Name: time-lapse imaging of mouse macrophage chemotaxis
Uploaded: 2020-04-02T12:30:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل بمنحة (HA 3271/3-2) من DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).

تتبع البروتوكولات المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحث المحلية لدينا، وكذلك المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات.
ملاحظة: يوضح الشكل 1 سير عمل من القول chemotaxis.
1. قبل ملء الشرائح Chemotaxis
<ol><li>
Prefill 1 مم واسعة و 2 مم قنوات ربط طويلة من واحد أو اثنين من الشرائح chemotaxis باستخدام معدلة RPMI 1640 HEPES المتوسطة، وتتكون من بيكربونات خالية RPMI 1640 المتوسطة التي تحتوي على 20 mM 4-(2-hydroxyethyl حمض)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES)، 10٪ من المصل البقري الجنيني المعطلة بالحرارة (FBS)، والمضادات الحيوية مثل البنسلين (100 U/mL) والعقديات (100 ميكروغرام/مل)، التي أعدت عن طريق تخفيف 100x البنسلين/العقديات، و 1 ميكروغرام / مل lipopolysaccharide (من E. القولونية)، ومستقبلات مثل حصيلة 4 ليغاند المستخدمة لتنشيط الخلايا.
	<ol>
<li>وضع شريحة chemotaxis(الشكل 2A)في جولة (10 سم قطرها) طبق ثقافة الخلية، وكلاهما محمّى مسبقا إلى 37 درجة مئوية، وتعيين الطبق على كتلة الألومنيوم ساخنة (37 درجة مئوية). إدراج المقابس في المنافذ 1 و 4(الشكل 2B). ملاحظة: كتلة الألومنيوم الحفاظ على 37 درجة مئوية ووضعها داخل غطاء تدفق لاميمفيدة مفيد لإعداد غرف chemotaxis. من الناحية المثالية ، يجب أن توفر الكتلة الساخنة منطقة عمل مسطحة وآبارًا لمختلف الأنابيب ، مثل أنابيب 50 مل وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل.</li>
		<li>باستخدام تلميح ماصة 10-200 ميكرولتر مع طرف مبسد ، قم بإيداع 15 ميكرولتر من RPMI المعدلة 1640 HEPES المتوسطة في منفذ التعبئة 3(الشكل 2B). بعد ذلك ، مع حجم لا يزال تعيين في 15 μL وزر التحكم من (2-20 μL حجم) ماصة الاكتئاب ، وإدراج تلميح ماصة في الميناء 2 ونسخ 15 μL بمعدل سريع معتدل(الشكل 2B). وهذا من شأنها أن تملأ مسبقا قناة الربط 1 مم × 2 ملم (منطقة المراقبة)، فضلا عن قناتي الإمداد المحيطتين (بين منطقة المراقبة المركزية والموانئ 2 و 3، على التوالي). تغطية ملء الموانئ 2 و 3 مع قبعات.</li>
		<li>بعد التعبئة المسبقة، ضع شرائح chemotaxis على رف محفوظ في غرفة رطوبة مغلقة داخل حاضنة جافة وخالية من CO2عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: من المهم استخدام تلميح ماصة الصحيح لملء الشريحة chemotaxis. وشرائح الماصة المنحرفة في الجزء العلوي من ميناء التعبئة، في حين يمكن إدراج نصائح ماصة مدببة شائعة الاستخدام بشكل أعمق في ميناء التعبئة وقد تزيد بشكل كبير من مقاومة تدفق السوائل.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. عزل الماوس المقيم الضامة peritoneal
<ol><li>التضحية بفأر عمره 3-4 أشهر باستخدام تركيز عال ٍ من الإيزوفوران مخدر متقلب (أكثر من 5٪ في الهواء) أو ثاني أكسيد الكربون25، يليه خلع عنق الرحم. فقدان رد الفعل الحق في القوارض يرتبط مع فقدان الوعي في البشر26. تنظيف بطن الماوس مع الإيثانول 80٪ في الماء ومن ثم جعل شق الجلد خط الوسط 1-2 سم باستخدام مقص الجراحية مع نصائح حادة. قشر مرة أخرى الجلد لفضح جدار البطن الكامنة.</li>
	<li>أدخل قسطرة بلاستيكية 24 غ في التجويف الجبهي. باستخدام حقنة بلاستيكية 5 مل، وإزالة التجويف باستخدام 2 × 4.5 مل الجليد الباردة هانك محلول الملح المخزنة مؤقتا (HBSS)، دون Ca2 + وMg2 +. اترك حوالي 0.5 مل من HBSS المتبقية في الحقنة بحيث يمكن طرد الأنسجة التي تم امتصاصها عن غير قصد على طرف القسطرة.</li>
	<li>نقل المتوسطة اللافج, عادة 8-8.5 مل في المجموع, إلى 14 مل أنبوب القاع جولة البولي بروبلين. طرد مركزي الأنبوب في 300 × ز لمدة 6.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: الأنبوب السفلي الجولة يسمح supernatant أن يكون decanted تماما ويقلل من تكتل الخلية.</li>
