Name: quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach
Uploaded: 2019-12-14T14:00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach at JoVE.com

Vi takker gor Margaryan for kreativ støtte og teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av ZMB Young forsker Grant 2017/2018 (tildelt TW) og DFG fokus programmet 1819 (Grant no. DA1202/2-1 tildelt TD).

1. bygging av en modell plasmider bærer en antibiotikaresistens gen
Merk: belastningen Escherichia coli K-12 MG1655 ble brukt som modell organisme i alle eksperimenter (DSM No. 18039, tysk samling av mikroorganismer og Cell kulturer, DSMZ). Belastningen E. coli DH5α17 ble brukt under plasmider konstruksjon.
<ol><li>PCR forsterker plasmider ryggrad etter ditt valg og forsterker motstands genet inkludert arrangøren regionen ved PCR (figur 1).<ol>
<li>PCR forsterker plasmider ryggraden ved hjelp av en polymerase av høy kvalitet og oligonukleotider pBBR1_for (5 '-GCGGCCACCGGCTGGCT-3 ') og pBBR1_rev (5 '-TACCGGCGCGGCAGCGTGACCC-3 ') på plasmider malen pLC (GenBank ACC. no. MH238456)18.</li>
		<li>PCR forsterke motstanden genet nptII inkludert native Tn5 promoter19 ved hjelp av en high-fidelity polymerase og OLIGONUKLEOTIDER nptII_gib_for (5 '-GCGCCGGTAGATCTGCTCATGTTTGAAGCTTCACGCTGCCGCA-3 ') og nptII_gib_rev (5 '-CGGTGGCCGCCAAAAAGGCCATCCGTCAGGTCAGAAGAACTCGT-3 '). NptII -genet koder for en Neomycin fosfotransferase og gir motstand mot kanamycin. Merk: design primere for motstanden genet med ca 20 BP av komplementære sekvens til plasmider ryggraden at det vil bli smeltet til.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rengjør både PCR-fragmenter ved hjelp av et sett av ditt valg.</li>
	<li>Bli med renset antibiotikaresistens genet PCR produkt (inkludert promoter region) til renset plasmider ryggrad og sikring av homologe regionene ved hjelp isotermiske montering20, ved 50 ° c for 60 min.</li>
	<li>Electroporate den smeltet produktet i belastningen E. coli DH5α.<ol>
<li>Introduser 2 μL av produktet fra trinn 1,3 til 40 μL av electrocompetent celler i 2 mm kyvetter ved 4 ° c og 2,5 kV. Resuspend celler i 1 mL lysogeny buljong (LB) medium.</li>
		<li>Overfør det totale volumet til et microfuge rør og ruge 1 t ved 37 ° c risting ved 250 RPM i en orbital shaker for å muliggjøre uttrykk for motstands merket på plasmider.</li>
		<li>Plate 100 μL av cellene på LB agar plater som inneholder riktig antibiotika (kanamycin 25 μg/mL) for å velge for antibiotikaresistens genet og dermed velge for plasmider-bærende celler. Snurr ned resten, fjerne supernatanten, resuspend cellene i 100 μL LB og plate på en selektiv agar plate. Ruge platene ved 37 ° c i 24 timer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>For å verifisere kloner, Pakk den konstruerte plasmider via alkalisk lyse med en kommersiell mini-prep Kit.<ol>
<li>Harvest 5 mL av den stasjonære natten kultur ved sentrifugering ved 12 000 x g ved romtemperatur. Resuspend cellene i blanding oppløsning, deretter lyse og nøytralisere celle løsning. Sentrifuger for 5 min ved 12 000 x g.</li>
		<li>Overfør supernatanten til DNA bindings Kol onnen som følger med settet, og vask kolonnen to ganger med 500 μL vaskeløsning sentrifugering 2x før tent av Kol onne membranen med eluering buffer.</li>
		<li>Utfør sanger-sekvensering av plasmider for å bekrefte at sekvensen er riktig.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Når plasmider gyldighet er bekreftet, electroporate den plasmider (nå pCON) i belastningen E. coli MG1655 som beskrevet ovenfor. Dette gir belastning E. coli MG1655 pCON.</li>
</ol>2. overvåking av plasmider under ulike forhold over tid
Merk: utviklingen eksperimentet er utført med plasmider-bærende belastninger under selektivt forhold (LB Media) i to temperaturer (37 ° c og 20 ° c) og tre befolkning flaskehalser størrelser. Den eksperimentelle designen brukes til å studere plasmider utholdenhet under ulike forhold.
<ol><li>Design av en evolusjon eksperiment for å følge plasmider frekvens over tid (figur 2)<ol>
<li>Plate den konstruerte plasmider-bærende belastning (E. coli MG1655 pCON) på lb agar plater supplert med antibiotika (kanamycin 25 μg/ml) og ruge over natten ved 37 ° c.</li>
		<li>Forbered 96 dype brønn plater med 1 mL LB medium i hver brønn. Som bakterielle forfedre, plukke åtte tilfeldige isolerte kolonier fra agar plate i uavhengige brønner. Ruge platene ved 37 ° c og 450 RPM på en plate shaker for 24 h. Forbered en frossen glyserol lager av Ancestral kloner.</li>
