Name: quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach
Uploaded: 2019-12-14T14:00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach at JoVE.com

Vi tackar gor Margaryan för kreativt stöd och tekniskt stöd. Detta arbete stöddes av ZMB Young Scientist Grant 2017/2018 (tilldelas TW) och DFG Focus program 1819 (Grant nr. DA1202/2-1 tilldelas TD).

1. konstruktion av en modell plasmid redovisade en antibiotikaresistensgen
Anmärkning: stammen Escherichia coli K-12 MG1655 användes som modellorganism i alla experiment (DSM nr 18039, Tysk samling av mikroorganismer och cell kulturer, DSMZ). Stammen E. coli DH5α17 användes under plasmid konstruktion.
<ol><li>PCR förstärker den plasmid-ryggrad som du väljer och förstärker motstånds genen inklusive promotionsregionen med PCR (figur 1).<ol>
<li>PCR förstärker plasmidstamnätet med hjälp av en HiFi-polymeras och oligonukleotides pBBR1_for (5 '-GCGGCCACCGGCTGGCT-3 ') och pBBR1_rev (5 '-TACCGGCGCGGCAGCGTGACCC-3 ') på plasmid Template pLC (GenBank ACC. No. MH238456)18.</li>
		<li>PCR förstärker resistensgenen nptII inklusive den infödda Tn5 promotorn19 med hjälp av en HiFi-polymeras och oligonukleotides NPTII_GIB_FOR (5 '-GCGCCGGTAGATCTGCTCATGTTTGAAGCTTCACGCTGCCGCA-3 ') och NPTII_GIB_REV (5 '-CGGTGGCCGCCAAAAAGGCCATCCGTCAGGTCAGAAGAACTCGT-3 '). NptII -genen kodar för en neomycinfosfotransferas och ger resistens mot kanamycin. Anmärkning: designa primers för motstånds gen med cirka 20 BP kompletterande sekvens till plasmid ryggraden att det kommer att smältas till.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rengör båda PCR-fragmenten med ett kit som du väljer.</li>
	<li>Gå med i den renade antibiotikaresistens genen PCR produkt (inklusive dess promotor region) till den renade plasmid ryggraden och säkring av homolog regioner med isotermisk montering20, vid 50 ° c för 60 min.</li>
	<li>Elektroporera den brända produkten i stammen E. coli DH5α.<ol>
<li>Introducera 2 μl av produkten från steg 1,3 till 40 μl elektrokompetenta celler i 2 mm kyvetter vid 4 ° c och 2,5 kV. Resuspend celler i 1 mL lysogeny buljong (LB) medium.</li>
		<li>Överför den totala volymen till ett mikrofugrör-rör och inkubera 1 h vid 37 ° c skakning vid 250 rpm i en orbitalskak för att möjliggöra uttrycket av motstånds markören på Plasmiden.</li>
		<li>Platta 100 μL av cellerna på LB-agar plattor som innehåller lämplig antibiotika (kanamycin 25 μg/mL) för att välja för antibiotikaresistens genen och därmed välja för plasmid-bärande celler. Snurra ner resten, ta bort supernatanten, Omsuspendera cellerna i 100 μL LB och tallrik på en selektiv agarplatta. Inkubera plattorna vid 37 ° c i 24 timmar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>För att kontrollera kloner, extrahera de konstruerade plasmiderna via alkaliska Lys med hjälp av en kommersiell mini-prep kit.<ol>
<li>Skörda 5 mL av den stillastående natten kulturen genom centrifugering vid 12 000 x g vid rumstemperatur. Återsuspendera cellerna i resuspension lösning, sedan lyse och neutralisera cell lösningen. Centrifugera i 5 min vid 12 000 x g.</li>
		<li>Överför supernatanten till den DNA-bindnings kolumn som finns i satsen och Tvätta kolonnen två gånger med 500 μL tvättlösning centrifugering 2x innan du eluera kolonnmembranet med elutionsbuffert.</li>
		<li>Utför Sanger sekvensering av plasmid för att bekräfta att sekvensen är korrekt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>När plasmid giltighet verifieras, elektroporate plasmid (nu pCON) i stammen E. coli MG1655 som beskrivs ovan. Detta ger stam E. coli MG1655 PCON.</li>
</ol>2. övervakning av plasmid-bärande bakterier under olika förhållanden över tid
Anmärkning: evolutions experimentet genomförs med plasmid-bärande stammar under icke-selektiva förhållanden (LB-Media) i två temperaturer (37 ° c och 20 ° c) och tre flaskhalsar i populationen. Den experimentella designen används för att studera plasmid persistens under olika förhållanden.
<ol><li>Design av en evolution experiment att följa plasmid frekvens över tid (figur 2)<ol>
<li>Platta den konstruerade plasmid-bärande stammen (E. coli MG1655 PCON) på lb-agar-plattor kompletterade med antibiotika (kanamycin 25 μg/ml) och inkubera över natten vid 37 ° c.</li>
		<li>Förbered 96 djupa plattor med 1 mL LB-medium i varje brunn. Som bakterie förfäderna, plocka åtta slumpmässigt isolerade kolonier från agarplattan i oberoende brunnar. Inkubera plattorna vid 37 ° c och 450 rpm på en tallrik Shaker för 24 h. Förbered en fryst glycerol lager av förfädernas kloner.</li>
