><li>Bruto, M., James, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+crassostreae,+a+benign+oyster+colonizer+turned+into+a+pathogen+after+plasmid+acquisition.">Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition.</a> The ISME Journal. 11 (4), 1043-1052 (2017).</li><li>von Wintersdorff, C. J. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo protocollo, presentiamo un approccio che combina tecniche in biologia molecolare, evoluzione sperimentale e visualizzazione del DNA per studiare il ruolo dell'evoluzione plasmide per la persistenza della resistenza agli antibiotici nei batteri. Anche se l'approccio presentato combina metodi provenienti da diverse aree di ricerca, tutte le tecniche applicate sono semplici e possono essere eseguite in un laboratorio di microbiologia standard.
I passaggi più critici del protocollo includono la costruzione del ceppo del sistema modello che include la convalida genetica del genotipo che trasporta il plasmide. In particolare, molti plasmidi codificano naturalmente i geni di resistenza agli antibiotici. Pertanto, il lettore può omettere il passaggio 1 del protocollo e procedere direttamente con il passaggio 2. Successivamente, gli esperimenti di evoluzione dovrebbero includere una progettazione casuale delle popolazioni replicate in modo che i risultati non siano preconcetti dalla posizione delle popolazioni replicate nella piastra del pozzo profondo. Inoltre, è particolarmente importante condurre con attenzione le fasi di trasferimento e diluizione seriale nell'esperimento di evoluzione in quanto la contaminazione falsificherebbe i risultati. Infine, la placcatura replica dovrebbe essere condotta con grande cura. Le grandi dimensioni della colonia possono essere un problema, ma può essere evitato incubando le piastre per meno di 24 h. Allo stesso modo, il numero di colonie su una piastra potrebbe inclinare i risultati della riplaccatura della replica. Pertanto, le popolazioni devono essere diluite prima della placcatura e della replica.
Uno dei maggiori vantaggi del nostro approccio è che può essere facilmente riprodotto senza la necessità di attrezzature pesanti. Inoltre, un altro vantaggio della placcatura replicaper seguire i geni marcatori è che vengono valutate solo le cellule vive, a differenza della citometria di flusso o del qPCR in cui le cellule morte possono essere valutate come vive. Così, la placcatura replica introduce meno distorsione al conteggio delle cellule che trasportano il plasmide. Tuttavia, una limitazione della placcatura replicapuò essere la dimensione della popolazione (cioè il numero di cellule) che è possibile valutare in una sola esecuzione sperimentale.
Utilizzando il nostro approccio, abbiamo recentemente dimostrato che l'evoluzione della stabilità plasmide potenzia la persistenza dei geni di resistenza agli antibiotici nei batteri. Così, abbiamo sviluppato un approccio come strumento per seguire la persistenza di resistenza plasmide mediata che è di grande importanza per seguire la resistenza nel tempo soprattutto in condizioni senza la presenza di antibiotici.

I plasmidi sono elementi genetici circolari e auto-replicanti che sono onnipresenti nei procadii. Sono agenti di trasferimento genico laterale, in quanto possono trasferire tratti tra le popolazioni microbiche, e quindi sono considerati un ruolo importante nell'evoluzione microbica. I plasmidi sono i motori di un rapido adattamento alle condizioni di limitazione della crescita in un breve periodo di tempo (ad esempio, in presenza di antibiotici o pesticidi1)e sono responsabili della transizione a lungo termine ad altre modalità di stile di vita (ad esempio, l'emergere di patogenicità2). Gli esempi più eclatanti per l'impatto dei plasmidi sul trasferimento dei geni sono documentati negli ecosistemi esposti a livelli fluttuanti di antibiotici, come cliniche mediche o in aziende industriali3. A causa della forte selezione positiva, molti plasmidi codificano per i geni di resistenza antimicrobica e spesso si trovano a conferire multiresistenza al loro ospite batterico. I plasmidi consentono la migrazione tra popolazioni o specie batteriche, con conseguente rapida propagazione di molteplici resistenze antimicrobiche. In condizioni non selettive i plasmidi non sono essenziali per la cellula e sono spesso anche indicati come elementi parassiti. Ciò nonostante, i plasmidi sono onnipresenti in natura e la loro evoluzione è altamente intrecciata con quella dei cromosomi batterici. La persistenza plasmide negli ambienti naturali (fluttuante e non selettiva) rimane poco conosciuta, ma è di grande importanza per la nostra comprensione della persistenza dei geni di resistenza agli antibiotici in natura.