	<li>تجاهل supernatant وإعادة تعليق الخلايا الجبقية (عادة ~ 4 × 106 خلايا لكل فأر) في 200 ميكرولتر من متوسط RPMI 1640 HEPES المعدلة. تمييع عينة من تعليق الخلية 1:20 واستخدام جهاز العد، مثل غرفة العد نيوباور محسنة، لحساب الخلايا. بعد ذلك، تمييع تعليق الخلية إلى تركيز نهائي من 10 × 106 خلايا /مل والحفاظ على الخلايا في أنبوب الطرد المركزي الدقيق البولي بروبلين السفلي 2 مل عند 37 درجة مئوية باستخدام كتلة من الألومنيوم ساخنة (انظر ملاحظة في الخطوة 1.1.1).</li>
</ol>3. البذر الخلايا الجبرية في الشرائح Chemotaxis
<ol><li>بعد الأنابيب تعليق الخلية صعودا وهبوطا 5x مع حجم ماصة تعيين في 100 μL (أو في نصف حجم التعليق) للحد من تكتل، إيداع بلطف 10 μL من تعليق الخلية في الميناء 3 من غرفة chemotaxis(الشكل 2C). ضع طرف ماصة في المنفذ 2 وارسم تعليق الخلية ببطء في قناة الاتصال(الشكل 2C). بمجرد إدخال تعليق الخلية، قم بإزالة المقابس في الميناءين 1 و4، مما سيساعد على إيقاف تدفق تعليق الخلية. ضع قبعات على جميع منافذ التعبئة الأربعة.</li>
	<li>كرر الخطوة 3.1 لجميع غرف chemotaxis. باستخدام مجهر مقلوب صغير وعدسة موضوعية 10x على النقيض من المرحلة ، افحص شرائح chemotaxis بحثًا عن فقاعات الهواء غير المرغوب فيها.</li>
	<li>ضع شرائح chemotaxis المصنفة بالخلايا الجبقية في غرفة الرطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة.</li>
</ol>4. ملء الخزانات وإضافة Chemoattractant
<ol><li>فحص منطقة المراقبة (قناة تربط خزاني 40 ميكرولتر) باستخدام مجهر مقلوب. ملاحظة: في هذه المرحلة ، ستكون كثافة الخلية أعلى من بعد ملء الخزانات ، لأن الخلايا ضعيفة الأتباع ، وغالبًا CD19+ الخلايا (خلايا B1) ، سيتم غسلها من منطقة المراقبة أثناء إجراء التعبئة(الشكل 2C-E).</li>
	<li>ضع المقابس في منافذ التعبئة 1 و 2(الشكل 2D). تأكد من أن يتم تعبئة ميناء 3 إلى الأعلى مع فقاعات الهواء المتوسطة والخالية. استخدام إبرة حقنة 27 G المعقمة لطرد فقاعات الهواء غير المرغوب فيها، إذا لزم الأمر.</li>
	<li>باستخدام ماصة ميكانيكية بحجم 10-100 ميكرولتر، نستنشق ~ 60 ميكرولتر من متوسط RPMI 1640 HEPES المعدل ووضع طرف الماصة في ميناء التعبئة 3. استخدام حلقة إعداد حجم ماصة لحقن ببطء وثبات المتوسطة في الخزان بحيث تصل المتوسطة إلى الجزء العلوي من ميناء ملء 4 بعد 1-2 دقيقة(الشكل 2D).</li>
	<li>ملء الخزان الثاني. نقل المكونات من المنفذ 1 وإدراجه ببطء في المنفذ 3(الشكل 2D). بعد ذلك ، استنشق ~ 50 ميكرولتر من متوسط RPMI 1640 HEPES المعدل ة ووضع طرف الماصة في منفذ التعبئة 4. استخدم حلقة إعداد الحجم لطيّة الحجم 10-100 ميكرولتر لحقن متوسطة ببطء وثبات في الخزان الثاني بحيث يصل المتوسط إلى أعلى منفذ التعبئة 1 بعد 1-2 دقيقة(الشكل 2D).</li>
	<li>ضع 495 ميكرولتر من RPMI المعدل 1640 HEPES المتوسطة في (أسفل مستدير) 2 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق وإضافة 5 ميكرولتر من براءات الاختراع الأزرق الخامس (محلول الأسهم: 10 ملغ / مل في محلول المحلول المؤقت الفوسفات [PBS]) ، صبغة زرقاء تستخدم كمؤشر مرئي لتشكيل تدرج التركيز. تخلط عن طريق الدوامة وجيزة. إضافة 5.4 μL من الماوس المؤتلف تكمل C5a (محلول الأسهم: 50 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ الزل في مصل البقري) وتخلط عن طريق دوامة قصيرة.</li>
	<li>إيداع 15 ميكرولتر من اللون الأزرق، واستكمال C5a التي تحتوي على المتوسطة في ميناء ملء 1(الشكل 3A)،بعد التأكد من أن الاكتئاب الضحلة في الجزء العلوي من الميناء هو متوسط الحرة (وإلا فإن الانخفاض قد لا امتداد).</li>
	<li>إدراج تلميح ماصة 10-200 ميكرولتر في ميناء ملء 4 وتدوير ببطء وثبات حلقة إعداد حجم ماصة حجم 10-100 μL لرسم قطرة من الأزرق، واستكمال C5a التي تحتوي على المتوسطة في الخزان المعاكس(الشكل 3B). سيبدأ الهواء في إدخال العمود الرأسي القصير لميناء التعبئة 1. ارسم الهواء حتى تكون واجهة السائل والهواء في منتصف العمود الرأسي، ثم أدخل قابسًا ببطء في المنفذ.</li>