		<li>Nästa dag överför de åtta replikationerna till nya djupa plåtar enligt den experimentella konstruktionen (figur 2). Kulturerna späds 1:100 (stor flaskhals, L), 1:1000 (medelhög flaskhals, M), eller 1:10000 (liten flaskhals, S) i en total volym av 1 mL LB med hjälp av PBS för spädning. De utspädda kulturerna inkuberas vid 37 ° c och 20 ° c. Obs: det är mycket viktigt att kontrollera korskontaminering i 96-Deep-well plattan. Sålunda, använda en rutmönster plattan design av interkalerande inokulerade brunnar med bakteriefria lb medium. Använd det här mönstret genom hela evolution-experimentet.</li>
		<li>Kulturerna inkuberas vid 37 ° c överförs varje 12 h medan kulturer vid 20 ° c överförs varje 24 h. Obs: under varje överföring händelse flaskhalsen storlek behandling tillämpas och seriell överföring upprepas över totalt 98 överföringar. Antalet överföringar kommer att bero på läsarnas experimentella design.</li>
		<li>Förbered en fryst glycerol lager av alla populationer regelbundet, 2x en vecka.</li>
	</ol></li>
	<li>Övervakning av plasmidfrekvensen genom replikplätering (figur 3) Notera: under evolutions experimentet uppskattas frekvensen av plasmidbärande celler i populationen från andelen värdar. Protokollet för replik plätering visas i figur 3.<ol>
<li>För att bestämma plasmid frekvensen i befolkningen under evolutions experimentet, är stationära kulturer seriellt utspädda och pläterade på icke-selektiva lb-agar plattor. Justera spädningen enligt en avkastning på 250-500 kolonier per platta. Anmärkning: Förbered tjocka LB-agar plattor före pläteringen (~ 30 mL agar).</li>
		<li>Den pläterade populationer inkuberas för över natten tillväxt enligt deras tillväxt temperatur i experimentet. Notera: kolonierna måste vara små, så Inkubera < 24 h vid 37 ° c.</li>
		<li>Efter över natten tillväxt, räkna alla kolonier med hjälp av en manuell eller automatiserad koloni räkna Station och beräkna den totala bakterie populationen storlek i kulturerna. Observera: kolonier vid kanten av agarplattan bör inte inkluderas i det totala antalet bakterieceller.</li>
		<li>Sterilisera fyrkantiga stycken (~ 20 x 20 cm) bomull sammet genom autoklav. Obs: sammet trasa måste vara 100% bomull att vara Autoklaverbar. Det är viktigt att torka trasan efter sterilisering.</li>
		<li>Efter sterilisering av sammet trasa, Placera duken på ett runt block och fixa det med en metallring. Det är viktigt att undvika rynkor. Försiktigt placera plattan med de odlade kolonierna (agar vänd nedåt) på fast sammet trasa yta. Se till att alla kolonier vidrör sammets ytan genom att försiktigt knacka på petriskål i ett cirkulärt sätt.</li>
		<li>Ta försiktigt bort LB-agarplattan och placera en selektiv tallrik kompletterad med antibiotika (kanamycin 25 μg/mL) på sammet duken. Se till att plattan vidrör alla sammet genom att försiktigt knacka på petriskål som beskrivs tidigare. Ta sedan bort plattan. Lämna plattorna i rumstemperatur för att växa över natten.</li>
		<li>Nästa dag, utvärdera både LB agar plattan och den selektiva plattan. Kolonier som växer på selektiv Media räknas som plasmid värdar (dvs antibiotikaresistenta), medan kolonin-fria fläckar är kolonier som var plasmid-fri och är därmed inte resistenta mot antibiotika (dvs förlorade plasmiden). Detta görs genom att placera plattorna över varandra och jämföra tillväxten (dvs., markera eventuella saknade kolonier) och räkna kolonin nummer på båda plattorna. Detta ger det antal celler som förlorade plasmiden under evolutions experimentet.</li>
		<li>Upprepa detta förfarande längs hela evolution experimentet på ett regelbundet sätt (t. ex. varje 14 överföringar).</li>
	</ol></li>
</ol>3. visualisering av plasmid multimers med hjälp av gel elektrofores
Anmärkning: plasmid utvinning av låg-kopia plasmider leder ofta till kontaminering med värd kromosomala DNA som måste enzymatiskt smälta före visualisering.
<ol><li>Extrahera plasmid-DNA från en 5 mL stationär över natten cellkultur med alkaliska Lys som beskrivs i steg 1,5.</li>
	<li>Efteråt, behandla den extraherade plasmid-DNA med en ATP-beroende DNase som bara klipper kromosomalt DNA för att ta bort kromosomala DNA-kontaminering (se tabell över material). Inkubera vid 37 ° c i 30 minuter efteråt, rengör DNA med ett kit som du väljer.</li>
	<li>För att skapa öppna cirkel molekyler av alla plasmid-konformationer (monomerer eller multimers), inkubera plasmid-DNA-proverna med ett hack-enzym (NB. bsrdi) och inkubera i 30 min vid 65 ° c.</li>
	<li>Parallellt, för att skapa linjära plasmid molekyler (dvs. för plasmid Storleksjämförelse), Använd ett begränsnings enzym som du väljer (t. ex., HindIII) som klyver plasmiden en gång. Anmärkning: Detta resulterar i linjära DNA plasmid monomerer. Öppna cirkel molekyler migrerar inte på ett linjärt sätt.</li>
	<li>För att visualisera plasmid storlek och konformation, behandla den Hack och linjär plasmid DNA prover för 120 min vid 4,3 V/cm i en 1% (w/V) aguppstod gel och 1 × Tae buffert. Proverna färgas med Midori Green och gelen visualiseras på ett gel avbildningssystem (se tabell över material). Använd en 1 KBP stege.</li>
</ol>

