Name: quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach
Uploaded: 2019-12-14T14:00:00
Duration: 12 min 32 s
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私たちは、創造的なサポートと技術支援のためのゴー・マルガリアンに感謝します。この作品は、ZMBヤングサイエンティストグラント2017/2018(TWに授与)とDFGフォーカスプログラム1819(グラント番号)によってサポートされました。DA1202/2-1 は TD に授与されます)。

1. 抗生物質耐性遺伝子を担持するモデルプラスミドの構築
注:株大腸菌K-12 MG1655は、すべての実験でモデル生物として使用されました(DSM No. 18039,微生物および細胞培養物のドイツコレクション、DSMZ)。株大腸菌DH5α17はプラスミド構築時に用いた。
<ol><li>PCRは、お好みのプラスミド骨格を増幅し、PCRによるプロモーター領域を含む耐性遺伝子を増幅する(図1)。<ol>
<li>PCRは、プラスミドテンプレートpLC上の高忠実度ポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドpBBR1_for(5'-GCGGCCCTCTCT-3')およびpBBR1_rev(5'-TACCGGCGCGTCUCUGT-3')を用いてプラスミド骨格を増幅する(GenBank acc.MH238456)18.</li>
		<li>PCRは、高忠実度ポリメラーゼおよびオリゴヌクレオチドnptII_gib_forを用いた天然Tn5プロモーター19を含む耐性遺伝子nptIIを増幅する(5'-GCGCGGTAGCTCTCTCTTGTTTGTCTCTCTCACGCGCGCA-3')およびnptII_gib_rev(5'-CGGGGGCCCCAAAAGGCGTGTGTGTCGTCGTCGTCGAGAnptII遺伝子はネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードし、カナマイシンに対する耐性を付与する。 注:融合するプラスミド骨格に対して約20bpの相補配列を有する耐性遺伝子のプライマーを設計する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>お好みのキットを使用して、両方のPCRフラグメントをクリーニングします。</li>
	<li>精製された抗生物質耐性遺伝子PCR産物(そのプロモーター領域を含む)を精製プラスミド骨格に結合し、等温アセンブリ20を使用して相同領域を融合し、50°Cで60分間。</li>
	<li>融合した生成物を株大腸菌DH5αに電気電融合する。<ol>
<li>ステップ1.3から40°Lの電気コンビテントセルに2μLの製品を4°Cおよび2.5 kVで導入します。リソジェニーブロス(LB)培地の1 mLで細胞を再サスペンドする。</li>
		<li>全容積をマイクロファジチューブに移し、軌道シェーカーで250rpmで37°Cの揺れで1時間をインキュベートし、プラスミド上の抵抗マーカーの発現を可能にする。</li>
		<li>適切な抗生物質(カナマイシン25μg/mL)を含むLB寒天プレート上の細胞のプレート100μLは、抗生物質耐性遺伝子を選択し、したがってプラスミド担持細胞を選択する。残りをスピンダウンし、上清を取り除き、セルを100μL LBで再サスペンドし、選択的寒天プレート上にプレートを取り付けます。プレートを37°Cで24時間インキュベートします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>クローンを検証するために、市販のミニプレップキットを使用してアルカリ性リシスを介して構築されたプラスミドを抽出します。<ol>
<li>室温で12,000×gで遠心分離することにより静止した一晩培養の収穫5mL。 再懸濁液中の細胞を再懸濁し、次いで細胞溶液を溶解して中和する。12,000 x gで 5 分間遠心分離機 .</li>
		<li>キットに付属のDNA結合カラムに上清を移し、カラム膜を溶出緩衝液で溶出する前に、500μL洗浄液遠心分離液でカラムを2回洗浄します。</li>
		<li>プラスミドのサンガーシーケンシングを実行し、配列が正しいことを確認します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プラスミドの有効性が検証されると、上述したようにプラスミド(現在のpCON)を株大腸菌MG1655に電気ポパレートする。これは、株大腸菌MG1655 pCONを生じさせます。</li>
</ol>2. 時間の経過につながった様々な条件下でプラスミドを運ぶ細菌をモニタリングする
注:進化実験は、2つの温度(37°Cと20°C)と3つの集団ボトルネックサイズで非選択的条件(LB媒体)下でプラスミド担持株を使用して行われます。実験計画は、様々な条件下でプラスミド持続性を研究するために使用されます。
<ol><li>時間の経過に従うプラスミド周波数に従う進化実験の設計 ( 図 2 )<ol>
<li>抗生物質(カナマイシン25μg/mL)を補充したLB寒天プレートに構築されたプラスミド運搬株(大腸菌MG1655 pCON)をプレートし、37°Cで一晩インキュベートします。</li>
		<li>各井戸に1 mLのLB培地を備えた96の深井戸プレートを用意します。細菌の祖先として、独立した井戸の寒天プレートから8つのランダムに分離されたコロニーを選びます。プレートシェーカーの37°Cと450 rpmでプレートを24時間インキュベートし、祖先クローンの冷凍グリセロールストックを準備します。</li>
		<li>翌日、実験計画に従って8つの反復母集団を新しい深井戸プレートに移す(図2)。カルチャは、希釈に PBS を使用して 1:100 (大きなボトルネック、L)、1:1,000 (中程度のボトルネック、M)、または 1:10,000 (小さなボトルネック、S) の合計ボリュームで希釈されます。希釈した培養物はいずれも37°Cおよび20°Cでインキュベートされる。 注:96深井戸プレートのクロスコンタミネーションを制御することが非常に重要です。したがって、細菌のないLB培地と接種した井戸をインターカレートすることにより、チェッカーボードプレートの設計を使用してください。進化実験全体を通してこのパターンを使用します。</li>
		<li>37°Cでインキュベートされた培養物は12時間ごとに移され、20°Cの培養物は24時間ごとに転写されます。 注: 転送イベントごとにボトルネック サイズ処理が適用され、シリアル転送が合計 98 回の転送で繰り返されます。転送の数は、読者の実験計画によって異なります。</li>
		<li>すべての人口の冷凍グリセロールストックを定期的に、週に2倍準備します。</li>
	</ol></li>
	<li>レプリカめっきによるプラスミド周波数のモニタリング (図 3) 注:進化実験では、集団中のプラスミド担持細胞の頻度は宿主の割合から推定される。レプリカめっきプロトコルを図 3に示します。<ol>
<li>進化実験中に集団中のプラスミド頻度を決定するために、静止培養物を連続的に希釈し、非選択的LB寒天プレート上でめっきする。プレートあたり250-500コロニーの収率に応じて希釈を調整します。 メモ:めっき前に厚いLB寒天プレート(約30mL寒天)を準備します。</li>
		<li>めっきされた集団は、実験における成長温度に応じて一晩の成長のためにインキュベートされる。 注:コロニーは小さく、したがって37°Cで<24時間をインキュベートする必要があります。</li>
