Name: quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach
Uploaded: 2019-12-14T14:00:00
Duration: 12 min 32 s
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Agradecemos a Gor Margaryan por apoio criativo e assistência técnica. Este trabalho foi apoiado pelo ZMB Young Scientist Grant 2017/2018 (concedido à TW) e pelo programa de foco DFG 1819 (Grant No. DA1202/2-1 concedido à TD).

1. Construção de um plasmídeo modelo carregando um gene de resistência aos antibióticos
NOTA: A cepa Escherichia coli K-12 MG1655 foi usada como organismo modelo em todos os experimentos (DSM Nº 18039, Coleção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares, DSMZ). A cepa E. coli DH5α17 foi usada durante a construção plasmídeo.
<ol><li>PCR amplifica rolha amplificar a espinha dorsal plasmídeo de sua escolha e amplificar o gene de resistência, incluindo a região promotor por PCR (Figura 1).<ol>
<li>PCR amplificar a espinha dorsal plasmídeo usando uma polimerização de alta fidelidade e os oligonucleotídeos pBBR1_for (5'-GCGGACCGGGGGGGGCT-3') e pBBR1_rev (5'-TACGCGCGCGCGCGCGCGGCGACCC-3') no modelo plasmídeo pLC (GenBank acc no. MH238456)18.</li>
		<li>PCR amplificar o gene de resistência nptII incluindo o nativo Tn5 promotor19 usando uma polimererase de alta fidelidade e oligonucleotídeos nptII_gib_for (5'-GCGCCGGGGATGCATGCTCATTGATGAAGCTTGCTGCCGCGCA-3') e nptII_gib_rev (5'-CGGTGGGCGCGCCAAAAGGCCCCCCCCCACCCACAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGACGCGT-3'). O gene nptII codifica uma fosfortransferase de neomicina e confere resistência à kanamicina. NOTA: Projete as cartilhas para o gene da resistência com aproximadamente 20 bp da seqüência complementar à espinha dorsal plasmídea a que será fundida a.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Limpe ambos os fragmentos pcr usando um kit de sua escolha.</li>
	<li>Junte-se ao produto pcr de gene resistência aos antibióticos purificado (incluindo sua região promotora) à espinha dorsal plasmítica purificada e funda as regiões homólogas usando montagem isomal20,a 50 °C por 60 min.</li>
	<li>Eletroporato o produto fundido na cepa E. coli DH5α.<ol>
<li>Introduzir 2 μL do produto da etapa 1.3 em 40 μL de pilhas electrocompetent em cuvettes de 2 milímetros em 4 °C e 2.5 kV. Resuspender as células em 1 mL de caldo de lysogeny (LB) médio.</li>
		<li>Transfira o volume total para um tubo de microfúria e incubar 1 h a 37 °C tremendo a 250 rpm em um agitador orbital para permitir a expressão do marcador de resistência no plasmídeo.</li>
		<li>Placa 100 μL das células em placas de ágar LB contendo o antibiótico apropriado (kanamicina 25 μg/mL) para selecionar para o gene de resistência aos antibióticos e, assim, selecionar para células portadoras de plasmídeos. Desça o resto, retire o supernatant, resuspenda as células em 100 μL LB e placa em uma placa de ágar seletiva. Incubar as placas a 37 °C por 24 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A fim verificar clones, extraa os plasmids construídos através da lyse alcalina usando um jogo mini-prep comercial.<ol>
<li>Colheita 5 mL da cultura estacionária durante a noite por centrífuga em 12.000 x g à temperatura ambiente. Resuspenda as células em solução de resuspensão, em seguida, lyse e neutralizar a solução celular. Centrífuga por 5 min a 12.000 x g.</li>
		<li>Transfira o supernatant à coluna de ligação do ADN fornecida no jogo e lave a coluna duas vezes com a solução de lavagem de 500 μL que centrifuging 2x antes de eluting a membrana da coluna com tampão da elução.</li>
		<li>Realize o sequenciamento de Sanger do plasmídeo para confirmar que a sequência está correta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Uma vez verificada a validade plasmítica, eletroporato o plasmídeo (agora pCON) na cepa E. coli MG1655 como descrito acima. Isso produz cepa E. coli MG1655 pCON.</li>
</ol>2. Monitoramento de bactérias portadoras de plasmídeos várias condições ao longo do tempo
NOTA: O experimento de evolução é conduzido com cepas de transporte de plasmídeos em condições não seletivas (mídia LB) em duas temperaturas (37 °C e 20 °C) e três tamanhos de gargalo populacional. O projeto experimental é usado para estudar a persistência plasmídeo várias circunstâncias.