<ol>
	<li>San Millan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+plasmid-mediated+antibiotic+resistance+in+the+clinical+context.">Evolution of plasmid-mediated antibiotic resistance in the clinical context.</a> Trends in Microbiology. 26 (12), 978-985 (2018).</li><li>Bruto, M., James, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vibrio+crassostreae,+a+benign+oyster+colonizer+turned+into+a+pathogen+after+plasmid+acquisition.">Vibrio crassostreae, a benign oyster colonizer turned into a pathogen after plasmid acquisition.</a> The ISME Journal. 11 (4), 1043-1052 (2017).</li><li>von Wintersdorff, C. J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissemination+of+antimicrobial+resistance+in+microbial+ecosystems+through+horizontal+gene+transfer.">Dissemination of antimicrobial resistance in microbial ecosystems through horizontal gene transfer.</a> Frontiers in Microbiology. 7 (110), 305-310 (2016).</li><li>Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+evolution+and+the+dynamics+of+adaptation+and+genome+evolution+in+microbial+populations.">Experimental evolution and the dynamics of adaptation and genome evolution in microbial populations.</a> ISME Journal. 11 (10), 2181-2194 (2017).</li><li>De Gelder, L., Williams, J. J., Ponciano, J. E. M., Sota, M., Top, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+plasmid+evolution+results+in+host-range+expansion+of+a+broad-host-range+plasmid.">Adaptive plasmid evolution results in host-range expansion of a broad-host-range plasmid.</a> Genetics. 178 (4), 2179-2190 (2008).</li><li>Harrison, E., Guymer, D., Spiers, A. J., Paterson, S., Brockhurst, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+compensatory+evolution+stabilizes+plasmids+across+the+parasitism-mutualism+continuum.">Parallel compensatory evolution stabilizes plasmids across the parasitism-mutualism continuum.</a> Current Biology. 25 (15), 2034-2039 (2015).</li><li>Bouma, J. E., Lenski, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+a+bacteria/plasmid+association.">Evolution of a bacteria/plasmid association.</a> Nature. 335 (6188), 351-352 (1988).</li><li>Wein, T., H&#252;lter, N. F., Mizrahi, I., Dagan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+plasmid+stability+under+nonselective+conditions+maintains+antibiotic+resistance.">Emergence of plasmid stability under nonselective conditions maintains antibiotic resistance.</a> Nature Communications. 10 (1), 2595 (2019).</li><li>Loftie-Eaton, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+mutations+improve+general+permissiveness+to+antibiotic+resistance+plasmids.">Compensatory mutations improve general permissiveness to antibiotic resistance plasmids.</a> Nature Ecology &amp; Evolution. 1 (9), 1354-1363 (2017).</li><li>Millan, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+selection+and+compensatory+adaptation+interact+to+stabilize+non-transmissible+plasmids.">Positive selection and compensatory adaptation interact to stabilize non-transmissible plasmids.</a> Nature Communications. 5 (1), 1-11 (2014).</li><li>Loftie-Eaton, W., Tucker, A., Norton, A., Top, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+real-time+quantitative+PCR+as+tools+for+assessing+plasmid+persistence.">Flow cytometry and real-time quantitative PCR as tools for assessing plasmid persistence.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (17), 5439-5446 (2014).</li><li>M&#252;nch, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+fixation+of+plasmids+during+recombinant+protein+production+in+Bacillus+megaterium+results+in+population+heterogeneity.">Polar fixation of plasmids during recombinant protein production in Bacillus megaterium results in population heterogeneity.</a> Applied and Environmental Microbiology. 81 (17), 5976-5986 (2015).</li><li>Jahn, M., Vorpahl, C., H&#252;bschmann, T., Harms, H., M&#252;ller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Copy+number+variability+of+expression+plasmids+determined+by+cell+sorting+and+Droplet+Digital+PCR.">Copy number variability of expression plasmids determined by cell sorting and Droplet Digital PCR.</a> Microbial Cell Factories. 15 (1), 211 (2016).</li><li>Lederberg, J., Lederberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replica+plating+and+indirect+selection+of+bacterial+mutants.">Replica plating and indirect selection of bacterial mutants.</a> Journal of Bacteriology. 63, 399-406 (1952).</li><li>Summers, D. K., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimerization+of+high+copy+number+plasmids+causes+instability:+ColE1+encodes+a+determinant+essential+for+plasmid+monomerization+and+stability.">Multimerization of high copy number plasmids causes instability: ColE1 encodes a determinant essential for plasmid monomerization and stability.</a> Cell. 36 (4), 1097-1103 (1984).</li><li>Summers, D. K., Beton, C. W., Withers, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicopy+plasmid+instability:+the+dimer+catastrophe+hypothesis.">Multicopy plasmid instability: the dimer catastrophe hypothesis.</a> Molecular Microbiology. 8 (6), 1031-1038 (1993).</li><li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids.">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li><li>Ilhan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregational+drift+and+the+interplay+between+plasmid+copy+number+and+evolvability.">Segregational drift and the interplay between plasmid copy number and evolvability.</a> Molecular Biology and Evolution. 36 (3), 472-486 (2019).</li><li>Beck, E., Ludwig, G., Auerswald, E. A., Reiss, B., Schaller, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+sequence+and+exact+localization+of+the+neomycin+phosphotransferase+gene+from+transposon+Tn5.">Nucleotide sequence and exact localization of the neomycin phosphotransferase gene from transposon Tn5.</a> Gene. 19 (3), 327-336 (1982).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