		<li>一晩の成長の後、手動または自動化されたコロニーカウントステーションを使用してすべてのコロニーをカウントし、培養中の総細菌集団サイズを計算します。 注:寒天プレートの端にあるコロニーは、細菌細胞の総数に含めないでください。</li>
		<li>オートクレーブで綿のベルベットの正方形の部分(〜20 x 20 cm)を殺菌します。 注:ベルベットの布は、オートクレーブ可能にするために綿100%である必要があります。殺菌後に布を乾かすことが重要です。</li>
		<li>ベルベットの布を殺菌した後、丸いブロックに布を置き、金属リングで固定します。しわを避けることは非常に重要です。成長したコロニー(寒天が下を向いている)でプレートを固定ベルベットの布の表面に慎重に置きます。すべてのコロニーが慎重に円形の方法でペトリ皿をタップしてベルベットの表面に触れることを確認してください。</li>
		<li>LB寒天プレートを慎重に取り除き、抗生物質(カナマイシン25μg/mL)を補充した選択プレートをベルベットの布の上に置きます。前に説明したように、ペトリ皿を丁寧にタップして、プレートがすべてのベルベットに触れていることを確認してください。その後、プレートを取り外します。プレートは室温にしておくと、一晩の成長を得ます。</li>
		<li>翌日、LB寒天板と選択板の両方を評価する。選択的媒体上で増殖するコロニーはプラスミド宿主(すなわち、抗生物質耐性)としてカウントされ、コロニーフリースポットはプラスミドフリーであり、したがって抗生物質に対して耐性を持たないコロニーである(すなわち、プラスミドを失った)。これは、プレートを互いに置き、成長を比較し(すなわち、欠落しているコロニーをマーク)、両方のプレートにコロニー番号をカウントすることによって行われます。これは、進化実験中にプラスミドを失った細胞の数を生じる。</li>
		<li>進化実験全体に沿って、通常の方法(例えば、14回の転送ごと)に沿ってこの手順を繰り返します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. ゲル電気泳動を用いたプラスミド多量体の可視化
注:低コピープラスミドのプラスミド抽出は、多くの場合、可視化の前に酵素的に消化する必要がある宿主染色体DNAによる汚染につながります。
<ol><li>ステップ1.5に記載のアルカリ性リシスを用いて5mLの定常細胞培養物からプラスミドDNAを抽出する。</li>
	<li>その後、抽出したプラスミドDNAをATP依存性DNaseで処理し、染色体DNAを切断するだけで染色体DNA汚染を除去します(材料表を参照)。37°Cで30分間インキュベートし、その後、お好みのキットを使用してDNAをきれいにします。</li>
	<li>すべてのプラスミド立体構造(モノマーまたはマルチマー)の開いた円分子を作成するには、ニッキング酵素(Nb.BsrDI)を用いてプラスミドDNAサンプルをインキュベートし、65°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>並行して、直鎖状プラスミド分子(すなわち、プラスミドサイズ比較の場合)を作成するには、プラスミドを一度切断する任意の制限酵素(例えば、ヒンドIII)を使用する。 注:これは、線形DNAプラスミドモノマーをもたらす。開いた円分子は直線的に移動しません。</li>
	<li>プラスミドサイズと立体構造を可視化するために、エレクトロフェラーゼは、1%(w/v)アガロースゲルおよび1×TAE緩衝液中の4.3V/cmで120分間、ニックおよびリニアプラスミドDNAサンプルを120分間採取した。サンプルはみどり緑色で染色され、ゲルイメージングシステムでゲルを可視化します(材料表を参照)。1 kbp のラダーを使用します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>San Millan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+plasmid-mediated+antibiotic+resistance+in+the+clinical+context.">Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context.</a> Trends in Microbiology. 26 (12), 978-985 (2018).</li><li>Bruto, M., James, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+crassostreae,+a+benign+oyster+colonizer+turned+into+a+pathogen+after+plasmid+acquisition.">Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition.</a> The ISME Journal. 11 (4), 1043-1052 (2017).</li><li>von Wintersdorff, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer.">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (110), 305-310 (2016).</li><li>Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+and+the+dynamics+of+adaptation+and+genome+evolution+in+microbial+populations.">Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations.</a> ISME Journal. 11 (10), 2181-2194 (2017).</li><li>De Gelder, L., Williams, J. J., Ponciano, J. E. M., Sota, M., Top, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+plasmid+evolution+results+in+host-range+expansion+of+a+broad-host-range+plasmid.">Adaptive plasmid evolution results in host-range expansion of a broad-host-range plasmid.</a> Genetics. 178 (4), 2179-2190 (2008).</li><li>Harrison, E., Guymer, D., Spiers, A. J., Paterson, S., Brockhurst, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+compensatory+evolution+stabilizes+plasmids+across+the+parasitism-mutualism+continuum.">Parallel compensatory evolution stabilizes plasmids across the parasitism-mutualism continuum.</a> Current Biology. 25 (15), 2034-2039 (2015).</li><li>Bouma, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+bacteria/plasmid+association.">Evolution of a bacteria/plasmid association.