<ol><li>Projeto de um experimento de evolução para acompanhar a frequência plasmídea ao longo do tempo(Figura 2)<ol>
<li>Placa a cepa de transporte de plasmídeo construída(E. coli MG1655 pCON) em placas de ágar LB complementadas com antibióticos (kanamicina 25 μg/mL) e incubada durante a noite a 37 °C.</li>
		<li>Prepare 96 placas de poço profundo com 1 mL de lb médio em cada poço. Como os ancestrais bacterianos, escolha oito colônias aleatórias isoladas da placa ágar em poços independentes. Incubar as placas a 37 °C e 450 rpm em uma placa shaker por 24 h. Prepare um estoque congelado de glicerol dos clones ancestrais.</li>
		<li>No dia seguinte, transferir as oito populações replicar em novas placas de poço profundo de acordo com o projeto experimental (Figura 2). As culturas são diluídas 1:100 (gargalo grande, L), 1:1,000 (gargalo médio, M), ou 1:10,000 (pequeno gargalo, S) em um volume total de 1 mL LB usando PBS para diluição. As culturas diluídas são incubadas a 37 °C e 20 °C. NOTA: É muito importante controlar a contaminação cruzada na placa de 96 poços profundos. Assim, use um design de placa de xadrez intercalando poços inoculados com meio LB livre de bactérias. Use esse padrão através de todo o experimento de evolução.</li>
		<li>As culturas incubadas a 37 °C são transferidas a cada 12 h, enquanto as culturas a 20 °C são transferidas a cada 24 h. NOTA: Durante cada evento de transferência, o tratamento de tamanho de gargalo é aplicado e a transferência em série é repetida ao longo de um total de 98 transferências. O número de transferências dependerá do design experimental dos leitores.</li>
		<li>Prepare um estoque congelado de glicerol de todas as populações regularmente, 2x por semana.</li>
	</ol></li>
	<li>Monitoramento da frequência plasmírica por revestimento de réplicas (Figura 3) NOTA: Durante o experimento de evolução, a frequência de células portadoras de plasmídeos na população é estimada a partir da proporção de hospedeiros. O protocolo de revestimento de réplica é mostrado na Figura 3.<ol>
<li>Para determinar a frequência plasmídea na população durante o experimento de evolução, as culturas estacionárias são em série diluídas e banhadas em placas de ágar LB não seletivas. Ajuste a diluição de acordo com um rendimento de 250-500 colônias por placa. NOTA: Prepare placas grossas do ágar de LB antes do revestimento (~30 ágar do mL).</li>
		<li>As populações banhadas são incubadas para o crescimento durante a noite de acordo com sua temperatura de crescimento no experimento. NOTA: As colônias precisam ser pequenas, assim incubam <24 h a 37 °C.</li>
		<li>Após o crescimento durante a noite, contar todas as colônias usando uma estação manual ou automática contagem de colônias e calcular o tamanho total da população bacteriana nas culturas. NOTA: Colônias na borda da placa ágar não devem ser incluídas na contagem total de células bacterianas.</li>
		<li>Esterilizar peças quadradas (~20 x 20 cm) de veludo de algodão por autoclismo. NOTA: O pano de veludo precisa ser 100% algodão para ser autoclavável. É importante secar o pano após a esterilização.</li>
		<li>Após a esterilização do pano de veludo, coloque o pano em um bloco redondo e corrigi-lo com um anel de metal. É crucial para evitar rugas. Coloque cuidadosamente a placa com as colônias cultivadas (ágar voltada para baixo) na superfície de pano de veludo fixo. Certifique-se de que todas as colônias tocam a superfície de veludo tocando cuidadosamente na placa de Petri de forma circular.</li>
		<li>Retire cuidadosamente a placa de ágar LB e coloque uma placa seletiva complementada com antibióticos (kanamicina 25 μg/mL) no pano de veludo. Certifique-se que a placa está tocando todo o veludo com cuidado batendo na placa de Petri como descrito antes. Depois, retire a placa. Deixe as placas à temperatura ambiente para o crescimento durante a noite.</li>
		<li>No dia seguinte, avalie a placa de ágar LB e a placa seletiva. Colônias que crescem na mídia seletiva são contadas como hospedeiros plasmid (ou seja, resistentes a antibióticos), enquanto os pontos livres de colônias são colônias que eram livres de plasmídeos e, portanto, não são resistentes ao antibiótico (ou seja, perdeu o plasmídeo). Isso é feito colocando as placas umasobre a outra e comparando o crescimento (ou seja, marque todas as colônias desaparecidas) e contando o número da colônia em ambas as placas. Isso produz o número de células que perderam o plasmídeo durante o experimento de evolução.</li>
		<li>Repita este procedimento ao longo de todo o experimento de evolução de forma regular (por exemplo, a cada 14 transferências).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Visualização de multimers plasmídeos usando eletroforese de gel
NOTA: Plasmid extração de plasmídeos de baixa cópia muitas vezes leva à contaminação com o DNA cromossômico hospedeiro que precisa ser enzimaticamente digerido antes da visualização.