		<li>Den neste dagen overføre de åtte replikere populasjoner i nye Deep-brønn plater i henhold til eksperimentell design (figur 2). Kulturene er fortynnet 1:100 (stor flaskehals, L), 1:1000 (middels flaskehals, M), eller 1:10000 (liten flaskehals, S) i et total volum på 1 mL LB ved bruk av PBS for fortynning. De fortynnede kulturene er begge inkubert ved 37 ° c og 20 ° c. Merk: det er svært viktig å kontrollere for krysskontaminering i 96-dyp-brønn platen. Dermed bruker en sjakkbrett plate design av interkalering inokulert brønner med bakterier-fri LB medium. Bruk dette mønsteret gjennom hele evolusjonen eksperimentet.</li>
		<li>Kulturene som inkubert ved 37 ° c blir overført hver 12 h, mens kulturer ved 20 ° c blir overført hver 24 h. Merk: under hver overføring hendelse flaskehalsen størrelses behandling påføres og seriell overføring gjentas over totalt 98 overføringer. Antallet overføringer vil avhenge av lesernes eksperimentelle design.</li>
		<li>Forbered en frossen glyserol lager av alle populasjoner regelmessig, 2x i uken.</li>
	</ol></li>
	<li>Overvåking av plasmider frekvens ved kopi plating (Figur 3) Merk: i løpet av utviklingen eksperimentet, hyppigheten av plasmider i befolkningen er anslått fra andelen av verter. Replikaen plating protokollen er vist i Figur 3.<ol>
<li>For å bestemme plasmider frekvens i befolkningen under evolusjonen eksperimentet, stasjonære kulturer er serielt fortynnet og belagt på selektivt LB agar plater. Juster fortynning i henhold til en avkastning på 250-500 kolonier per plate. Merk: Forbered tykke LB agar plater før plating (~ 30 mL agar).</li>
		<li>De belagte populasjoner er inkubert for over natten vekst i henhold til deres vekst temperatur i eksperimentet. Merk: koloniene må være små, og dermed ruge < 24 timer ved 37 ° c.</li>
		<li>Etter over natten vekst, telle alle kolonier ved hjelp av en manuell eller automatisert koloni telle stasjon og beregne den totale bakterielle Befolkningsstørrelsen i kulturer. Merk: kolonier på kanten av agar platen bør ikke inkluderes i den totale bakterie celle tellingen.</li>
		<li>Sterilisere firkantede brikker (~ 20 x 20 cm) bomulls fløyel ved autoklavering. Merk: fløyel kluten må være 100% bomull for å være autoklaverbar. Det er viktig å tørke kluten etter sterilisering.</li>
		<li>Etter sterilisering av fløyel klut, plassere kluten på en rund blokk og fikse det med en metall ring. Det er avgjørende å unngå rynker. Forsiktig plassere platen med de voksne koloniene (agar vendt ned) på den faste fløyel klut overflaten. Sørg for at alle kolonier berører fløyel overflaten ved å trykke forsiktig på Petri parabolen i en sirkulær måte.</li>
		<li>Forsiktig fjerne LB agar plate og plassere en selektiv plate supplert med antibiotika (kanamycin 25 μg/mL) på fløyel klut. Pass på at platen berører alle fløyel ved å trykke forsiktig på Petri parabolen som beskrevet før. Etterpå fjerner du platen. La platene i romtemperatur for overnatting vekst.</li>
		<li>Neste dag, evaluere både LB agar plate og selektiv plate. Kolonier som vokser på selektiv Media telles som plasmider verter (dvs. antibiotika resistente), mens koloni-frie flekker er kolonier som var plasmider og er således ikke motstandsdyktig mot antibiotika (dvs. mistet plasmider). Dette gjøres ved å plassere platene over hverandre og sammenligne veksten (dvs. markere eventuelle manglende kolonier) og telle kolonien nummeret på begge platene. Dette gir antall celler som mistet plasmider under utviklingen eksperimentet.</li>
		<li>Gjenta denne prosedyren langs hele utviklingen eksperimentet på en vanlig måte (for eksempel hver 14 overføringer).</li>
	</ol></li>
</ol>3. visualisering av plasmider multimers ved hjelp av gel elektroforese
Merk: plasmider ekstraksjon av lav-kopi plasmider ofte fører til forurensning med vert kromosom DNA som må enzymatisk fordøyd før visualisering.
<ol><li>Pakk plasmider DNA fra en 5 mL stasjonær over natten cellekultur ved hjelp av alkalisk lyse som beskrevet i trinn 1,5.</li>
	<li>Etterpå kan du behandle det utpakkede plasmider DNA med en ATP-avhengig DNase som bare kutter kromosom DNA for å fjerne kromosom DNA-forurensning (se tabell over materialer). Ruge ved 37 ° c i 30 min. etterpå, rengjør DNA ved hjelp av et sett av ditt valg.</li>
	<li>For å skape åpne sirkel molekyler av alle plasmider konformasjonen (monomerer eller multimers), ruge de plasmider DNA-prøvene med et skår enzym (NB. BsrDI) og ruge i 30 min ved 65 ° c.</li>
	<li>Parallelt, for å lage lineære plasmider molekyler (dvs. for plasmider størrelse sammenligning), bruk en restriksjon enzym av ditt valg (f. eks, HindIII) som kløyver plasmider gang. Merk: Dette resulterer i lineær DNA plasmider monomerer. Åpne sirkel molekyler ikke migrere på en lineær måte.</li>
	<li>For å visualisere plasmider størrelse og konformasjon, electrophorese de nicked og lineære plasmider DNA-prøvene for 120 min ved 4,3 V/cm i en 1% (w/V) agarose gel og 1 × TAE buffer. Prøvene er farget med Midori grønn og gelen er visualisere på en gel Imaging system (se tabell over materialer). Bruk en 1 KBP stige.</li>
</ol>