	<li>ارفع الماصة بلطف من المنفذ 4، باستخدام اليد الأخرى لضمان بقاء الشريحة ثابتة في مكانها. وأخيرا، المكونات ببطء منفذ 4(الشكل 3B).</li>
	<li>تفقد الشريحة chemotaxis على المجهر مقلوب. ملاحظة: وينبغي أن تكون الخلايا المتبقية في منطقة المراقبة في الغالب من الضامة. ويمكن تأكيد ذلك باستخدام الأجسام المضادة المضادة الموسومة بشكل فلوري المضادة F4/80 (F4/80 هو علامة محددة للالضامة الماوس). يمكن التعرف على الخلايا B باستخدام الأجسام المضادة المضادة لCD19 الموسومة بفلورية وF4/80-/ CD19- يمكن اكتشاف الخلايا باستخدام بقعة حمض الحمض النووي الفلوري الأزرق(الشكل 4).</li>
</ol>5. التصوير هجرة الضامة عن طريق الفاصل الزمني، مرحلة على النقيض من المجهر
<ol><li>ضع شريحة chemotaxis على خشبة مسرح المجهر المقلوب المزود بحاضنة خشبة المسرح. الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.</li>
	<li>صورة منطقة المراقبة 1 مم × 2 مم باستخدام عدسة موضوعية 10x تباين المرحلة والتركيز على lamellipodia الضامة: رقيقة، ورقة مثل نتوءات الغشاء. التقط صورًا لمدة 14 ساعة بمعدل إطار واحد كل دقيقتين.</li>
</ol>6. تحليل الصور الفاصلالزمني
<ol><li>تحليل الوقت الفاصل ، صور التباين المرحلة باستخدام الآلي تحليل الصور البرمجيات أو دليل تتبع البرنامج المساعد ، التي تنتجها فابريس P. Cordelières ، لImageJ. ملاحظة: يمكن استخدام برامج التتبع التلقائية لتحليل الخلايا التي يتم تصويرها إما عن طريق الفاصل الزمني أو تباين الطور أو المجهر الفلوري. على سبيل المثال، يمكن استخدام برنامج iTrack4U المستند إلى جافا الذي تنتجه Cordelières et al.27 لتتبع الخلايا الآلية وتحليلها باستخدام صور الفاصل الزمني أو تباين الطور أو الفلورسينس كمدخلات. تتبع يدوي هو أكثر مضيعة للوقت، ولكن المسارات التي تم إنشاؤها بواسطة ImageJ البرنامج المساعد دليل تتبع يمكن استيرادها مباشرة وتحليلها تلقائيا من قبل ImageJ المساعد Chemotaxis وأداة الهجرة28،29.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lammermann, T., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+faces+of+leukocyte+interstitial+migration.">The multiple faces of leukocyte interstitial migration.</a> Seminars in Immunopathology. 36, 227-251 (2014).</li><li>Lammermann, T., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+modes+of+'amoeboid'+cell+migration.">Mechanical modes of 'amoeboid' cell migration.</a> Current Opinion in Cell Biology. 21, 636-644 (2009).</li><li>Woodham, E. F., Machesky, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarised+cell+migration:+intrinsic+and+extrinsic+drivers.">Polarised cell migration: intrinsic and extrinsic drivers.</a> Current Opinion in Cell Biology. 30, 25-32 (2014).</li><li>Devreotes, P. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitable+Signal+Transduction+Networks+in+Directed+Cell+Migration.">Excitable Signal Transduction Networks in Directed Cell Migration.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 103-125 (2017).</li><li>Kamp, M. E., Liu, Y., Kortholt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Function+and+Regulation+of+Heterotrimeric+G+Proteins+during+Chemotaxis.">Function and Regulation of Heterotrimeric G Proteins during Chemotaxis.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 90 (2016).</li><li>Miao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wave+patterns+organize+cellular+protrusions+and+control+cortical+dynamics.">Wave patterns organize cellular protrusions and control cortical dynamics.</a> Molecular Systems Biology. 15, 8585 (2019).</li><li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+integrating+signals+from+front+to+back.">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302, 1704-1709 (2003).</li><li>Lammermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453, 51-55 (2008).