<ol><li>Extraia dna plasmite de uma cultura de células estacionárias de 5 mL usando lonina alcalina, conforme descrito no passo 1.5.</li>
	<li>Posteriormente, trate o DNA plasmínico extraído com um DNase dependente de ATP que só corta dna cromossômico para remover a contaminação cromossômica de DNA (ver Tabela de Materiais). Incubar a 37 °C por 30 min. Depois, limpar o DNA usando um kit de sua escolha.</li>
	<li>Para criar moléculas de círculo aberto de todas as conformações plasmáticas (monomers ou multimers), incubar as amostras de DNA plasmídeo com uma enzima de corte (Nb.BsrDI) e incubar por 30 min a 65 °C.</li>
	<li>Paralelamente, para criar moléculas de plasmídeos lineares (ou seja, para comparação de tamanho plasmídeo), use uma enzima de restrição de sua escolha (por exemplo, HindIII) que cede o plasmídeo uma vez. NOTA: Isso resulta em monomers lineares de dna plasmid. Moléculas de círculo aberto não migram de forma linear.</li>
	<li>Para visualizar o tamanho plasmínico e conformação, eletroforrese as amostras de DNA plasmídeo cortado e linear para 120 min em 4,3 V / cm em um 1% (w / v) agarose gel e 1× TAE buffer. As amostras são manchadas com verde Midori e o gel é visualizado em um sistema de imagem gel (ver Tabela de Materiais). Use uma escada de 1 kbp.</li>
</ol>

<ol>
	<li>San Millan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+plasmid-mediated+antibiotic+resistance+in+the+clinical+context.">Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context.</a> Trends in Microbiology. 26 (12), 978-985 (2018).</li><li>Bruto, M., James, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+crassostreae,+a+benign+oyster+colonizer+turned+into+a+pathogen+after+plasmid+acquisition.">Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition.</a> The ISME Journal. 11 (4), 1043-1052 (2017).</li><li>von Wintersdorff, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer.">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (110), 305-310 (2016).</li><li>Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+and+the+dynamics+of+adaptation+and+genome+evolution+in+microbial+populations.">Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations.</a> ISME Journal. 11 (10), 2181-2194 (2017).</li><li>De Gelder, L., Williams, J. J., Ponciano, J. E. M., Sota, M., Top, E. 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Os autores não têm nada a divulgar.

Neste protocolo, apresentamos uma abordagem que combina técnicas de biologia molecular, evolução experimental e visualização de DNA para investigar o papel da evolução plasmídea para a persistência da resistência aos antibióticos em bactérias. Embora a abordagem apresentada combine métodos de diferentes áreas de pesquisa, todas as técnicas aplicadas são simples e podem ser realizadas em um laboratório de microbiologia padrão.