I detta protokoll presenterar vi ett förhållningssätt som kombinerar tekniker inom molekylärbiologi, experimentell evolution, och DNA-visualisering för att undersöka rollen av plasmid evolution för ihållande antibiotikaresistens hos bakterier. Även om den presenterade metoden kombinerar metoder från olika forskningsområden, är alla tillämpade tekniker enkla och kan utföras i ett standardiserat mikrobiologi laboratorium.
De mest kritiska stegen i protokollet omfattar byggandet av modell systemet stam som omfattar genetisk validering av plasmid bär ande genotyp. Särskilt, många plasmider koda naturligt antibiotikaresistens gener. Därför kan läsaren utelämna steg 1 i protokollet och gå direkt vidare med steg 2. Vidare bör evolutions experimenten innefatta en slumpmässig utformning av replikat populationer så att resultaten inte är partiska av positionen för de replikat populationerna i djup-brunn plattan. Dessutom är det särskilt viktigt att noggrant genomföra seriell överföring och utspädning steg i evolution experiment som kontaminering skulle för falska resultaten. Slutligen bör replika plätering genomföras med stor omsorg. Stor koloni storlek kan vara ett problem, men det kan undvikas genom inkuberande plattorna för mindre än 24 h. På samma sätt kan antalet kolonier på en tallrik bias replika resultat. Därför måste populationer spädas före plätering och replikering.
En av de största fördelarna med vår strategi är att det är enkelt att reproducera utan att behöva ha någon tung utrustning. Dessutom, en annan fördel med replika plätering att följa markör gener är att endast levande celler utvärderas, i motsats till flödescytometri eller qPCR där döda celler kan utvärderas som levande. Sålunda, replika plätering introducerar mindre bias till räkning av plasmid-bärande celler. Icke desto mindre, en begränsning av replika plätering kan vara befolkningsstorlek (dvs., cell nummer) som är möjligt att utvärdera i en experimentell körning.
Med vårt förhållningssätt har vi nyligen visat att plasmid stabilitet evolution potentierar ihållande antibiotikaresistens gener i bakterier. Således utvecklade vi ett tillvägagångssätt som ett verktyg för att följa plasmid-medierad resistens uthållighet som är av stor betydelse för att följa motstånd över tid, särskilt under förhållanden utan närvaro av antibiotika.