</a> Nature. 335 (6188), 351-352 (1988).</li><li>Wein, T., H&#252;lter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+plasmid+stability+under+nonselective+conditions+maintains+antibiotic+resistance.">Emergence of plasmid stability under nonselective conditions maintains antibiotic resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 2595 (2019).</li><li>Loftie-Eaton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+mutations+improve+general+permissiveness+to+antibiotic+resistance+plasmids.">Compensatory mutations improve general permissiveness to antibiotic resistance plasmids.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1 (9), 1354-1363 (2017).</li><li>Millan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+and+compensatory+adaptation+interact+to+stabilize+non-transmissible+plasmids.">Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible plasmids.</a> Nature Communications. 5 (1), 1-11 (2014).</li><li>Loftie-Eaton, W., Tucker, A., Norton, A., Top, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+real-time+quantitative+PCR+as+tools+for+assessing+plasmid+persistence.">Flow cytometry and real-time quantitative PCR as tools for assessing plasmid persistence.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5439-5446 (2014).</li><li>M&#252;nch, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+fixation+of+plasmids+during+recombinant+protein+production+in+Bacillus+megaterium+results+in+population+heterogeneity.">Polar fixation of plasmids during recombinant protein production in Bacillus megaterium results in population heterogeneity.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (17), 5976-5986 (2015).</li><li>Jahn, M., Vorpahl, C., H&#252;bschmann, T., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variability+of+expression+plasmids+determined+by+cell+sorting+and+Droplet+Digital+PCR.">Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR.</a> Microbial Cell Factories. 15 (1), 211 (2016).</li><li>Lederberg, J., Lederberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants.">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> Journal of Bacteriology. 63, 399-406 (1952).</li><li>Summers, D. K., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimerization+of+high+copy+number+plasmids+causes+instability:+ColE1+encodes+a+determinant+essential+for+plasmid+monomerization+and+stability.">Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability.</a> Cell. 36 (4), 1097-1103 (1984).</li><li>Summers, D. K., Beton, C. W., Withers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicopy+plasmid+instability:+the+dimer+catastrophe+hypothesis.">Multicopy plasmid instability: the dimer catastrophe hypothesis.</a> Molecular Microbiology. 8 (6), 1031-1038 (1993).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Ilhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregational+drift+and+the+interplay+between+plasmid+copy+number+and+evolvability.">Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability.</a> Molecular Biology and Evolution. 36 (3), 472-486 (2019).</li><li>Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. A., Reiss, B., Schaller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+and+exact+localization+of+the+neomycin+phosphotransferase+gene+from+transposon+Tn5.">Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5.</a> Gene. 19 (3), 327-336 (1982).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li></ol>