Os passos mais críticos no protocolo incluem a construção da cepa do sistema modelo que inclui a validação genética do genótipo de transporte de plasmídeos. Notavelmente, muitos plasmídeos naturalmente codificam genes de resistência aos antibióticos. Assim, o leitor pode omitir a etapa 1 do protocolo e prosseguir diretamente com a etapa 2. Em seguida, os experimentos de evolução devem incluir um design aleatório de replicar populações para que os resultados não sejam tendenciosos pela posição das populações replicadas na placa de poço profundo. Além disso, é especialmente importante realizar cuidadosamente as etapas de transferência e diluição em série no experimento de evolução, pois a contaminação falsificaria os resultados. Por último, o revestimento da réplica deve ser conduzido com grande cuidado. O tamanho grande da colônia pode ser um problema, mas pode ser evitado incubando as placas por menos de 24 h. Da mesma forma, o número de colônias em uma placa pode influenciar os resultados de revestimento de réplicas. Portanto, as populações precisam ser diluídas antes do revestimento e da replicação.
Uma das maiores vantagens da nossa abordagem é que é pode ser facilmente reproduzida sem a necessidade de equipamentos pesados. Além disso, outra vantagem do revestimento de réplicas para seguir genes de marcadores é que apenas células vivas são avaliadas, em contraste com a citometria de fluxo ou qPCR em que as células mortas podem ser avaliadas como vivas. Assim, o revestimento da réplica introduz menos polarização à contagem de pilhas plasmídeos-carreg. No entanto, uma limitação do revestimento de réplicas pode ser o tamanho da população (ou seja, o número celular) que é possível avaliar em uma corrida experimental.
Usando nossa abordagem, mostramos recentemente que a evolução da estabilidade plasmídea potencializa a persistência de genes de resistência aos antibióticos em bactérias. Assim, desenvolvemos uma abordagem como uma ferramenta para seguir a persistência de resistência mediada pelo plasmídeo que é de grande importância para acompanhar a resistência ao longo do tempo, especialmente em condições sem a presença de antibióticos.

Plasmídeos são elementos genéticos circulares, auto-replicantes que são onipresentes em procariotes. São agentes de transferência lateral de genes, pois podem transferir traços entre populações microbianas e, portanto, são considerados um papel importante na evolução microbiana. Plasmids são motores de rápida adaptação às condições de limitação do crescimento ao longo de um curto período de tempo (por exemplo, na presença de antibióticos ou pesticidas1)e são responsáveis pela transição a longo prazo para outros modos de estilo de vida (por exemplo, surgimento de patogégenicidade2). Os exemplos mais marcantes para o impacto dos plasmídeos na transferência de genes estão documentados em ecossistemas expostos a níveis flutuantes de antibióticos, como clínicas médicas ou em fazendas industriais3. Devido à forte seleção positiva, muitos plasmídeos codificam para genes de resistência antimicrobiana e muitas vezes são encontrados para conferir multiresistência ao seu hospedeiro bacteriano. Os plasmídeos permitem a migração entre populações ou espécies bacterianas, resultando em uma rápida propagação da resistência antimicrobiana múltipla. condições não seletivas plasmídeos não são essenciais para a célula e muitas vezes são referidos como elementos parasitas. No entanto, plasmídeos são onipresentes na natureza e sua evolução está altamente entrelaçada com a dos cromossomos bacterianos. Plasmid persistência em ambientes naturais (flutuante e não seletivo) continua a ser mal compreendida, mas é de grande importância para a nossa compreensão da persistência de genes de resistência aos antibióticos na natureza.
A evolução experimental é uma ferramenta poderosa para o estudo de populações microbianas4. A evolução experimental demonstrou que a forte seleção de manutenção plasmídea leva à evolução compensatória (ou seja, adaptativa) do cromossomo plasmídeo ou hospedeiro que reduz o custo de aptidão plasmídeo e, por sua vez, facilita a abundância plasmídea (ou seja, persistência plasmin)5,6,7. Assim, seguir a interação plasmídeo-hospedeiro ao longo do tempo pode revelar mecanismos importantes de adaptação de ambos os elementos. Além disso, a evolução experimental permite quantificar a abundância de células portadoras de plasmídeos ao longo do tempo várias condições8,9,10.