Plasmider är cirkulära, självreplikerande genetiska element som är allmänt förekommande i prokaryoter. De är agenter för lateral genöverföring, eftersom de kan överföra drag mellan mikrobiella populationer, och därmed anses spela en viktig roll i mikrobiell evolution. Plasmider är drivkrafter för snabb anpassning till tillväxtbegränsande förhållanden under en kort tid (t. ex. i närvaro av antibiotika eller bekämpningsmedel1) och är ansvariga för långsiktig övergång till andra livsstils lägen (t. ex. uppkomst av patogenicitet2). De mest slående exemplen på effekterna av plasmider på överföring av gener dokumenteras i ekosystem som utsätts för fluktuerande nivåer av antibiotika, såsom medicinska kliniker eller i industriella gårdar3. På grund av starkt positivt urval, många plasmider koda för antimikrobiell resistens gener och ofta finns att ge multiresistens till sin bakterie värd. Plasmider möjliggör migration mellan populationer eller bakteriearter, vilket resulterar i en snabb spridning av multipla antimikrobiell resistens. Under icke-selektiva villkor plasmider är inte avgörande för cellen och är ofta även kallas parasitiska element. Icke desto mindre, plasmider är allmänt förekommande i naturen och deras utveckling är mycket sammanflätade med den av bakteriella kromosomer. Plasmid uthållighet i naturliga miljöer (fluktuerande och nonselective) är fortfarande dåligt förstått, men det är av stor betydelse för vår förståelse av den ihållande antibiotikaresistens gener i naturen.
Experimentell evolution är ett kraftfullt verktyg för studiet av mikrobiella populationer4. Experimentell evolution visade att införande av starkt urval för plasmid underhåll leder till kompenserande (dvs adaptiv) utveckling av plasmid eller värd kromosom som minskar plasmid Fitness kostnad och i sin tur underlättar plasmid överflöd (dvs., plasmid uthållighet)5,6,7. Således, efter plasmid-värd interaktion över tiden kan avslöja viktiga mekanismer för anpassning av båda elementen. Dessutom möjliggör experimentell evolution en att kvantifiera överflödet av plasmid-bärande celler över tiden under olika förhållanden8,9,10.
Plasmid uthållighet i evolution experiment kan övervakas av flera strategier inklusive flödescytometri av fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS)11, kvantitativ PCR (qPCR)11, eller i odling-baserade metoder. Flödescytometri kräver en FACS maskin och införandet av en detekterbar (fluorescerande) markörgen, såsom den gröna fluorescerande protein (GFP), på Plasmiden. Emellertid, GFP uttryck kan förändra flera cellulära egenskaper och dessutom påverka plasmid plats i cellen12, som i sin tur kan påverka plasmid arv under celldelning. En qPCR metod för att mäta plasmid överflöd kan vara starkt partisk av plasmid kopia nummer, som kan variera kraftigt längs bakterietillväxt fas och med tiden13. Slutligen kräver en kulturbaserad och pläteringsmetod införandet av en valbar markörgen. Detta kan vara en antibiotikaresistensgen, som ofta kodas på naturliga plasmider; Sålunda, ingen genetisk manipulation är nödvändig. Antibiotikaresistens kan följas av en traditionell replik plätering metod. Således, för att studera naturliga plasmid dynamik, replika plätering är väl lämpad att övervaka plasmid-kodade antibiotika resisitance14.
För att visualisera plasmid-molekyler (t. ex. för att utvärdera plasmid-storlek) kan flera metoder tillämpas. Hela plasmider kan amplifieras med hjälp av en PCR-baserad metod. Detta kräver dock utformningen av specifika primers, vilket kan vara utmanande under en evolution experiment, eftersom plasmid sekvens kan ändras med tiden. Dessutom är det svårt att förstärka plasmid-multimers i en PCR-baserad metod på grund av flera bindnings platser för PCR-primers. Multimeric plasmid molekyler kan visas efter plasmid replikering uppsägning eller genom rekombination av plasmid molekyler och är mestadels orienterade head-to-tail15. En annan metod för plasmid visualisering kombinerar enzymatisk nedbrytning av plasmid molekyler av DNA endonukleases att antingen klyva eller Nick en plasmid DNA-sträng med agaros gel elektrofores analys. Samma plasmid av olika storlekar (t. ex. monomerer kontra multimers) resulterar i olika gel utbyten som kan observeras vid visualisering av plasmid molekyler. Detta tillvägagångssätt möjliggör visualisering och kvantifiering av olika plasmid-konformationer (dvs, multimerization stater). Den plasmid konformation kan användas som en indikator på plasmid stabilitet, som plasmid multimers är ofta förlorade under cell Division16.
I ett nyligen arbete, vi följde plasmid uthållighet under förhållanden som inte var selektiva för plasmid överflöd (dvs., utan antibiotikum urval). Vi jämförde plasmid persistens vid två olika temperaturer (20 ° c och 37 ° c) och tre populations storlekar (dvs. utspädnings frekvenser). Att tillämpa olika utspädnings frekvenser, eller befolknings flaskhalsar, gör det möjligt att utreda hur befolkningsstorleken påverkar bakteriell och plasmid evolution. Baserat på våra resultat föreslår vi att plasmider kan vara neutrala till sin bakterie värd och kan utvecklas stabilitet utan något urvals tryck8. Den utvecklade plasmid stabiliteten ges av minskningen av plasmid multimer formation8.
Här presenterar vi ett protokoll för kvantifiering av plasmid Persistens och utredning av plasmid evolution när det gäller upprätthållandet av antibiotikaresistens gener. Metoden har flera steg, inklusive införandet av en antibiotikaresistensgen till en modell plasmid (som kan utelämnas när du använder en naturlig resistens plasmid), följt av användning av experimentell evolution för att bedöma potentialen i plasmid att kvarstå under icke-selektiva villkor samtidigt bestämma plasmid frekvens dynamik över tid med hjälp av replika plätering, och analys av plasmid genom visualisering. Det protokoll som beskrivs här var utformat för att undersöka utvecklingen och persistens av plasmider, men det kan också tillämpas för att följa utvecklingen av kromosomala resistensgener (eller andra markörgener) över tid.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Starlab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates</td>
			<td>Roth</td>
			<td>EN07.1</td>
			<td>2 ml, square</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-deep-well plates (cryo)</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>E1702-8400</td>
			<td>Micro-Dilution Tube System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Colony counter</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SC6+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton velvet</td>
			<td>drapery shop</td>
			<td></td>
			<td>100 % cotton required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis power supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1645070</td>
			<td>Agarose gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation cuvettes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652089</td>
			<td>0.1 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1652660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Gel Extraction kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0832</td>
			<td>PCR fragment clean-up</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneJet Plasmid Miniprep kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K0503</td>
			<td>Plasmid extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibson Assembly</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2611S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>50125852</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (plate shaker)</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator (shaker)</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Innova 44</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inoculating loops</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3125000052, 3125000028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-channel pippetes</td>
			<td>Capp</td>
			<td>ME8-1250R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop 2000/2000c</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligonucleotides</td>
			<td>Eurofines</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion Polymerase</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F533S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000012, 3123000098, 3123000055, 3123000063,</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlasmidSafe enzyme</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>10059400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reaction tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30125150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Replica block &#38; metal ring</td>
			<td>VWR</td>
			<td>601-3401</td>
			<td>PVC cylinder 69 mm; ring 102cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resctriction enzymes</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of plasmid-mediated antibiotic resistance in an experimental evolution approach