L'evoluzione sperimentale è un potente strumento per lo studio delle popolazioni microbiche4. L'evoluzione sperimentale ha dimostrato che l'imposizione di una forte selezione per la manutenzione plasmide porta all'evoluzione compensativa (cioè adattiva) del plasmide o del cromosoma ospite che riduce il costo di fitness plasmide e, a sua volta, facilita l'abbondanza di plasmide (cioè, persistenza plasmida)5,6,7. Così, seguendo l'interazione plasmide-ospite nel tempo può rivelare importanti meccanismi di adattamento di entrambi gli elementi. Inoltre, l'evoluzione sperimentale permette di quantificare l'abbondanza di cellule che trasportano il plasmide nel tempo in varie condizioni8,9,10.
La persistenza plasmide negli esperimenti evolutivi può essere monitorata da diverse strategie, tra cui la citometria di flusso mediante lo smistamento fluorescente delle cellule attivate (FACS)11, la PCR quantitativa (qPCR)11o i metodi basati sulla coltivazione. La citometria di flusso richiede una macchina FACS e l'introduzione di un gene marcatore rilevabile (fluorescente), come la proteina fluorescente verde (GFP), sul plasma. Tuttavia, l'espressione GFP può alterare diverse proprietà cellulari e inoltre influenzare la posizione del plasmide nella cella12, che a sua volta può influenzare l'ereditarietà del plasmid durante la divisione cellulare. Un approccio qPCR per misurare l'abbondanza plasmide può essere fortemente di parte dal numero di copia del plasmide, che può variare notevolmente lungo la fase di crescita batterica e nel tempo13. Infine, un approccio basato sulla coltura e la placcatura richiede l'introduzione di un gene marcatore selezionabile. Questo può essere un gene di resistenza agli antibiotici, che è spesso codificato su plasmidi naturali; pertanto, non è necessaria alcuna manipolazione genetica. La resistenza agli antibiotici può essere seguita da un approccio tradizionale di placcatura di replica. Così, per studiare la dinamica del plasmide naturale, la placcatura replica è adatta per monitorare la risonanza antibiotica codificata plasmide14.
Per visualizzare le molecole di plasmide (ad esempio, per valutare le dimensioni del plasmide) possono essere applicati diversi metodi. Interi plasmidi possono essere amplificati utilizzando un approccio basato su PCR. Tuttavia, questo richiede la progettazione di primer specifici, che possono essere impegnativi durante un esperimento di evoluzione, perché la sequenza di plasmide può cambiare nel tempo. Inoltre, è difficile amplificare i multimeri plasmici in un approccio basato su PCR a causa di più siti di rilegatura per i primer PCR. Le molecole multimerico di plasmide possono apparire dopo la terminazione della replicazione plasmide o attraverso la ricombinazione di molecole di plasmide e sono per lo più orientate testa a coda15. Un altro approccio di visualizzazione plasmide combina la digestione enzimatica delle molecole di plasmide da parte di endonucleasi del DNA che si sciolgano o nick un filamento di DNA plasmide con analisi dell'elettroforesi da gel agarose. Lo stesso plasmide di diverse dimensioni (ad esempio, monomeri contro multimeri) si traduce in diverse mobilitazioni di gel che possono essere osservate durante la visualizzazione delle molecole di plasmide. Questo approccio consente la visualizzazione e la quantificazione di diverse conformazioni plasmiche (ad esempio, stati di multimerizzazione). La conformazione plasmide può essere utilizzata come indicatore di stabilità plasmide, poiché i multimeri plasmici vengono spesso persi durante la divisione cellulare16.