A persistência plasmida em experimentos de evolução pode ser monitorada por várias estratégias, incluindo citometria de fluxo por classificação de células ativadas fluorescentes (FACS)11,PCR quantitativa (qPCR)11,ou em métodos baseados em cultivo. A citometria do fluxo requer uma máquina FACS e a introdução de um gene marcador detectável (fluorescente), como a proteína fluorescente verde (GFP), no plasmídeo. No entanto, a expressão gfp pode alterar várias propriedades celulares e, além disso, influenciar a localização plasmídea na célula12, que por sua vez pode influenciar a herança plasmid durante a divisão celular. Uma aproximação do qPCR para medir a abundância do plasmídeo pode ser inclinada altamente pelo número de cópia do plasmídeo, que pode variar extremamente ao longo da fase bacteriana do crescimento e sobre o tempo13. Por fim, uma abordagem baseada na cultura e revestimento requer a introdução de um gene marcador selecionável. Este pode ser um gene de resistência aos antibióticos, que é muitas vezes codificado em plasmídeos naturais; assim, nenhuma manipulação genética é necessária. A resistência aos antibióticos pode ser seguida por uma abordagem tradicional de revestimento de réplicas. Assim, para estudar a dinâmica natural do plasmídeo, o revestimento da réplica é bem-serido monitorar a resisitance antibiótica plasmídeo-codificada14.
Para visualizar moléculas plasmid (por exemplo, para avaliar o tamanho plasmídeo) vários métodos podem ser aplicados. Plasmídeos inteiros podem ser amplificados usando uma abordagem baseada em PCR. No entanto, isso requer o design de primers específicos, que podem ser desafiadores durante um experimento de evolução, porque a sequência plasmídea pode mudar ao longo do tempo. Além disso, é difícil amplificar multimers plasmídeos em uma abordagem baseada em PCR devido a vários locais de ligação para os primers PCR. Moléculas plasméricas multiméricas podem aparecer após a rescisão da replicação plasmídea ou através da recombinação de moléculas plasminúdicas e são principalmente orientadas da cabeça à cauda15. Outra abordagem da visualização plasmática combina digestão enzimática de moléculas de plasmídeos por endonucleases de DNA que se apegam ou cortam uma cadeia de DNA plasmídeo com análise de eletroforese de gel agarose. O mesmo plasmídeo de tamanhos diferentes (por exemplo, monomers vs. multimers) resulta em diferentes mobilidades de gel que podem ser observadas ao visualizar as moléculas plasmínicas. Essa abordagem permite a visualização e quantificação de diferentes conformações plasmáticas (ou seja, estados multimerização). A conformação plasmídeo pode ser usada como um indicador de estabilidade plasmídea, já que os multimers plasmídeos são freqüentemente perdidos durante a divisão celular16.
Em um trabalho recente, seguimos a persistência plasmídica em condições que não eram seletivas para abundância de plasmídeos (ou seja, sem seleção de antibióticos). Comparamos a persistência plasmídea em duas temperaturas diferentes (20 °C e 37 °C) e três tamanhos populacionais (ou seja, taxas de diluição). A aplicação de várias taxas de diluição, ou gargalos populacionais, permite a investigação da influência do tamanho da população na evolução bacteriana e plasmídea. Com base em nossos resultados, propomos que plasmídeos podem ser neutros para o seu hospedeiro bacteriano e pode evoluir estabilidade sem qualquer pressão de seleção8. A estabilidade plasmídea evoluída é conferida pela redução da formação multimer plasmídeo8.
Aqui, apresentamos um protocolo para a quantificação da persistência plasmídea e investigação da evolução plasmídea em relação à manutenção de genes de resistência aos antibióticos. O método tem várias etapas, incluindo a inserção de um gene de resistência aos antibióticos a um plasmídeo modelo (que pode ser omitido ao usar um plasmídeo de resistência natural), seguido pelo uso da evolução experimental para avaliar o potencial do plasmídeo para persistir em condições não seletivas, determinando a dinâmica de frequência plasmino ao longo do tempo usando revestimento de réplicas, e a análise do genoma plasmídeo por visualização. O protocolo descrito aqui foi projetado para investigar a evolução e persistência dos plasmídeos, mas também pode ser aplicado para acompanhar a evolução dos genes de resistência cromossômica (ou outros genes marcadores) ao longo do tempo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EN07.1</td>
			<td>2 ml, square</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates (cryo)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1702-8400</td>
			<td>Micro-Dilution Tube System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony counter</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SC6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton velvet</td>
			<td>drapery shop</td>
			<td></td>