Plasmider spelar en viktig roll i mikrobiell ekologi och evolution som fordon i sidled genöverföring och reservoarer av tillbehör gen funktioner i mikrobiella populationer. Detta är särskilt fallet under snabbt föränderliga miljöer som fluktuerande antibiotika exponering. Vi visade nyligen att plasmider upprätthålla antibiotikaresistens gener i Escherichia coli utan positivt val för plasmid närvaro. Här beskriver vi ett experiment system som gör det möjligt att följa både plasmid genotyp och fenotyp i långsiktiga evolution experiment. Vi använder molekylära tekniker för att designa en modell plasmid som sedan introduceras till en experimentell evolution satsvis system strategi i en E. coli värd. Vi följer plasmid frekvens över tid genom att tillämpa replika plätering av E. coli populationer samtidigt kvantifiera antibiotikaresistens uthållighet. Dessutom övervakar vi konformation av plasmider i värdceller genom att analysera omfattningen av plasmid multimer formation av plasmid Hack och agaros gel elektrofores. Ett sådant tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att visualisera inte bara genomet storleken på framväxande plasmider utan också deras topologiska konformation-en faktor mycket viktigt för plasmid arv. Vårt system kombinerar molekylära strategier med traditionella mikrobiologiska metoder och ger en uppsättning för att följa plasmider i bakterie populationer under lång tid. Den presenterade metoden kan användas för att studera ett brett spektrum av rörliga genetiska element i framtiden.

Här presenterar vi en metod för att studera plasmid evolution genom att kvantifiera plasmid uthållighet i en population. Först visar vi hur man bygger plasmid redovisade E. coli stam MG1655 PCON som därefter introduceras till en evolution experiment. För det andra presenterar vi en enkel metod för att följa plasmid överflöd i den framväxande bakterie populationer. Slutligen visar vi hur man visualiserar plasmid molekylstorlek och konformation.
I vårt tidigare arbete8 med hjälp av den presenterade metoden genomförde vi ett evolutions experiment efter persistens av antibiotikaresistens plasmider i E. coli i avsaknad av antibiotika (figur 4). Våra representativa resultat visar utvecklingen av populationer vid 37 ° c och en utspädnings frekvens på 10-4. Efter överflödet av plasmid-bärande celler, observerade vi en minskning av frekvensen plasmid-redovisade värdceller över tiden (figur 4). Vår metod gjorde det möjligt för oss att upptäcka att plasmid förlusten var ett resultat av den kondenserade plasmid arvsmassan arkitektur, vilket ledde till plasmid instabilitet orsakad av konflikter som infördes genom transkription av motståndet genen och replikering av plasmid själv. Visualisera plasmid molekyler möjligt för oss att upptäcka att dessa konflikter ledde till en instabil plasmid konformation (dvs., plasmid multimer formation, figur 5). Icke desto mindre observerade vi plasmid stabilitets utveckling utan exponering för antibiotika (figur 4). Den utvecklade stabiliteten förlänades av en Plasmid inneboende duplicering som avskaffade transkriptionen-replikering konflikter och ledde till bildandet av stabilt ärftliga plasmider. Våra resultat visar på så sätt vikten av rekombination och genomförstärkning i adaptiv evolution av genetiska element.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig1.jpg"> Figur 1: plasmid-design av pCON. Schematisk representation av den klonings strategi som används för att bygga plasmid pCON. Den plasmid ryggrad (pBBR1) och antibiotikaresistensgen (nptII) är PCR förstärks och smält genom isotermisk fusion20. Detta ger plasmid pCON och stammen MG1655 pCON. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig2.jpg"> Figur 2: design av det långsiktiga evolutions experimentet. Schematisk representation av det seriella överförings experimentet. De plasmid-redovisade (pCON) populationer är pläterade på selektiv media. Fäderneärvda kolonier väljs slumpmässigt ut från plattan och introduceras till ett seriellt överföringssystem. Överföringarna genomförs med tre olika utspädnings metoder för att simulera befolknings flaskhalsar i olika storlekar. Utspädningar upprepas seriellt. Experimentet utförs i två temperatur system. Den plasmid-värd frekvens mäts längs experimentet via replika plätering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig3.jpg"> Figur 3: replika plätering. Schematisk representation av de steg som används i replika bordläggningen av bakterie populationer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig4.jpg"> Figur 4: representativ pCON-frekvens över tid. pCON persistence visas som andelen värdar (representativa replikera populationer) under evolutions experimentet. För 98 överföringar utvecklades pCON plasmid populationer under icke-selektiva förhållanden med en utspädningsfaktor på 10-4. Alla replikat som transporterar plasmid pCON minskade i populationen. Efteråt var befolkningarna utsätts för antibiotika för övernattning inkubering och odlades igen under icke-selektiva villkor för att testa för plasmid stabilitets utveckling. Denna siffra har modifierats från Wein et al.8<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60749/60749fig5.jpg"> Figur 5: representativ analys av plasmid-Konformationen. Visualisering av modellen plasmid pCON. Visualiserad är den obehandlade plasmid-DNA direkt efter extraktion, linearized Plasmid DNA, och behandlas med DNase som bara klipper kromosomalt DNA samt enzymatiskt Hack DNA (dvs öppen cirkel plasmid DNA). Linearizing plasmid visar att alla plasmider är av samma storlek. Ta bort kromosomala DNA och Hack PCON avslöjar närvaron av dimerer och andra multimers. Denna siffra har modifierats från Wein et al.8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60749/60749fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach at JoVE.com