<ol>
	<li>San Millan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+plasmid-mediated+antibiotic+resistance+in+the+clinical+context.">Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context.</a> Trends in Microbiology. 26 (12), 978-985 (2018).</li><li>Bruto, M., James, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+crassostreae,+a+benign+oyster+colonizer+turned+into+a+pathogen+after+plasmid+acquisition.">Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition.</a> The ISME Journal. 11 (4), 1043-1052 (2017).</li><li>von Wintersdorff, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer.">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (110), 305-310 (2016).</li><li>Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+and+the+dynamics+of+adaptation+and+genome+evolution+in+microbial+populations.">Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations.</a> ISME Journal. 11 (10), 2181-2194 (2017).</li><li>De Gelder, L., Williams, J. J., Ponciano, J. E. M., Sota, M., Top, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+plasmid+evolution+results+in+host-range+expansion+of+a+broad-host-range+plasmid.">Adaptive plasmid evolution results in host-range expansion of a broad-host-range plasmid.</a> Genetics. 178 (4), 2179-2190 (2008).</li><li>Harrison, E., Guymer, D., Spiers, A. J., Paterson, S., Brockhurst, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+compensatory+evolution+stabilizes+plasmids+across+the+parasitism-mutualism+continuum.">Parallel compensatory evolution stabilizes plasmids across the parasitism-mutualism continuum.</a> Current Biology. 25 (15), 2034-2039 (2015).</li><li>Bouma, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+bacteria/plasmid+association.">Evolution of a bacteria/plasmid association.</a> Nature. 335 (6188), 351-352 (1988).</li><li>Wein, T., H&#252;lter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+plasmid+stability+under+nonselective+conditions+maintains+antibiotic+resistance.">Emergence of plasmid stability under nonselective conditions maintains antibiotic resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 2595 (2019).</li><li>Loftie-Eaton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+mutations+improve+general+permissiveness+to+antibiotic+resistance+plasmids.">Compensatory mutations improve general permissiveness to antibiotic resistance plasmids.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1 (9), 1354-1363 (2017).</li><li>Millan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+and+compensatory+adaptation+interact+to+stabilize+non-transmissible+plasmids.">Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible plasmids.</a> Nature Communications. 5 (1), 1-11 (2014).</li><li>Loftie-Eaton, W., Tucker, A., Norton, A., Top, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+real-time+quantitative+PCR+as+tools+for+assessing+plasmid+persistence.">Flow cytometry and real-time quantitative PCR as tools for assessing plasmid persistence.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5439-5446 (2014).</li><li>M&#252;nch, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+fixation+of+plasmids+during+recombinant+protein+production+in+Bacillus+megaterium+results+in+population+heterogeneity.">Polar fixation of plasmids during recombinant protein production in Bacillus megaterium results in population heterogeneity.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (17), 5976-5986 (2015).</li><li>Jahn, M., Vorpahl, C., H&#252;bschmann, T., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variability+of+expression+plasmids+determined+by+cell+sorting+and+Droplet+Digital+PCR.">Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR.</a> Microbial Cell Factories. 15 (1), 211 (2016).</li><li>Lederberg, J., Lederberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants.">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> Journal of Bacteriology. 63, 399-406 (1952).</li><li>Summers, D. K., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimerization+of+high+copy+number+plasmids+causes+instability:+ColE1+encodes+a+determinant+essential+for+plasmid+monomerization+and+stability.">Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability.</a> Cell. 36 (4), 1097-1103 (1984).</li><li>Summers, D. K., Beton, C. W., Withers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicopy+plasmid+instability:+the+dimer+catastrophe+hypothesis.">Multicopy plasmid instability: the dimer catastrophe hypothesis.</a> Molecular Microbiology. 8 (6), 1031-1038 (1993).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Ilhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregational+drift+and+the+interplay+between+plasmid+copy+number+and+evolvability.">Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability.</a> Molecular Biology and Evolution. 36 (3), 472-486 (2019).</li><li>Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. A., Reiss, B., Schaller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+and+exact+localization+of+the+neomycin+phosphotransferase+gene+from+transposon+Tn5.">Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5.</a> Gene. 19 (3), 327-336 (1982).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