</li><li>Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Arp2/3+complex+with+actin:+nucleation,+high+affinity+pointed+end+capping,+and+formation+of+branching+networks+of+filaments.">The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6181-6186 (1998).</li><li>Leithner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversified+actin+protrusions+promote+environmental+exploration+but+are+dispensable+for+locomotion+of+leukocytes.">Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes.</a> Nature Cell Biology. 18, 1253-1259 (2016).</li><li>McDonald, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+danger+signals+guide+neutrophils+to+sites+of+sterile+inflammation.">Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation.</a> Science. 330, 362-366 (2010).</li><li>Leber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ueber+die+Entstehung+der+Entz&#252;ndung+und+die+Wirkung+der+entz&#252;ndungserregenden+Sch&#228;dlichkeiten.">Ueber die Entstehung der Entz&#252;ndung und die Wirkung der entz&#252;ndungserregenden Sch&#228;dlichkeiten.</a> Fortschritte der Medizin. 6, 460-464 (1888).</li><li>Tauber, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metchnikoff+and+the+phagocytosis+theory.">Metchnikoff and the phagocytosis theory.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4, 897-901 (2003).</li><li>Clark, E. R., Linton Clark, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+cells+in+the+tail+of+amphibian+larvae+to+injected+croton+oil+(aseptic+inflammation).">Reactions of cells in the tail of amphibian larvae to injected croton oil (aseptic inflammation).</a> American Journal of Anatomy. 27, 221-254 (1920).</li><li>Clark, E. R., Linton Clark, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reaction+of+living+cells+in+the+tadpole's+tail+toward+starch,+agar-agar,+gelatin,+and+gum+arabic.">The reaction of living cells in the tadpole's tail toward starch, agar-agar, gelatin, and gum arabic.</a> The Anatomical Record. 24, (1922).</li><li>Comandon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytose+in+vitro+des+H&#233;matozoaires+du+Calfat+(enregistrement+cin&#233;matographique).">Phagocytose in vitro des H&#233;matozoaires du Calfat (enregistrement cin&#233;matographique).</a> Comptes Rendus Hebdomadaires des S&#233;ances et M&#233;moires de la Soci&#233;t&#233; de Biologie. 69, 314-316 (1917).</li><li>McCutcheon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+leukocytes.">Chemotaxis in leukocytes.</a> Physiological Reviews. 26, 319-336 (1946).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).</li><li>Horwitz, D. A., Garrett, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+leukocyte+chemotaxis+in+vitro+to+assay+mediators+generated+by+immune+reactions.+I.+Quantitation+of+mononuclear+and+polymorphonuclear+leukocyte+chemotaxis+with+polycarbonate+(nuclepore)+filters.">Use of leukocyte chemotaxis in vitro to assay mediators generated by immune reactions. I. Quantitation of mononuclear and polymorphonuclear leukocyte chemotaxis with polycarbonate (nuclepore) filters.</a> Journal of Immunology. 106, 649-655 (1971).</li><li>Bignold, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+polycarbonate+(Nuclepore)+membrane+demonstrates+chemotaxis,+unaffected+by+chemokinesis,+of+polymorphonuclear+leukocytes+in+the+Boyden+chamber.">A novel polycarbonate (Nuclepore) membrane demonstrates chemotaxis, unaffected by chemokinesis, of polymorphonuclear leukocytes in the Boyden chamber.