著者たちは何も開示する必要はない。

このプロトコルでは、分子生物学、実験進化、DNA可視化の技術を組み合わせて、細菌における抗生物質耐性の持続性に対するプラスミド進化の役割を調べるアプローチを提示する。提示されたアプローチは、異なる研究分野からの方法を組み合わせたが、適用されるすべての技術は簡単であり、標準的な微生物学の実験室で行うことができる。
プロトコルの最も重要なステップは、プラスミドを運ぶ遺伝子型の遺伝的検証を含むモデルシステム株の構築を含む。特に、多くのプラスミドは抗生物質耐性遺伝子を自然にコードする。したがって、読者はプロトコルのステップ1を省略し、直接ステップ2に進む。次に、進化実験には、深井戸プレート内の反復母集団の位置によって結果が偏らないように、反復母集団のランダムな計画を含める必要があります。さらに、汚染が結果を改ざんするので、進化実験でシリアル転送と希釈ステップを慎重に行うことが特に重要です。最後に、レプリカめっきは細心の注意を払って行う必要があります。大きなコロニーサイズが問題になる場合がありますが、プレートを24時間未満でインキュベートすることで回避できます。同様に、1 つのプレート上のコロニーの数は、レプリカめっき結果に偏る可能性があります。したがって、めっきおよび複製の前に母集団を希釈する必要があります。
私たちのアプローチの最大の利点の一つは、重機を必要とせずに簡単に再現できることです。さらに、マーカー遺伝子に従うレプリカめっきのもう一つの利点は、死細胞が生きていると評価され得るフローサイトメトリーまたはqPCRとは対照的に、生細胞のみが評価されるということである。したがって、レプリカめっきはプラスミド担持細胞の計数に対する偏りが少なくなる。それにもかかわらず、レプリカめっきの1つの制限は、1回の実験実行で評価することができる母集団サイズ(すなわち、セル数)であり得る。
我々のアプローチを用いて、我々は最近、プラスミド安定性の進化が細菌の抗生物質耐性遺伝子の持続性を増強することを示した。そこで、特に抗生物質の存在のない条件下で、時間の経過とともに抵抗性に従うことの重要性が高いプラスミド媒介性耐性持続性に従うツールとしてのアプローチを開発しました。