I denne protokollen, presenterer vi en tilnærming som kombinerer teknikker i molekylærbiologi, eksperimentell evolusjon, og DNA-visualisering for å undersøke rollen til plasmider evolusjon for utholdenhet av antibiotikaresistens i bakterier. Selv om presentert tilnærming kombinerer metoder fra ulike forskningsområder, alle de anvendte teknikkene er grei og kan utføres i en standard mikrobiologi laboratorium.
De mest kritiske trinnene i protokollen inkluderer bygging av modellen systembelastningen som inkluderer genetisk validering av plasmider-bærende genotype. Spesielt mange plasmider naturlig kode antibiotikaresistens gener. Dermed kan leseren utelate trinn 1 i protokollen og direkte fortsette med trinn 2. Deretter bør utviklingen eksperimenter inkludere en tilfeldig utforming av replikere populasjoner slik at resultatene ikke er forutinntatt av plasseringen av replikere populasjoner i dyp-brønn plate. I tillegg er det spesielt viktig å nøye gjennomføre seriell overføring og fortynning trinnene i utviklingen eksperimentet som forurensning ville forfalske resultatene. Til slutt bør kopi plating utføres med stor forsiktighet. Stor koloni størrelse kan være et problem, men det kan unngås ved incubating platene for mindre enn 24 h. Tilsvarende kan antall kolonier på en plate bias kopi plating resultater. Derfor må populasjoner fortynnes før plating og replikering.
En av de største fordelene med vår tilnærming er som lett kan reproduseres uten behov for tungt utstyr. I tillegg er en annen fordel med kopi plating å følge markør gener som bare leverceller evalueres, i motsetning til flyt flowcytometri eller qPCR der døde celler kan evalueres som levende. Dermed introduserer kopi plating mindre bias til telling av plasmider-bærende celler. Likevel, en begrensning av kopi plating kan være befolkningen størrelse (dvs. celle nummer) som er mulig å evaluere i en eksperimentell kjøre.
Ved hjelp av vår tilnærming, har vi nylig vist at plasmider stabilitet evolusjon potenserer utholdenhet av antibiotikaresistens gener i bakterier. Dermed utviklet vi en tilnærming som et verktøy for å følge plasmider-mediert motstand utholdenhet som er av høy viktighet å følge motstanden over tid, spesielt under forhold uten tilstedeværelse av antibiotika.