In un lavoro recente, abbiamo seguito la persistenza plasmide in condizioni che non erano selettive per l'abbondanza di plasmide (cioè senza selezione antibiotica). Abbiamo confrontato la persistenza plasmide a due temperature diverse (20 e 37 gradi centigradi) e tre dimensioni della popolazione (cioè i tassi di diluizione). L'applicazione di vari tassi di diluizione, o strozzature della popolazione, consente di sforare l'influenza delle dimensioni della popolazione sull'evoluzione batterica e plasmide. Sulla base dei nostri risultati, proponiamo che i plasmidi possano essere neutri per il loro ospite batterico e possano evolvere la stabilità senza alcuna pressione di selezione8. La stabilità plasmide evoluta è conferita dalla riduzione della formazione multimeforme plasmide8.
Qui, presentiamo un protocollo per la quantificazione della persistenza plasmide e lo studio dell'evoluzione plasmide per quanto riguarda il mantenimento dei geni di resistenza agli antibiotici. Il metodo ha diversi passaggi, tra cui l'inserimento di un gene di resistenza agli antibiotici in un modello di plasmide (che può essere omesso quando si utilizza un plasmide di resistenza naturale), seguito dall'uso di evoluzione sperimentale per valutare il potenziale del plasmide per persistere in condizioni non selettive, determinando la dinamica della frequenza del plasmide nel tempo utilizzando la placcatura replica, e l'analisi del genoma del plasmide per visualizzazione. Il protocollo qui descritto è stato progettato per studiare l'evoluzione e la persistenza dei plasmidi, ma può anche essere applicato per seguire l'evoluzione dei geni di resistenza cromosomica (o di altri geni marcatori) nel tempo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EN07.1</td>
			<td>2 ml, square</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates (cryo)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1702-8400</td>
			<td>Micro-Dilution Tube System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony counter</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SC6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton velvet</td>
			<td>drapery shop</td>
			<td></td>
			<td>100 % cotton required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652089</td>
			<td>0.1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Gel Extraction kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0832</td>
			<td>PCR fragment clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50125852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (plate shaker)</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaker)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052, 3125000028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Capp</td>
			<td>ME8-1250R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Eurofines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F533S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmidSafe enzyme</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>10059400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica block &#38; metal ring</td>
			<td>VWR</td>
			<td>601-3401</td>
			<td>PVC cylinder 69 mm; ring 102cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resctriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach

I plasmidi svolgono un ruolo importante nell'ecologia microbica e nell'evoluzione come veicoli di trasferimento genico laterale e serbatoi di funzioni genetiche accessorie nelle popolazioni microbiche. Ciò è particolarmente vero in ambienti in rapida evoluzione come la fluttuazione dell'esposizione agli antibiotici. Recentemente abbiamo dimostrato che i plasmidi mantengono i geni della resistenza agli antibiotici in Escherichia coli senza una selezione positiva per la presenza del plasmide. Qui descriviamo un sistema sperimentale che permette di seguire sia il genotipo plasmide che il fenotipo negli esperimenti di evoluzione a lungo termine. Utilizziamo tecniche molecolari per progettare un modello di plasmide che viene successivamente introdotto in un approccio sperimentale al sistema batch di evoluzione in un host di E. coli. Seguiamo la frequenza del plasmide nel tempo applicando la placcatura replica delle popolazioni di E. coli e quantificando la persistenza della resistenza agli antibiotici. Inoltre, monitoriamo la conformazione dei plasmidi nelle cellule ospiti analizzando l'estensione della formazione multimetale plasmide mediante nicking plasmide e elettroforesi gel agarose. Un tale approccio ci permette di visualizzare non solo la dimensione del genoma dei plasmidi in evoluzione, ma anche la loro conformazione topologica, un fattore molto importante per l'eredità plasmida. Il nostro sistema combina strategie molecolari con approcci microbiologicilogici tradizionali e fornisce un set-up per seguire i plasmidi nelle popolazioni batteriche per un lungo periodo di tempo. L'approccio presentato può essere applicato per studiare un'ampia gamma di elementi genetici mobili in futuro.