			<td>100 % cotton required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652089</td>
			<td>0.1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Gel Extraction kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0832</td>
			<td>PCR fragment clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50125852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (plate shaker)</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaker)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052, 3125000028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Capp</td>
			<td>ME8-1250R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Eurofines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F533S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmidSafe enzyme</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>10059400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica block &#38; metal ring</td>
			<td>VWR</td>
			<td>601-3401</td>
			<td>PVC cylinder 69 mm; ring 102cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resctriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach

Os plasmídeos desempenham um papel importante na ecologia e evolução microbiana como veículos de transferência lateral de genes e reservatórios de funções genéticas acessóras em populações microbianas. Este é especialmente o caso em ambientes em rápida mudança, como a flutuação da exposição aos antibióticos. Recentemente, mostramos que os plasmídeos mantêm genes de resistência aos antibióticos em Escherichia coli sem seleção positiva para a presença plasmídea. Aqui descrevemos um sistema experimental que permite seguir o genótipo plasmídeo e fenótipo em experimentos de evolução a longo prazo. Usamos técnicas moleculares para projetar um plasmídeo modelo que é posteriormente introduzido a uma abordagem experimental do sistema de lote de evolução em um hospedeiro De E. coli. Nós seguimos a freqüência plasmício ao longo do tempo aplicando revestimento de réplica das populações de E. coli, enquanto quantificando a persistência de resistência aos antibióticos. Além disso, monitoramos a conformação de plasmídeos nas células hospedeiras, analisando a extensão da formação de multimer plasmídeo por corte plasmídeo e eletroforese de gel agarose. Tal aproximação permite que nós visualize não somente o tamanho do genoma de plasmídeos em evolução mas igualmente sua conformação topológica um fator altamente importante para a herança plasmídea. Nosso sistema combina estratégias moleculares com abordagens tradicionais de microbiologia e fornece uma configuração para seguir plasmídeos em populações bacterianas ao longo de um longo tempo. A abordagem apresentada pode ser aplicada para estudar uma ampla gama de elementos genéticos móveis no futuro.

Aqui, apresentamos uma abordagem para estudar a evolução plasmídea, quantificando a persistência plasmídeo em uma população. Primeiro, mostramos como construir o plasmídeo carregando cepa E. coli MG1655 pCON que é posteriormente introduzido a um experimento de evolução. Em segundo, nós apresentamos um método direto para seguir a abundância do plasmídeo nas populações bacterianas em desenvolvimento. Finalmente, mostramos como visualizar o tamanho da molécula plasmídea e conformação.
Em nosso trabalho anterior8 usando a abordagem apresentada, realizamos um experimento de evolução após a persistência de plasmídeos de resistência aos antibióticos em E. coli na ausência de antibióticos(Figura 4). Nossos resultados representativos mostram a evolução das populações em 37 °C e uma taxa de diluição de10-4. Após a abundância de células portadoras de plasmídeos, observamos uma diminuição nas células hospedeiras portadoras de plasmídeos de frequência ao longo do tempo (Figura 4). Nossa abordagem nos permitiu descobrir que a perda plasmídea foi resultado da arquitetura do genoma plasmídeo condensado, o que levou à instabilidade plasmísma causada por conflitos introduzidos pela transcrição do gene de resistência e replicação do próprio plasmídeo. A visualização das moléculas plasmínicas nos permitiu descobrir que esses conflitos levaram a uma conformação plasmídea instável (ou seja, formação multimer plasmídeo, Figura 5). No entanto, observamos a evolução da estabilidade plasmídea sem a exposição a antibióticos(Figura 4). A estabilidade evoluída foi conferida por uma duplicação intrínseca plasmídeo que aboliu os conflitos de replicação da transcrição e levou à formação de plasmídeos herdados. Nossos resultados demonstram assim a importância da recombinação e da amplificação do genoma na evolução adaptativa de elementos genéticos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig1.jpg"> Figura 1: Plasmid design de pCON. Representação esquemática da estratégia de clonagem usada para construir o plasmid pCON. A espinha dorsal plasmídea (pBBR1) e o gene da resistência aos antibióticos(nptII)são PCR amplificados e fundidos pela fusão isothermal20. Isso produz o plasmid pCON e a cepa MG1655 pCON. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig2.jpg"> Figura 2: Design do experimento de evolução a longo prazo. Representação esquemática do experimento de transferência em série. As populações de plasmídeos (pCON) são banhadas em mídias seletivas. Colônias ancestrais são escolhidas aleatoriamente a partir da placa e introduzidas em um sistema de transferência em série. As transferências são realizadas com três abordagens diferentes de diluição para simular gargalos populacionais de diferentes tamanhos. As diluições são repetidas em série. O experimento é realizado em dois regimes de temperatura. A freqüência plasmídeo-hospedeiro é medida ao longo do experimento através de revestimento de réplica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig3.jpg"> Figura 3: Revestimento de réplicas. Representação esquemática dos passos utilizados na réplica de revestimento de populações bacterianas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig4.jpg"> Figura 4: Frequência representativa do pCON ao longo do tempo. A persistência do pCON é mostrada como a proporção de hospedeiros (populações representativas) durante o experimento de evolução. Para 98 transferências, as populações de plasmídeos pCON evoluíram em condições não seletivas com um fator de diluição de10-4. Todas as réplicas que carregam o pCON do plasmid diminuíram na população. Posteriormente, as populações foram expostas a antibióticos para incubação noturna e foram cultivadas novamente em condições não seletivas para testar a evolução da estabilidade plasmídea. Este número foi modificado a partir de Wein et al.8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig5.jpg"> Figura 5: Análise representativa da conformação plasmídeo. Visualização do modelo plasmid pCON. Visualizado é o DNA plasmídeo não tratado diretamente após a extração, linearizado dna plasmid, e tratado com DNase que só corta dna cromossômico, bem como enzimática nicked DNA (ou seja, círculo aberto plasmid DNA). Linearizar o plasmídeo mostra que todos os plasmídeos são do mesmo tamanho. A remoção de DNA cromossômico e o nicking pCON revela a presença de dimers e outros multimers. Este número foi modificado a partir de Wein et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior deste número.</a>

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Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Nossa abordagem experimental fornece uma estratégia para seguir a abundância plasmídeo e resistência aos antibióticos ao longo do tempo em populações bacterianas.

Quantificação da resistência aos antibióticos mediada por plasmídeos em uma abordagem de evolução experimental

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Plasmídeos são elementos extracromosomais que são onipresentes na maioria das espécies e habitats bacterianos onde são agentes muito importantes da transferência de genes laterais, pois podem migrar entre as células e entre populações. Um dos exemplos mais marcantes e proeminentes dessa transferência é a disseminação de genes de resistência a antibióticos que são codificados em plasmídeos. Para construir um plasmídeo modelo que codifica um gene de resistência a antibióticos, escolha uma espinha dorsal plasmida e PCR amplifice a espinha dorsal usando uma polimerase de alta fidelidade e primers que se ligam no modelo plasmídeo. No nosso caso, usamos uma espinha dorsal plasmida pBBR1. Em seguida, amplifique o gene de resistência nptII incluindo o promotor nativo Tn5 usando uma polimerase de alta fidelidade. Projete os primers para o gene de resistência com aproximadamente 20 pares de base de complementaridade de sequência à espinha dorsal plasmida. Após os PCRs, mescla a região de homologia do produto PCR do gene de resistência purificada ao backbone plasmídeo purificado usando montagem isotermal a 50 graus por 60 minutos. Transforme o produto fundido em E.Coli DH5-Alpha usando eletroporação. Placa 100 microliter da mistura em mídia seletiva e incubar a 37 graus por cerca de 24 horas. O plasmídeo pode então ser extraído, validado e transformado na cepa do tipo selvagem E.coli MG1655. Isso produz cepa MG1655 pCON.Durante a exposição a antibióticos, as bactérias precisam do plasmídeo para sobreviver. Assim, o plasmídeo está sob seleção positiva. Em condições não-seletivas, portanto, sem antibióticos, o plasmídeo é descartável para a célula. O objetivo do nosso estudo foi seguir os plasmídeos sob tais condições não-seletivas ao longo do tempo. Para isso, equipamos os pequenos plasmídeos com um gene de resistência a antibióticos e introduzimos-no a Escherichia coli. Realizamos um experimento evolutivo e monitoramos a frequência dos plasmídeos através de um revestimento de réplicas. O plasmídeo que carrega cepa mg1655 pCON é agora introduzido em um experimento de