Quantification of Plasmid-Mediated Antibiotic Resistance in an Experimental Evolution Approach

Vår experimentella metod ger en strategi för att följa plasmid överflöd och antibiotikaresistens över tid i bakterie populationer.

Kvantifiering av plasmid-medierad antibiotikaresistens i en experimentell evolutions metod

Plasmids play a major role in microbial ecology and evolution as vehicles of lateral gene transfer and reservoirs of accessory gene functions in microbial ...

Plasmider är extrakromosomiska element som är allmänt förekommande i de flesta bakteriearter och livsmiljöer där de är mycket viktiga medel för lateral genöverföring eftersom de kan migrera mellan celler och mellan populationer. Ett av de mest slående och framträdande exemplen på sådan överföring är spridning av antibiotikaresistensgener som är kodade på plasmider. För att bygga en modell plasmid som kodar en antibiotikaresistens gen, välj en plasmid ryggrad och PCR förstärka ryggraden med hjälp av en high fidelity polymeras och primers som binder på plasmid mallen. I vårt fall använde vi en pBBR1 plasmid ryggrad. Därefter förstärka resistens genen nptII inklusive den infödda Tn5 promotorn med hjälp av en high fidelity polymeras. Utforma primers för resistens genen med cirka 20 baspar av sekvens komplementaritet till plasmid ryggraden. Efter PCRs, säkring homologi regionen av den renade resistens genen PCR produkt till den renat plasmid ryggraden med hjälp av isotermisk montering vid 50 grader i 60 minuter. Omvandla den smälta produkten till E.Coli DH5-Alpha med hjälp av elektroporation. Plate 100 mikroliter av blandningen på selektiva medier och inkubera vid 37 grader i ca 24 timmar. Plasmiden kan sedan extraheras, valideras och omvandlas till E.coli vild typ stam MG1655. Detta ger stam MG1655 pCON.Under antibiotikaexponering, bakterier behöver plasmid för att överleva. Således är plasmiden under positivt urval. Under icke-selektiva förhållanden, så utan antibiotika, är plasmiden disponibel till cellen. Syftet med vår studie var att följa plasmiderna under sådana icke-selektiva förhållanden över tiden. För detta ändamål utrustade vi de små plasmiderna med en antibiotikaresistensgen och introducerade den till Escherichia coli. Vi genomförde ett evolutionärt experiment och övervakade plasmider frekvens via replika plätering. Den plasmid redovisade stam mg1655 pCON är nu introducerad till en evolution experiment. Först, tallrik mg1655 pCON på LB agar plattor kompletteras med antibiotika och inkubera över natten vid 37 grader. Från denna platta väljer slumpmässigt de 8 förfaderkolonierna och inkubera över natten vid 37 grader med konstant skakning. Nästa dag överförs populationerna till experimentet som utförs i 96 djupa brunnsplattor. Det är mycket viktigt att slumpmässigt fördela replikaten över plattan. Till exempel i en checkerboard strategi. I vårt experiment späds kulturerna ut och överförs med olika utspädningshastigheter och i två temperaturer. Under varje överföring händelse utspädningsbehandlingen tillämpas och den seriella överföringen upprepas över totalt 98 överföringar. Längs evolutionsexperimentet uppskattas plasmidernas frekvens i populationen från andelen plasmidbärande celler. Replika plätering populariserades av Esther och Joshua Lederberg på 1950-talet där de använde den för att studera läkemedelsresistens i bakterier. Metoden kommer att göra det möjligt för dem att skala upp sin skanning för fenotyper och i slutet av studien visade att penicillin resistens kan uppstå hos bakterier på grund av spontana mutationer i arvsmassan. För att bestämma plasmidfrekvensen i populationen under experimentet späds stationära kulturer ut och pläterar de på icke-selektiva LB-agarplattor. Justera utspädningen enligt en avkastning på 250 till 500 kolonier per platta. De pläterade populationerna inkuberas för över natten tillväxt på 37 grader för mindre än 24 timmar. Kolonier replikeras bäst när de fortfarande är små. Efter över natten tillväxt räkna alla kolonier med hjälp av en automatiserad koloniräknare av läsarens val. Detta ger den sammanlagda bakteriebefolkningen storleksanpassar i kulturerna. Observera att kolonier vid kanten av plattan ska lämnas ut. För att replikera plattorna, du behöver selektiva agar plattor kompletteras med antibiotika, ett runt block, en metallring som passar blocket, och steril sammet trasa. Duken måste vara 100%bomull eftersom detta kan steriliseras genom autoklavering. Placera trasan på blocket och fixera den med metallringen.Placera försiktigt plattan med de räknade kolonierna på den fasta sammetsduksytan. Knacka på plattan i cirkelrörelser så att alla plattan yta vidrör duken. Det är mycket viktigt att alla kolonier rör vid sammeten. Ta bort LB-plattan och placera den selektiva plattan på sammet. Upprepa den noggranna knackningen. Det är återigen viktigt att plattan vidrör sammet helt. Efteråt, ta bort den selektiva plattan. Plattorna inkuberas i rumstemperatur över natten. Vid nästa dag behövs både LB och antibiotikaplattan för utvärdering. Placera plattorna en ovanför varandra och jämför tillväxten. Du kan enkelt upptäcka kolonifria utrymmen. Dessa är de kolonier som inte är resistenta mot antibiotika. Således förlorade dessa kolonier plasmiden. I slutändan, markera hur många kolonier saknas på antibiotikaplattan. Detta nummer ger dig den plasmid förlust. Upprepa replika plätering av alla populationer under evolutionsexperimentet varje vecka. Plasmid förlust kan orsakas av plasmid multi missbildning. När du arbetar på en plasmid konstruktion säga för uttryck av en viss gen i din föredragna värd stam den infödda beteendet hos en plasmid in vivo med avseende på bekräftelsen en stat kan ta är oftast något som förbises. Men i ett evolutionärt sammanhang kan en sådan bekräftelse av förändringar vara av mycket stor betydelse. Analysen av plasmid bekräftelser kan vara en mycket knepig strävan. Speciellt plasmid multimers är svåra att analysera eftersom de inte kan identifieras korrekt av PCR eller genom sekvensering. På andra sidan, plasmid multimers är svåra att analysera genom gel elektrofores på grund av deras potentiellt stora storlek och deras långsamma elektroforesrörlighet. Vårt protokoll erbjuder en enkel och okomplicerad metod för screening och identifiering av plasmid multimers i jag skulle säga en viss plasmid förberedelse. Till visuella plasmid molekyler extrahera plasmiden från 5 mL stationära natten cell kultur med hjälp av alkalisk lys. Plasmid utvinning av låg kopia plasmider leder ofta till kontaminering med värd kromosomal DNA som behöver smältas före visualisering. För att avlägsna kromosomal DNA-kontamination behandla den extraherade plasmidEND med Plasmid-Safe