Qui, presentiamo un approccio allo studio dell'evoluzione plasmide quantificando la persistenza plasmide in una popolazione. In primo luogo, mostriamo come costruire il plasmide che trasporta il ceppo E. coli MG1655 pCON che viene successivamente introdotto in un esperimento di evoluzione. In secondo luogo, presentiamo un metodo semplice per seguire l'abbondanza di plasmid nelle popolazioni batteriche in evoluzione. Infine, mostriamo come visualizzare le dimensioni e la conformazione delle molecole di plasmide.
Nel nostro precedente lavoro8 utilizzando l'approccio presentato abbiamo condotto un esperimento evolutivo a seguito della persistenza di plasmidi di resistenza agli antibiotici in E. coli in assenza di antibiotici (Figura 4). I nostri risultati rappresentativi mostrano l'evoluzione delle popolazioni a 37 gradi centigradi e un tasso di diluizione di 10-4. Seguendo l'abbondanza di cellule che trasportano plasmide, abbiamo osservato una diminuzione delle cellule ospiti che trasportano il plasmide di frequenza nel tempo (Figura 4). Il nostro approccio ci ha permesso di scoprire che la perdita di plasmide è il risultato dell'architettura del genoma condensato del plasmide, che ha portato all'instabilità plasmide causata dai conflitti introdotti dalla trascrizione del gene di resistenza e dalla replicazione del plasmico stesso. La visualizzazione delle molecole di plasmide ci ha permesso di scoprire che questi conflitti hanno portato ad una conformazione plasmide instabile (cioè, formazione multimero plasmide, Figura 5). Tuttavia, abbiamo osservato un'evoluzione della stabilità plasmid senza l'esposizione agli antibiotici (Figura 4). La stabilità evoluta è stata conferita da una duplicazione intrinseca plasmide che ha abolito i conflitti trascrizione-replicazione e ha portato alla formazione di plasmidi ereditarie stabilmente. I nostri risultati dimostrano quindi l'importanza della ricombinazione e dell'amplificazione del genoma nell'evoluzione adattiva degli elementi genetici.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig1.jpg"> Figura 1: Progettazione Plasmid di pCON. Rappresentazione schematica della strategia di clonazione utilizzata per costruire il pCON plasmide. La spina dorsale plasmide (pBBR1) e il gene di resistenza agli antibiotici (nptII) sono PCR amplificati e fusi dalla fusione isotermica20. Questo produce il pCON plasmide e il ceppo MG1655 pCON. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig2.jpg"> Figura 2: Progettazione dell'esperimento di evoluzione a lungo termine. Rappresentazione schematica dell'esperimento di trasferimento seriale. Le popolazioni che trasportano il pLAsmide (pCON) sono placcate su supporti selettivi. Le colonie ancestrali vengono scelte casualmente dalla piastra e introdotte in un sistema di trasferimento seriale. I trasferimenti sono effettuati con tre diversi approcci di diluizione per simulare strozzature della popolazione di diverse dimensioni. Le diluizioni vengono ripetute in serie. L'esperimento è condotto in due regimi di temperatura. La frequenza plasmide-ospite viene misurata lungo l'esperimento tramite placcatura replica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig3.jpg"> Figura 3: placcatura di replica. Rappresentazione schematica dei passi utilizzati nella placcatura replicadica delle popolazioni batteriche. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig4.jpg"> Figura 4: Frequenza pCON rappresentativa nel tempo. La persistenza del pCON è indicata come la percentuale di host (popolazioni rappresentative di replica) durante l'esperimento di evoluzione. Per 98 trasferimenti, le popolazioni di pCON plasmide si sono evolute in condizioni non selettive con un fattore di diluizione di 10-4. Tutte le repliche che trasportano il pCON plasmide sono diminuite nella popolazione. Successivamente, le popolazioni sono state esposte agli antibiotici per l'incubazione durante la notte e sono state coltivate nuovamente in condizioni non selettive per testare l'evoluzione della stabilità plasmide. Questa cifra è stata modificata da Wein et al.8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig4large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig5.jpg"> Figura 5: Analisi rappresentativa della conformazione plasmica. Visualizzazione del modello plasmidp. Il visualizzato è il DNA plasmide non trattato direttamente dopo aver estratto, DNA plasmide linearizzato, e trattato con DNase che taglia solo il DNA cromosomico e il DNA enzimatico nick (cioè il DNA plasmico a cerchio aperto). Linearizzare il plasmide mostra che tutti i plasmidi sono della stessa dimensione. La rimozione del DNA cromosomico e il pCON nicking rivela la presenza di dimeri e altri multimer. Questa cifra è stata modificata da Wein etal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Il nostro approccio sperimentale fornisce una strategia per seguire l'abbondanza plasmide e la resistenza agli antibiotici nel tempo nelle popolazioni batteriche.