プラスミドは、原核生物に普遍的である円形の自己複製遺伝的要素である。それらは微生物集団間で形質を移すことができるので、横遺伝子導入の薬剤であり、微生物の進化において大きな役割を果たすと考えられている。プラスミドは、短時間(例えば、抗生物質または農薬1の存在下で)の成長制限条件への迅速な適応の促進剤であり、他の生活様式への長期的な移行(例えば、病原性2の出現)を担っている。プラスミドが遺伝子の転移に及ぼす影響に関する最も顕著な例は、診療所や工業農場3などの抗生物質の変動レベルにさらされる生態系に文書化されている。強い肯定的な選択のために、多くのプラスミドは抗菌性遺伝子をコードし、しばしばその細菌宿主に多耐性を付与することが発見される。プラスミドは、集団または細菌種間の移動を可能にし、複数の抗菌性の急速な伝播をもたらす。非選択的条件下では、プラスミドは細胞に必須ではなく、しばしば寄生要素とも呼ばれます。それにもかかわらず、プラスミドは自然界で普遍的であり、その進化は細菌染色体の進化と非常に絡み合っている。自然環境におけるプラスミドの持続性(変動および非選択的)は未理解のままであるが、自然界における抗生物質耐性遺伝子の持続性を理解する上で非常に重要である。
実験進化は、微生物集団4の研究のための強力なツールです。実験的進化は、プラスミド維持のための強い選択を課すことは、プラスミドフィットネスコストを削減するプラスミドまたは宿主染色体の補償(すなわち適応的)進化につながり、ひいてはプラスミドの存在量(すなわち、プラスミド持続性)5、6、7を促進することを実証した。したがって、時間の経過とともにプラスミドホスト相互作用に従って、両方の要素の適応の重要なメカニズムを明らかにし得る。さらに、実験的進化により、様々な条件下で時間をかけてプラスミド担持細胞の存在量を定量化することが可能である。
進化実験におけるプラスミド持続性は、蛍光活性化細胞選別(FACS)11、定量PCR(qPCR)11、または栽培ベースの方法によるフローサイトメトリーを含むいくつかの戦略によって監視することができる。フローサイトメトリーは、FACSマシンと、プラスミド上に緑色蛍光タンパク質(GFP)などの検出可能な(蛍光)マーカー遺伝子を導入する必要があります。しかしながら、GFP発現は、いくつかの細胞特性を変化させ、さらに細胞12内のプラスミド位置に影響を及ぼし、細胞分裂中のプラスミド遺伝に影響を及ぼす可能性がある。プラスミドの存在量を測定するqPCRアプローチは、細菌の増殖期および時間の経過とともに大きく変化し得るプラスミドコピー数によって非常に偏っている可能性がある。最後に、培養およびめっきアプローチでは、選択可能なマーカー遺伝子の導入が必要です。これは、多くの場合、天然プラスミドにコードされる抗生物質耐性遺伝子である可能性があります。したがって、遺伝子操作は必要ありません。抗生物質耐性は、従来のレプリカめっきアプローチに続いて行ってもよい。従って、天然プラスミドダイナミクスを研究するために、レプリカめっきは、プラスミドコードされた抗生物質再和性14を監視するのに適している。
プラスミド分子を可視化するために(例えば、プラスミドサイズを評価するために)、いくつかの方法が適用され得る。全体のプラスミドは、PCRベースのアプローチを使用して増幅することができる。しかし、プラスミド配列は時間の経過とともに変化する可能性があるため、進化実験中に困難な特定のプライマーの設計が必要です。さらに、PCRプライマーに対する複数の結合部位に起因するPCRベースのアプローチにおいてプラスミド多マーを増幅することは困難である。多量体プラスミド分子は、プラスミド複製終了後またはプラスミド分子の再結合を介して現れることができ、主に頭部から尾部15に配向される。プラスミド可視化のもう一つのアプローチは、アガロースゲル電気泳動解析でプラスミドDNA鎖を切断またはニックするDNAエンドヌクレアーゼによるプラスミド分子の酵素消化を組み合わせたものです。異なるサイズの同じプラスミド(例えば、モノマー対多量体)は、プラスミド分子を可視化する際に観察することができる異なるゲル移動性をもたらす。このアプローチにより、異なるプラスミド立体構造(すなわち多量化状態)の可視化と定量が可能になります。プラスミド立体構造は、プラスミド多量体が細胞分裂16の間に頻繁に失われるので、プラスミド安定性の指標として使用され得る。
最近の研究では、プラスミドの存在量に対して選択的でない条件でプラスミド持続性を追跡した(すなわち、抗生物質の選択なし)。2つの異なる温度(20°Cおよび37°C)と3つの集団サイズ(すなわち希釈率)でプラスミド持続性を比較した。様々な希釈率、または集団ボトルネックを適用することで、細菌およびプラスミドの進化に対する集団サイズの影響を調査することができます。我々の結果に基づいて、我々は、プラスミドが細菌宿主に中立であり、任意の選択圧力8なしで安定性を進化させることができることを提案する。進化したプラスミド安定性は、プラスミド多量体形成8の減少によって与えられる。
ここでは、抗生物質耐性遺伝子の維持に関するプラスミド持続性の定量とプラスミド進化の調査に関するプロトコルを提示する。この方法には、モデルプラスミドへの抗生物質耐性遺伝子の挿入(天然抵抗プラスミドを使用する場合は省略可能)を含むいくつかのステップがあり、続いて、プラスミドが持続する可能性を評価するための実験的進化の使用非選択的条件下では、レプリカめっきを用いて時間の経過とともにプラスミド周波数ダイナミクスを決定しながら、および可視化によるプラスミドゲノムの解析を行った。ここで説明するプロトコルは、プラスミドの進化と持続性を調べるために設計されたが、染色体耐性遺伝子(または他のマーカー遺伝子)の進化に時間の経過とともに適用されることもある。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EN07.1</td>
			<td>2 ml, square</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates (cryo)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1702-8400</td>
			<td>Micro-Dilution Tube System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony counter</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SC6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton velvet</td>
			<td>drapery shop</td>
			<td></td>
			<td>100 % cotton required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652089</td>
			<td>0.1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Gel Extraction kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0832</td>
			<td>PCR fragment clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50125852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (plate shaker)</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaker)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052, 3125000028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Capp</td>
			<td>ME8-1250R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Eurofines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F533S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmidSafe enzyme</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>10059400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica block &#38; metal ring</td>
			<td>VWR</td>
			<td>601-3401</td>
			<td>PVC cylinder 69 mm; ring 102cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resctriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach

プラスミドは、微生物集団における横遺伝子移動および付属遺伝子機能の貯蔵所の車両として、微生物生態学および進化において大きな役割を果たしている。これは特に、抗生物質暴露の変動など、急速に変化する環境下でのケースです。我々は最近、プラスミドがプラスミド存在に対して肯定的な選択なしに大腸菌の抗生物質耐性遺伝子を維持することを示した。ここでは、長期進化実験においてプラスミド遺伝子型と表現型の両方を追従できる実験システムについて述べる。分子技術を用いて、大腸菌宿主の実験的進化バッチシステムアプローチに導入されるモデルプラスミドを設計する。抗生物質耐性持続性を定量しながら、大腸菌集団のレプリカめっきを適用することにより、時間の経過とともにプラスミド周波数を追う。また、プラスミドニッキングとアガロースゲル電気泳動によるプラスミド多量体形成の程度を解析することにより、宿主細胞におけるプラスミドの立体構造をモニタリングします。このようなアプローチにより、進化するプラスミドのゲノムサイズだけでなく、その位相的立体構造を可視化し、プラスミド継承にとって非常に重要な因子を可視化することができます。当社のシステムは、従来の微生物学のアプローチと分子戦略を組み合わせ、長い時間をかけて細菌集団のプラスミドに従うセットアップを提供します。提示されたアプローチは、将来的にモバイル遺伝的要素の広い範囲を研究するために適用することができます。