Plasmider er sirkulære, selv-replikere genetiske elementer som er allestedsnærværende i prokaryoter. De er agenter for lateral genoverføring, som de kan overføre trekk mellom mikrobielle populasjoner, og dermed anses å spille en viktig rolle i mikrobiell evolusjon. Plasmider er drivere av rask tilpasning til vekst-begrensende forhold over en kort tid (f. eks, i nærvær av antibiotika eller sprøytemidler1) og er ansvarlig for langsiktig overgang til andre livsstil moduser (f. eks fremveksten av patogenitet2). De mest slående eksemplene på virkningen av plasmider ved overføring av gener er dokumentert i økosystemer eksponert for varierende grad av antibiotika, slik som medisinske klinikker eller i industrielle gårder3. På grunn av sterke positive valg, mange plasmider kode for antimikrobielle resistens gener og er ofte funnet å konferere multiresistance til sin bakteriell vert. Plasmider aktivere migrasjon mellom populasjoner eller bakterielle arter, noe som resulterer i en rask spredning av flere antimikrobielle resistens. Under selektivt forhold plasmider er ikke avgjørende for cellen og er ofte også referert til som parasitt elementer. Likevel, plasmider er allestedsnærværende i naturen og deres evolusjon er svært sammenvevd med at av bakteriell kromosomer. Plasmider utholdenhet i naturlige miljøer (varierende og selektivt) er fortsatt dårlig forstått, men det er av stor betydning for vår forståelse av utholdenhet av antibiotikaresistens gener i naturen.
Eksperimentell evolusjon er et kraftig verktøy for studiet av mikrobielle populasjoner4. Eksperimentell evolusjon viste at imponerende sterkt utvalg for plasmider vedlikehold fører til kompenserende (dvs. adaptive) utviklingen av plasmider eller verts kromosom som reduserer plasmider fitness kostnader og i sin tur Letter plasmider overflod (dvs. plasmider utholdenhet)5,6,7. Således, etter plasmider-vert interaksjon over tid kan avdekke viktige mekanismer for tilpasning av begge elementene. I tillegg gjør eksperimentell evolusjon det mulig for en å kvantifisere overflod av plasmider-bærende celler over tid under ulike forhold8,9,10.
Plasmider utholdenhet i evolusjon eksperimenter kan overvåkes av flere strategier, inkludert flyt flowcytometri av fluorescerende aktivert celle sortering (FACS)11, kvantitativ PCR (qPCR)11, eller i dyrking-baserte metoder. Flow flowcytometri krever en FACS maskin og innføringen av et synlig (fluorescerende) markør gen, slik som det grønne fluorescerende proteinet (GFP), på plasmider. Imidlertid kan GFP uttrykk endre flere cellulære egenskaper og dessuten påvirke plasmider plassering i cellen12, som igjen kan påvirke plasmider arv under celledeling. En qPCR tilnærming for å måle plasmider overflod kan være svært partisk av plasmider kopi nummer, som kan variere sterkt langs bakteriell vekstfase og over tid13. Endelig, en kultur-basert og plating tilnærming krever innføring av en valgbar markør genet. Dette kan være et antibiotikaresistens gen, som ofte er kodet på naturlig plasmider; Dermed er ingen genetisk manipulering nødvendig. Antibiotikaresistens kan etterfølges av en tradisjonell kopi plating tilnærming. Således, for å studere naturlig plasmider dynamikk, er kopi plating godt egnet til å overvåke plasmider-kodet antibiotika resisitance14.
For å visualisere plasmider molekyler (for eksempel for å evaluere plasmider størrelse) kan flere metoder anvendes. Hele plasmider kan forsterkes ved hjelp av en PCR-basert tilnærming. Dette krever imidlertid utformingen av spesifikke primere, som kan være utfordrende under en evolusjon eksperiment, fordi plasmider sekvensen kan endres over tid. I tillegg er det vanskelig å forsterke plasmider multimers i en PCR-basert tilnærming på grunn av flere bindings områder for PCR-primere. Multimeric plasmider molekyler kan vises etter plasmider replikering oppsigelse eller gjennom rekombinasjon av plasmider molekyler og er for det meste orientert Head-to-tail15. En annen tilnærming til plasmider visualisering kombinerer enzymatisk fordøyelse av plasmider molekyler av DNA endonucleases som enten Cleave eller Nick en plasmider DNA strand med agarose gel elektroforese analyse. De samme plasmider i forskjellige størrelser (f.eks. monomerer vs. multimers) resulterer i forskjellige gel-mobilities som kan observeres ved visualisering av plasmider molekyler. Denne tilnærmingen muliggjør visualisering og kvantifisering av ulike plasmider konformasjonen (dvs. multimerization tilstander). Den plasmider konformasjon kan brukes som en indikator på plasmider stabilitet, som plasmider multimers er ofte tapt under celle divisjon16.
I et nylig arbeid, fulgte vi plasmider utholdenhet i forhold som ikke var selektiv for plasmider overflod (dvs. uten antibiotika). Vi sammenlignet plasmider utholdenhet ved to forskjellige temperaturer (20 ° c og 37 ° c) og tre befolknings størrelser (dvs. fortynnings rater). Bruk av ulike fortynning priser, eller befolknings flaskehalser, gjør det mulig for etterforskningen av innflytelsen av befolkningen størrelse på bakteriell og plasmider evolusjon. Basert på våre resultater, foreslår vi at plasmider kan være nøytral til deres bakteriell vert og kan utvikle stabilitet uten valg trykk8. Den utviklede plasmider stabiliteten er gitt ved reduksjon av plasmider multimer formasjon8.
Her presenterer vi en protokoll for kvantifisering av plasmider utholdenhet og etterforskning av plasmider evolusjon i forhold til vedlikehold av antibiotikaresistens gener. Metoden har flere trinn, inkludert innsetting av et antibiotikaresistens gen til en modell plasmider (som kan utelates ved bruk av en naturlig motstand plasmider), etterfulgt av bruk av eksperimentell evolusjon å vurdere potensialet i plasmider å vedvare under selektivt forhold mens bestemme plasmider frekvens dynamikk over tid ved hjelp av kopi plating, og analysen av plasmider Genova ved visualisering. Protokollen beskrevet her var utformet for å undersøke utviklingen og utholdenhet av plasmider, men det kan også anvendes for å følge utviklingen av kromosom resistens gener (eller andre markør gener) over tid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EN07.1</td>
			<td>2 ml, square</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates (cryo)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1702-8400</td>
			<td>Micro-Dilution Tube System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony counter</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SC6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton velvet</td>
			<td>drapery shop</td>
			<td></td>
			<td>100 % cotton required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652089</td>
			<td>0.1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Gel Extraction kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0832</td>
			<td>PCR fragment clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50125852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (plate shaker)</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaker)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052, 3125000028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Capp</td>
			<td>ME8-1250R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Eurofines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F533S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmidSafe enzyme</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>10059400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica block &#38; metal ring</td>
			<td>VWR</td>
			<td>601-3401</td>
			<td>PVC cylinder 69 mm; ring 102cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resctriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach

Plasmider spiller en viktig rolle i mikrobiell økologi og evolusjon som kjøretøyer av lateral genoverføring og reservoarer av tilbehør gen funksjoner i mikrobielle populasjoner. Dette er spesielt tilfelle under raskt skiftende miljøer som varierende antibiotika eksponering. Vi har nylig viste at plasmider opprettholde antibiotikaresistens gener i Escherichia coli uten positivt valg for plasmider tilstedeværelse. Her beskriver vi et eksperimentelt system som gjør det mulig å følge både de plasmider genotype og fenotype i langsiktige utviklings eksperimenter. Vi bruker molekylære teknikker for å designe en modell plasmider som senere introduseres til en eksperimentell evolusjon batch system tilnærming i en E. coli Host. Vi følger plasmider frekvens over tid ved å bruke kopi plating av E. coli populasjoner mens kvantifisere antibiotikaresistens utholdenhet. I tillegg overvåker vi konformasjon av plasmider i vert celler ved å analysere omfanget av plasmider multimer formasjon av plasmider skår og agarose gel elektroforese. En slik tilnærming gir oss mulighet til å visualisere ikke bare Genova størrelsen på utvikling plasmider men også deres topologisk konformasjon-en faktor svært viktig for plasmider arv. Vårt system kombinerer molekylære strategier med tradisjonelle mikrobiologi og gir et oppsett for å følge plasmider i bakterie populasjoner over lang tid. Den presenterte tilnærmingen kan anvendes for å studere et bredt spekter av mobile genetiske elementer i fremtiden.

Her presenterer vi en tilnærming for å studere plasmider evolusjon ved kvantifisere plasmider utholdenhet i en befolkning. Først viser vi hvordan å bygge plasmider bærer E. coli stamme MG1655 pCON som senere introdusert til en evolusjon eksperiment. For det andre presenterer vi en grei metode for å følge plasmider overflod i utviklingen av bakterielle populasjoner. Til slutt viser vi hvordan du kan visualisere plasmider molekylstørrelse og konformasjon.
I vårt forrige arbeid8 bruker presenterte tilnærmingen vi gjennomførte en evolusjon eksperiment etter utholdenhet av antibiotikaresistens plasmider i E. coli i fravær av antibiotika (Figur 4). Våre representative resultater viser utviklingen av populasjoner ved 37 ° c og en fortynnings rate på 10-4. Etter overflod av plasmider, observerte vi en nedgang i hyppigheten plasmider-bærende verts celler over tid (Figur 4). Vår tilnærming gjorde det mulig for oss å oppdage at det plasmider tapet var et resultat av den kondensert plasmider-arkitekturen, noe som førte til plasmider ustabilitet forårsaket av konflikter introdusert av transkripsjon av motstands genet og replikering av plasmider selv. Visualisering av plasmider molekyler gjorde oss i stand til å oppdage at disse konfliktene førte til en ustabil plasmider konformasjon (dvs. plasmider multimer formasjon, figur 5). Likevel observerte vi plasmider stabilitet evolusjon uten eksponering for antibiotika (Figur 4). Den utviklet stabilitet ble overdratt av en plasmider iboende duplisering som avskaffet den transkripsjon-replikering konflikter og førte til dannelsen av stabilt arvet plasmider. Våre resultater viser således viktigheten av rekombinasjon og Genova forsterkning i adaptiv utvikling av genetiske elementer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig1.jpg"> Figur 1: plasmider utforming av pCON. Skjematisk fremstilling av kloning strategien brukes til å bygge plasmider pCON. Plasmider ryggrad (pBBR1) og antibiotikaresistens genet (nptII) er PCR forsterket og smeltet sammen av isotermiske Fusion20. Dette gir plasmider pCON og belastningen MG1655 pCON. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig2.jpg"> Figur 2: design av langsiktig evolusjon eksperimentet. Skjematisk fremstilling av det serielle overførings eksperimentet. Plasmider (pCON)-populasjonen er belagt på selektive medier. Ancestral kolonier er tilfeldig valgt fra platen og introdusert til en seriell overføring system. Overføringene er gjennomført med tre ulike fortynning tilnærminger for å simulere befolknings flaskehalser i forskjellige størrelser. Fortynninger er serielt gjentas. Eksperimentet er gjennomført i to temperatur regimer. Frekvensen for plasmider måles langs eksperimentet via kopi belegg. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig3.jpg"> Figur 3: kopi belegg. Skjematisk fremstilling av trinnene brukt i kopi plating av bakterie populasjoner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig4.jpg"> Figur 4: representativ pCON-frekvens over tid. pCON utholdenhet er vist som andelen av vertene (representative replikere populasjoner) i løpet av utviklingen eksperimentet. For 98 overføringer, pCON plasmider populasjoner utviklet seg under selektivt forhold med en fortynning faktor på 10-4. Alle replikeres bærer plasmider pCON redusert i befolkningen. Etterpå ble befolkningen utsatt for antibiotika for overnatting inkubasjons og ble dyrket igjen under selektivt forhold for å teste for plasmider stabilitet evolusjon. Dette tallet er endret fra Wein et al.8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig5.jpg"> Figur 5: representative analyse av plasmider konformasjon. Visualisering av modellen plasmider pCON. Visualisere er ubehandlet plasmider DNA rett etter utpakking, linearized plasmider DNA, og behandlet med DNase som bare kutter kromosom DNA samt enzymatisk nicked DNA (dvs. åpen sirkel plasmider DNA). Linearizing plasmider viser at alle plasmider er av samme størrelse. Fjerne kromosom DNA og skår pCON avslører tilstedeværelsen av dimers og andre multimers. Dette tallet er endret fra Wein et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach at JoVE.com