Quantificazione della resistenza agli antibiotici mediata da Plasmid in un approccio sperimentale all'evoluzione

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

I plasmidi sono elementi extracromosomiali che sono onnipresenti nella maggior parte delle specie batteriche e degli habitat in cui sono agenti molto importanti del trasferimento genico laterale in quanto possono migrare tra le cellule e tra le popolazioni. Uno degli esempi più sorprendenti e importanti di tale trasferimento è la diffusione di geni di resistenza agli antibiotici codificati sui plasmidi. Per costruire un modello plasmide che codifica un gene di resistenza agli antibiotici, scegli una spina dorsale plasmide e PCR amplifica la spina dorsale utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà e primer che si legano al modello plasmide. Nel nostro caso abbiamo usato una spina dorsale plasmide pBBR1. Successivamente, amplificare il gene di resistenza nptII incluso il promotore nativo Tn5 usando una polimerasi ad alta fedeltà. Progettare i primer per il gene di resistenza con circa 20 coppie di basi di complementarità di sequenza alla spina dorsale plasmide. Dopo i PCR, fondere la regione di omologia del prodotto PCR del gene di resistenza purificata alla spina dorsale plasmide purificata utilizzando l'assemblaggio isotermico a 50 gradi per 60 minuti. Trasforma il prodotto fuso in E.Coli DH5-Alpha usando l'elettroporazione. Piastra 100 microliter della miscela su mezzi selettivi e incubare a 37 gradi per circa 24 ore. Il plasmide può quindi essere estratto, convalidato e trasformato nel ceppo di tipo selvatico E.coli MG1655. Questo produce ceppo MG1655 pCON.Durante l'esposizione agli antibiotici, i batteri hanno bisogno del plasmide per sopravvivere. Pertanto, il plasmide è sotto selezione positiva. In condizioni non selettive, quindi senza antibiotici, il plasmide è usa e getta per la cellula. Lo scopo del nostro studio era quello di seguire i plasmidi in tali condizioni non selettive nel tempo. A questo scopo, abbiamo dotato i piccoli plasmidi di un gene di resistenza agli antibiotici e lo abbiamo introdotto a Escherichia coli. Abbiamo condotto un esperimento evolutivo e monitorato la frequenza dei plasmidi attraverso la placcatura della replica. Il ceppo di trasporto plasmide mg1655 pCON è ora introdotto in un esperimento di evoluzione. In primo luogo, piastra mg1655 pCON su piastre di agar LB integrate con antibiotici e incubare durante la notte a 37 gradi. Da questo piatto scegli casualmente le 8 colonie di antenati e incuba durante la notte a 37 gradi con scuotimenti costanti. Il giorno successivo, le popolazioni vengono trasferite all'esperimento condotto in 96 piastre di pozzi profondi. È molto importante distribuire casualmente le repliche attraverso la piastra. Ad esempio, in un approccio a scacchiera. Nel nostro esperimento le colture vengono diluite e trasferite con diversi tassi di diluizione e a due temperature. Durante ogni evento di trasferimento viene applicato il trattamento di diluizione e il trasferimento seriale viene ripetuto su un totale di 98 trasferimenti. Lungo l'esperimento evolutivo la frequenza dei plasmidi nella popolazione è stimata dalla proporzione di cellule portatrici di plasmidi. La placcatura a replica è stata reso popolare da Esther e Joshua Lederberg negli anni '50, dove l'hanno usata per studiare la resistenza ai farmaci nei batteri. Il metodo consentirà loro di migliorare la loro scansione per i fenotipi e alla fine dello studio ha rivelato che la resistenza alla penicillina può insorgere nei batteri a causa di mutazioni spontanee nel