evolução. Primeiro, placa de mg1655 pCON em placas de ágar LB suplementadas com antibióticos e incubar durante a noite a 37 graus. A partir desta placa escolha aleatoriamente as 8 colônias ancestrais e incubar durante a noite a 37 graus com agitação constante. No dia seguinte, as populações são transferidas para o experimento que é realizado em 96 placas de poços profundos. É altamente importante distribuir aleatoriamente as réplicas através da placa. Por exemplo, em uma abordagem de tabuleiro de xadrez. Em nosso experimento as culturas são diluídas e transferidas com diferentes taxas de diluição e em duas temperaturas. Durante cada evento de transferência, o tratamento de diluição é aplicado e a transferência serial é repetida ao longo de um total de 98 transferências. Ao longo do experimento de evolução, a frequência de plasmídeos na população é estimada a partir da proporção de células portadoras de plasmídeos. O revestimento de réplica foi popularizado por Esther e Joshua Lederberg na década de 1950, onde o usaram para estudar a resistência a medicamentos em bactérias. O método permitirá que eles melhorem sua varredura para fenótipos e, ao final do estudo, revelou que a resistência à penicilina pode surgir em bactérias devido a mutações espontâneas no genoma. Para determinar a frequência plasmida na população durante o experimento, as culturas estacionárias são diluídas e banhadas em placas de ágar LB não seletivas. Ajuste a diluição de acordo com um rendimento de 250 a 500 colônias por placa. As populações banhadas são incubadas para crescimento noturno a 37 graus por menos de 24 horas. Colônias são melhor replicadas quando ainda são pequenas. Após o crescimento da noite para o dia, todas as colônias utilizam um contador de colônias automatizados da escolha do leitor. Isso produz o tamanho total da população de bactérias nas culturas. Note que as colônias na borda da placa devem ser deixadas de fora. Para replicar as placas, você precisa de placas de ágar seletivas complementadas com antibióticos, um bloco redondo, um anel de metal que se encaixa no bloco, e pano de veludo estéril. O pano precisa ser 100% algodão, pois isso pode ser esterilizado por autoclavação. Coloque o pano no bloco e fixe-o com o anel de metal.Coloque cuidadosamente a placa com as colônias contadas na superfície fixa do pano de veludo. Toque na placa em movimentos circulares para que toda a superfície da placa toque no pano. É muito importante que todas as colônias toquem o veludo. Retire a placa LB e coloque a placa seletiva no veludo. Repita a batida cuidadosa. É novamente importante que a placa toque completamente o veludo. Depois, remova a placa seletiva. As placas são incubadas à temperatura ambiente durante a noite. No dia seguinte, tanto o LB quanto a placa de antibióticos são necessários para avaliação. Coloque as placas uma acima da outra e compare o crescimento. Você pode facilmente detectar espaços livres de colônias. Estas são as colônias que não são resistentes aos antibióticos. Assim, essas colônias perderam o plasmídeo. No final, marque quantas colônias estão faltando na placa de antibióticos. Este número lhe dá a perda plasmida. Repita a réplica de todas as populações durante o experimento de evolução semanalmente. A perda plasmida pode ser causada por multiformação plasmida. Ao trabalhar em uma construção plasmida dizer para a expressão de um determinado gene em seu hospedeiro preferido tensão o comportamento nativo de um plasmid in vivo no que diz respeito à confirmação que um estado pode tomar é geralmente algo que é negligenciado. Mas, em um contexto evolutivo, tal confirmação de mudanças pode ser de grande importância. A análise das confirmações plasmid pode ser um esforço muito complicado. Especialmente multimers plasmídeos são difíceis de analisar porque não podem ser identificados adequadamente pelo PCR ou por sequenciamento. Por outro lado, multimers plasmídeos são difíceis de analisar por eletroforese de gel devido ao seu tamanho potencialmente grande e sua lenta mobilidade eletroforética. Nosso protocolo oferece um método simples e simples para a triagem e identificação de multimers plasmídeos em que eu diria qualquer preparação plasmida. Para as moléculas de plasmídeo visual extrair o plasmídeo de 5 mL cultura celular estacionária durante a noite usando lise alcalina. A extração plasmida de plasmídeos de cópia baixa muitas vezes leva à contaminação com DNA cromossômico hospedeiro que precisa ser digerido antes da visualização. Para remover a contaminação cromossômica do DNA, trate o DNA plasmídeo extraído com Plasmid-Safe

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Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Concepção e utilização de um baixo custo, Automated Morbidostat para Adaptive Evolução das bactérias sob Antibiótico Seleção de Drogas

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