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Vår eksperimentelle tilnærming gir en strategi for å følge plasmider overflod og antibiotikaresistens over tid i bakterielle populasjoner.

Kvantifisering av plasmider-mediert antibiotikaresistens i en eksperimentell Evolution Approach

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Plasmider er ekstrakromosomale elementer som er allestedsnærværende i de fleste bakterielle arter og habitater hvor de er svært viktige agenter for lateral genoverføring som de kan migrere mellom celler og mellom populasjoner. Et av de mest slående og fremtredende eksemplene på slik overføring er spredningen av antibiotikaresistensgener som er kodet på plasmider. For å bygge en modell plasmid som koder et antibiotikaresistensgen, velg en plasmid ryggrad og PCR forsterke ryggraden ved hjelp av en høy troskap polymerase og primere som binder seg på plasmid malen. I vårt tilfelle brukte vi en pBBR1 plasmid ryggrad. Deretter forsterker du motstandsgenet nptII inkludert den innfødte Tn5-promotoren ved hjelp av en høy gjengivelsespolymerase. Design primerne for motstandsgenet med ca. 20 basepar sekvens komplementaritet til plasmidryggraden. Etter PCRs, sikring homologiområdet til renset motstand gen PCR produktet til renset plasmid ryggraden ved hjelp av isotermisk montering på 50 grader i 60 minutter. Forvandle det smeltede produktet til E.Coli DH5-Alpha ved hjelp av elektroporasjon. Plate 100 mikroliter av blandingen på selektive medier og inkubere ved 37 grader i ca 24 timer. Plasmid kan deretter ekstraheres, valideres og forvandles til E.coli vill type stamme MG1655. Dette gir belastning MG1655 pCON.Under antibiotikaeksponering trenger bakterier plasmid for å overleve. Dermed er plasmid under positivt utvalg. Under ikke-selektive forhold, så uten antibiotika er plasmid disponibel til cellen. Målet med vår studie var å følge plasmidene under slike ikke-selektive forhold over tid. Til dette formålet utstyrte vi de små plasmidene med et antibiotikaresistensgen og introduserte det til Escherichia coli. Vi gjennomførte et evolusjonært eksperiment og overvåket plasmidsfrekvensen via replikaplating. Plasmid bærer belastning mg1655 pCON er nå introdusert til en evolusjon eksperiment. Først plate mg1655 pCON på LB agar plater supplert med antibiotika og inkubere over natten ved 37 grader. Fra denne platen tilfeldig velge 8 stamfar kolonier og inkubere over natten på 37 grader med konstant risting. Neste dag overføres populasjonene til eksperimentet som utføres i 96 dype brønnplater. Det er svært viktig å tilfeldig fordele replikerer over platen. For eksempel i en rutebord tilnærming. I vårt eksperiment fortynnes kulturene og overføres med forskjellige fortynningshastigheter og i to temperaturer. Under hver overføringshendelse påføres fortynningsbehandlingen og den serielle overføringen gjentas over totalt 98 overføringer. Langs evolusjonseksperimentet er frekvensen av plasmider i befolkningen estimert fra andelen plasmidbærende celler. Replica plating ble popularisert av Esther og Joshua Lederberg på 1950-tallet hvor de brukte den for å studere legemiddelresistens i bakterier. Metoden vil gjøre dem i stand til å oppskalere sin skanning etter fenotyper og på slutten av studien viste at penicillin resistens kan oppstå i bakterier på grunn av spontane mutasjoner i genomet. For å bestemme plasmidfrekvensen i befolkningen under forsøket, blir stasjonære kulturer serielt fortynnet og belagt på ikke-selektive LB agarplater. Juster fortynningen i henhold til et utbytte på 250 til 500 kolonier per plate. De belagte populasjonene inkuberes for overnattingsvekst ved 37 grader i mindre enn 24 timer. Kolonier replikeres best når de fortsatt er små. Etter overnatting vekst telle alle kolonier ved hjelp av en automatisert koloni teller av leserens valg. Dette