genoma. Per determinare la frequenza plasmide nella popolazione durante l'esperimento, le colture stazionarie vengono diluite in serie e placcate su piastre di agar LB non selettive. Regolare la diluizione in base a una resa da 250 a 500 colonie per piastra. Le popolazioni placcate vengono incubate per una crescita notturna a 37 gradi per meno di 24 ore. Le colonie sono meglio replicate quando sono ancora piccole. Dopo la crescita notturna contano tutte le colonie utilizzando un contatore di colonie automatizzato di scelta del lettore. Questo produce la dimensione totale della popolazione di batteri nelle colture. Si noti che le colonie sul bordo della piastra dovrebbero essere lasciate fuori. Per replicare le piastre, sono necessarie piastre di agar selettive integrate con antibiotici, un blocco rotondo, un anello metallico che si adatta al blocco e un panno di velluto sterile. Il panno deve essere 100% cotone in quanto questo può essere sterilizzato per autoclave. Posizionare il panno sul blocco e fissarlo con l'anello metallico.Posizionare con cura il piatto con le colonie contate sulla superficie fissa del panno di velluto. Toccare la piastra nei movimenti del cerchio in modo che tutta la superficie della piastra tocchi il panno. È molto importante che tutte le colonie tocchino il velluto. Rimuovere la piastra LB e posizionare la piastra selettiva sul velluto. Ripetere l'attenta maschiatura. È ancora una volta importante che il piatto tocchi completamente il velluto. Successivamente, rimuovere la piastra selettiva. Le piastre vengono incubate a temperatura ambiente durante la notte. Il giorno successivo, sia l'LB che la piastra degli antibiotici sono necessari per la valutazione. Posizionare le piastre una sopra l'altra e confrontare la crescita. Puoi facilmente individuare spazi senza colonie. Queste sono le colonie che non sono resistenti agli antibiotici. Pertanto, queste colonie hanno perso il plasmide. Alla fine, segna quante colonie mancano sulla piastra degli antibiotici. Questo numero ti dà la perdita di plasmide. Ripeti settimanalmente la placcatura replica di tutte le popolazioni durante l'esperimento di evoluzione. La perdita di plasmide può essere causata da multi-malformazione plasmide. Quando si lavora su una costruzione plasmide dire per l'espressione di un dato gene nel ceppo ospite preferito il comportamento nativo di un plasmide in vivo per quanto riguarda la conferma che uno stato può prendere è di solito qualcosa che viene trascurato. Ma in un contesto evolutivo tale conferma dei cambiamenti potrebbe essere di grandissimo importanza. L'analisi delle conferme plasmidiche può essere uno sforzo molto complicato. Soprattutto i multimeri plasmidici sono difficili da analizzare perché non possono essere identificati correttamente dalla PCR o dal sequenziamento. D'altra parte, i multimeri plasmidici sono difficili da analizzare per elettroforesi gel a causa delle loro dimensioni potenzialmente grandi e della loro lenta mobilità elettroforetica. Il nostro protocollo offre un metodo semplice e diretto per lo screening e l'identificazione di multimeri plasmidici in direi qualsiasi preparazione plasmide. Alle molecole plasmidiche visive estrarre il plasmide da 5 mL di coltura cellulare stazionaria durante la notte usando lisi alcalina. L'estrazione plasmide di plasmidi a bassa copia spesso porta alla contaminazione con DNA cromosomico ospite che deve essere digerito prima della visualizzazione. Per rimuovere la contaminazione cromosomica del DNA trattare il DNA plasmide estratto con Plasmid-Safe

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