Research

JoVE Journal

Genetics

Design and Use of a Low Cost, Automated Morbidostat for Adaptive Evolution of Bacteria Under Antibiotic Drug Selection

Utformning och användning av en låg kostnad, Automated Morbidostat för Adaptive Evolution av bakterier under antibiotikum Drug Val

We describe a low cost, configurable morbidostat for characterizing the evolutionary pathway of antibiotic resistance. The morbidostat is a bacterial ...

Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat

Förfarande för adaptiv Laboratory Evolution av mikroorganismer med hjälp av en kemostat

Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) ...

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL Mapping and CRISPR/Cas9 Editing to Identify a Drug Resistance Gene in Toxoplasma gondii

QTL-kartläggning och CRISPR / Cas9 redigering för att identifiera en läkemedelsresistensgen i<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Scientific knowledge is intrinsically linked to available technologies and methods. This article will present two methods that allowed for the ...

Atomic Force Microscopy Investigations of DNA Lesion Recognition in Nucleotide Excision Repair

Atomic Force Microscopy Undersökningar av DNA-lesionsigenkänning i Nucleotide Excision Repair

AFM imaging is a powerful technique for the study of protein-DNA interactions. This single molecule method allows the simultaneous resolution of different ...

Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance

Testning Multicopy plasmider roll i utvecklingen av antibiotikaresistens

Multicopy plasmids are extremely abundant in prokaryotes but their role in bacterial evolution remains poorly understood. We recently showed that the ...

Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms

Genome-wide övervakning av transkription fel i eukaryota organismer

Accurate transcription is required for the faithful expression of genetic information. Surprisingly though, little is known about the mechanisms that ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producerar genen borttagningar i Escherichia coli av P1 transduktion med punktskattepliktiga antibiotikaresistens kassetter

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Screening Cotton Genotypes for Reniform Nematode Resistance

Screening av bomull genotyper för reniform Nematodresistens

A rapid non-destructive reniform nematode (Rotylenchulus reniformis) screening protocol is needed for the development of resistant cotton (Gossypium ...

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands

Ett FACS-baserat protokoll för att isolera RNA från de sekundära cellerna i Drosophila manliga tillbehörs körtlar

To understand the function of an organ, it is often useful to understand the role of its constituent cell populations. Unfortunately, the rarity of ...