ここでは、集団におけるプラスミド持続性を定量することにより、プラスミド進化を研究するアプローチを提示する。まず、その後進化実験に導入される大腸菌株MG1655 pCONを担持するプラスミドの構築方法を示す。第二に、進化する細菌集団におけるプラスミドの存在量に従う簡単な方法を提示する。最後に、プラスミド分子の大きさと立体構造を可視化する方法を示します。
提示されたアプローチを用いた前回の研究8では、抗生物質がない大腸菌における抗生物質耐性プラスミドの持続性に続く進化実験を行った(図4)。私たちの代表的な結果は、37°Cでの集団の進化と10-4の希釈率を示しています。プラスミド担持細胞の豊富さに続いて、時間の経過とともにプラスミド担持宿主細胞の頻度の減少を観察した(図4)。我々のアプローチは、プラスミド損失が凝縮されたプラスミドゲノムアーキテクチャの結果であり、抵抗遺伝子の転写とプラスミド自体の複製によって引き起こされる紛争によって引き起こされるプラスミド不安定性をもたらしたことを発見した。プラスミド分子を可視化することで、これらの紛争が不安定なプラスミド立体構造につながったことが分かりました(すなわち、プラスミド多形形成、図5)。それにもかかわらず、抗生物質にさらされることなくプラスミド安定性の進化を観察した(図4)。進化した安定性は、転写複製の競合を廃止し、安定的に継承されたプラスミドの形成につながったプラスミド本質的な重複によって与えられた。我々の結果は、遺伝的要素の適応進化における組換えとゲノム増幅の重要性を示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig1.jpg"> 図1:pCONのプラスミド設計プラスミドpCONの構築に用いられるクローニング戦略の概略表現。プラスミド骨格(pBBR1)および抗生物質耐性遺伝子(nptII)は、等温融合20によってPCR増幅および融合される。これはプラスミドpCONおよび株MG1655 pCONを生み出す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig1large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig2.jpg"> 図2:長期進化実験の設計シリアル転送実験の概略表現。プラスミド運搬(pCON)集団は、選択的媒体上でめっきされる。祖先のコロニーは版からランダムに選ばれ、シリアル転送システムに導入される。転送は、異なるサイズの人口ボトルネックをシミュレートするために、3つの異なる希釈アプローチで行われます。希釈は連続的に繰り返される。実験は2つの温度体制で行われる。プラスミドホスト周波数は、レプリカめっきを介して実験に沿って測定されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig2large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig3.jpg"> 図 3: レプリカメッキ細菌集団のレプリカめっきに用いられる工程の概略表現。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig4.jpg"> 図 4: 代表的な pCON 周波数を経時に示す。pCON持続性は、進化実験中のホスト(代表的な反復集団)の割合として示される。98の転移の場合、pCONプラスミド集団は10-4の希釈因子を有する非選択的条件下で進化した。プラスミドpCONを運ぶすべての複製は、集団で減少した。その後、集団は一晩インキュベーションのために抗生物質にさらされ、プラスミド安定性の進化をテストするために非選択的条件下で再び栽培された。この図は Wein et al.8から変更されています<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig4large.jpg" target="_blank">。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig5.jpg"> 図5:プラスミド立体構造の代表的な分析モデルプラスミドpCONの可視化。可視化されるのは、抽出直後に未処理のプラスミドDNAを、リニアライズしたプラスミドDNAであり、染色体DNAと酵素的にニックされたDNA(すなわち、オープンサークルプラスミドDNA)のみを切断するDNaseで処理される。プラスミドを線形化すると、すべてのプラスミドが同じ大きさであることを示す。染色体DNAおよびニッキングpCONを除去することはダイマーおよび他の多量体の存在を明らかにする。この図は Wein ら8から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