gir den totale bakteriepopulasjonsstørrelsen i kulturene. Legg merke til at kolonier på kanten av platen skal være utelatt. For å gjenskape platene, trenger du selektive agarplater supplert med antibiotika, en rund blokk, en metallring som passer til blokken og steril fløyelsklut. Kluten må være 100% bomull som dette kan steriliseres ved autoklavering. Plasser kluten på blokken og fest den med metallringen.Plasser platen forsiktig med de talte koloniene på den faste fløyelsklutoverflaten. Bank platen i sirkelbevegelser slik at alle plateoverflaten berører kluten. Det er svært viktig at alle kolonier berører fløyel. Fjern LB-platen og plasser den selektive platen på fløyelen. Gjenta forsiktig tapping. Det er igjen viktig at platen berører fløyel helt. Fjern deretter selektivplaten. Platene inkuberes ved romtemperatur over natten. På neste dag er både LB og antibiotikaplaten nødvendig for evaluering. Plasser platene en over hverandre og sammenligne veksten. Du kan enkelt oppdage kolonifrie områder. Dette er koloniene som ikke er resistente mot antibiotika. Dermed mistet disse koloniene plasmid. Til slutt markerer du hvor mange kolonier som mangler på antibiotikaplaten. Dette nummeret gir deg plasmid tapet. Gjenta replikaplating av alle populasjoner under evolusjonseksperimentet ukentlig. Plasmid tap kan skyldes plasmid multi misdannelse. Når du arbeider med en plasmid konstruksjon si for uttrykk for et gitt gen i din foretrukne vert belastning den innfødte oppførselen til en plasmid in vivo med hensyn til bekreftelsen en stat kan ta er vanligvis noe som er oversett. Men i en evolusjonær sammenheng kan en slik bekreftelse på endringer være av svært stor betydning. Analysen av plasmidbekreftelser kan være en svært vanskelig bestrebelse. Spesielt plasmid multimers er vanskelig å analysere fordi de ikke kan identifiseres riktig av PCR eller ved sekvensering. På den andre siden er plasmid multimere vanskelig å analysere ved gelelektroforese på grunn av deres potensielt store størrelse og deres langsomme elektroforetiske mobilitet. Vår protokoll tilbyr en enkel og grei metode for screening og identifisering av plasmid multimere i jeg vil si noen gitt plasmid forberedelse. For å visuelle plasmidmolekyler trekke plasmid fra 5 ml stasjonær nattcellekultur ved hjelp av alkalisk lysis. Plasmid ekstraksjon av lav kopi plasmider fører ofte til forurensning med vert kromosomalt DNA som må fordøyes før visualisering. For å fjerne kromosomalt DNA-kontaminering, behandle det ekstraherte plasmid-DNA-et med Plasmid-Safe

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Design og bruk av en lav pris, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bakterier Under Antibiotika Drug Selection

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Prosedyre for Adaptive Laboratory Utviklingen av mikroorganismer ved hjelp av en kjemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL-kartlegging og CRISPR / Cas9 redigering for å identifisere et stoffresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Atomic Force Microscopy Undersøkelser av DNA Lesion Recognition i Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Testing Multicopy plasmider rolle i utviklingen av antibiotikaresistens

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genomet hele overvåking av transkripsjon feil i eukaryote organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Produsere Gene slettingene i Escherichia coli av P1 signaltransduksjon med Excisable antibiotikaresistens kassetter

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening Cotton genotyper for kantet nematode Resistance

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

En FACS-basert protokoll for å isolere RNA fra sekundære celler av Drosophila mannlig tilbehør kjertler

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...