私たちの実験的アプローチは、細菌集団における時間の経過とともにプラスミドの豊富さと抗生物質耐性に従う戦略を提供します。

実験的進化論におけるプラスミド媒介抗生物質耐性の定量化

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

プラスミドは、細胞間および集団間を移動することができるので、横遺伝子導入の非常に重要な薬剤であるほとんどの細菌種および生息地でユビキタスである染色体外要素である。このような転移の最も顕著かつ顕著な例の1つは、プラスミドにコードされる抗生物質耐性遺伝子の普及である。抗生物質耐性遺伝子をコードするプラズミドを構築するには、プラスミド骨格を選択し、プラスミドテンプレート上に結合する高忠実度ポリメラーゼおよびプライマーを使用して骨格を増幅します。我々の場合、pBBR1プラスミド骨格を使用した。次に、高忠実度ポリメラーゼを用いて天然Tn5プロモーターを含む抵抗性遺伝子nptIIを増幅する。プラスミド骨格に約20塩基対の配列相補性を有する耐性遺伝子用プライマーを設計する。PCR後、精製耐性遺伝子PCR産物の相同性領域を、50度で50度の等温アセンブリを用いて精製されたプラスミド骨格に60分間融合する。エレクトロポレーションを使用して、融合した製品を大腸菌DH5-アルファに変換します。選択培地上の混合物のプレート100マイクロリットルを、約24時間37度でインキュベートする。プラスミドは、抽出、検証し、大腸菌野生型株MG1655に変換することができます。これは、抗生物質暴露中に株MG1655 pCONを生み出し、細菌は生き残るためにプラスミドを必要とします。したがって、プラスミドは正の選択の下にある。非選択的な条件下では、抗生物質を使用しない場合、プラスミドは細胞に使い捨て可能である。我々の研究の目的は、時間の経過とともにこのような非選択的条件下でプラスミドに従う事であった。この目的のために、我々は抗生物質耐性遺伝子を持つ小さなプラスミドを装備し、大腸菌にそれを導入しました。我々は、進化実験を行い、レプリカめっきを介してプラスミド周波数を監視した。株mg1655 pCONを運ぶプラスミドは、進化実験に導入されました。まず、抗生物質を補ったLB寒天プレート上のプレートmg1655 pCONをプレートし、37度で一晩インキュベートする。このプレートから8祖先コロニーをランダムに選択し、一定の揺れで37度で一晩インキュベートします。翌日、集団は96の深い井戸プレートで行われる実験に移されます。プレート全体に複製物をランダムに分散することが非常に重要です。たとえば、チェッカーボードのアプローチです。我々の実験では、培養物は希釈され、異なる希釈速度と2つの温度で移動する。すべての転送イベントの間に希釈処理が適用され、連続転送は98の転送の合計にわたって繰り返される。進化実験に沿って、集団中のプラスミドの頻度は、細胞を運ぶプラスミドの割合から推定される。レプリカメッキは、1950年代にエステルとジョシュア・レダーバーグによって普及し、細菌中の薬剤耐性を研究するために使用されました。この方法は、彼らがフェノタイプのための彼らのスキャンを高級化することを可能にし、研究の終わりにペニシリン耐性はゲノムの自発的な突然変異のために細菌で起こり得ることを明らかにした。実験中に集団中のプラスミド頻度を決定するために、静止培養物は、非選択的LB寒天プレート上で逐次希釈およびメッキされる。プレートあたり250〜500コロニーの収率に従って希釈を調整します。めっきされた集団は、24時間未満の37度で一晩の成長のためにインキュベートされる。コロニーは、まだ小さいときに複製するのが最善です。一晩の成長の後、読者の選択の自動化されたコロニーカウンターを使用してすべてのコロニーを数えます。これは、培養における総細菌集団サイズをもたらす。プレートの端にあるコロニーは除外する必要があることに注意してください。プレートを複製するには、抗生物質、丸いブロック、ブロックにフィットする金属リング、無菌ベルベットの布を補った選択的寒天プレートが必要です。これは、オートクレーブによって滅菌することができるので、布は100%コットンである必要があります。布をブロックに置き、金属リングで固定します。慎重に固定ベルベット布の表面にカウントされたコロニーとプレートを置きます。すべてのプレート表面が布に触れるように、円の動きでプレートをタップします。すべてのコロニーがベルベットに触れることが非常に重要です。LBプレートを取り外し、ベルベットの上にセレクティブプレートを置きます。慎重なタップを繰り返します。プレートがベルベットに完全に触れるということが再び重要です。その後、選択プレートを取り外します。プレートは室温で一晩インキュベートされます。翌日、LBと抗生物質プレートの両方が評価に必要です。プレートを互いに上に置き、成長を比較します。コロニーのないスペースを簡単に見つけることができます。これらは、抗生物質に耐性ではないコロニーです。したがって、これらのコロニーはプラスミドを失った。最後に、抗生物質プレートに欠けているコロニーの数をマークします。この数字はあなたにプラスミドの損失を与えます。毎週の進化実験中に、すべての集団のレプリカめっきを繰り返します。プラスミド損失は、プラスミド多発奇形によって引き起こされる可能性がある。プラスミド構築に取り組むとき、あなたの好ましい宿主株における所定の遺伝子の発現について言う状態が取ることができる確認に関して生体内のプラスミドのネイティブな行動は、通常見落とされているものです。しかし、進化的な文脈では、このような変化の確認は非常に重要かもしれません。プラスミド確認の分析は非常にトリッキーな努力になる可能性があります。特にプラスミドマルチマーはPCRやシーケンシングによって正しく識別できないため、分析が困難です。一方、プラスミドマルチマーは、大きなサイズと低速の電気泳動移動性のためにゲル電気泳動による分析が困難です。私たちのプロトコルは、私が任意の与えられたプラスミド製剤と言うだろうでプラスミド多量体のスクリーニングと同定のための簡単で簡単な方法を提供しています。プラスミド分子を視覚にアルカリ性のリシスを用いて5mL定常一晩細胞培養からプラスミドを抽出する。低コピープラスミドのプラスミド抽出は、しばしばビジュアライゼーションの前に消化する必要がある宿主染色体DNAとの汚染につながる。染色体DNA汚染を除去するために、抽出したプラスミドDNAをプラスミドセーフで処理

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

設計と低コストの使用、自動Morbidostat細菌の適応進化のための抗生物質選択下

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

ケモスタットを用いた微生物の適応研究所進化のための手順

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTLマッピングとCRISPR / Cas9編集による薬剤耐性遺伝子同定<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

ヌクレオチド切除修復におけるDNA損傷認識の原子間力顕微鏡検査

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

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Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

真核生物の転写エラーのゲノム全体の監視

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

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物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

レニフォーム線虫抵抗に対する綿のジェノタイプのスクリーニング

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

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ショウジョウバエ男性アクセサリー腺の二次細胞からRNAを分離するFACSベースのプロトコル

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...