</a> Journal of Immunological Methods. 105, 275-280 (1987).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> Journal of Cell Science. 99, 769-775 (1991).</li><li>Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+chamber+for+direct+visualisation+of+chemotaxis.">An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis.</a> PLoS One. 5, 15309 (2010).</li><li>Zengel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mu-Slide+Chemotaxis:+a+new+chamber+for+long-term+chemotaxis+studies.">mu-Slide Chemotaxis: a new chamber for long-term chemotaxis studies.</a> BMC Cell Biology. 12, 21 (2011).</li><li>Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Euthanasia+using+gaseous+agents+in+laboratory+rodents.">Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents.</a> Lab Animal. 50, 241-253 (2016).</li><li>Franks, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+anaesthesia:+from+molecular+targets+to+neuronal+pathways+of+sleep+and+arousal.">General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 9, 370-386 (2008).</li><li>Cordelieres, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+cell+tracking+and+analysis+in+phase-contrast+videos+(iTrack4U):+development+of+Java+software+based+on+combined+mean-shift+processes.">Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes.</a> PLoS One. 8, 81266 (2013).</li><li>Zantl, R., Horn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+of+slow+migrating+mammalian+cells+analysed+by+video+microscopy.">Chemotaxis of slow migrating mammalian cells analysed by video microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 769, 191-203 (2011).</li><li>Biswenger, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+EGF-guided+MDA-MB-231+cell+chemotaxis+in+vitro+using+a+physiological+and+highly+sensitive+assay+system.">Characterization of EGF-guided MDA-MB-231 cell chemotaxis in vitro using a physiological and highly sensitive assay system.</a> PLoS One. 13, 0203040 (2018).</li><li>Austyn, J. M., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F4/80,+a+monoclonal+antibody+directed+specifically+against+the+mouse+macrophage.">F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage.</a> European Journal of Immunology. 11, 805-815 (1981).</li><li>Hanley, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motorized+RhoGAP+myosin+IXb+(Myo9b)+controls+cell+shape+and+motility.">Motorized RhoGAP myosin IXb (Myo9b) controls cell shape and motility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12145-12150 (2010).</li><li>Wilkinson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Locomotion+and+Chemotaxis:+Basic+Concepts+and+Methodological+Approaches.">Cell Locomotion and Chemotaxis: Basic Concepts and Methodological Approaches.</a> Methods. 10, 74-81 (1996).</li><li>Pfeffer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotorische+Richtungsbewegungen+durch+chemische+Reize.">Locomotorische Richtungsbewegungen durch chemische Reize.</a> Untersuchungen aus dem Botanischen Institut zu Tu&#776;bingen. 1, 363 (1884).</li><li>Konigs, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+macrophages+completely+lacking+Rho+subfamily+GTPases+(RhoA,+RhoB,+and+RhoC)+have+severe+lamellipodial+retraction+defects,+but+robust+chemotactic+navigation+and+altered+motility.">Mouse macrophages completely lacking Rho subfamily GTPases (RhoA, RhoB, and RhoC) have severe lamellipodial retraction defects, but robust chemotactic navigation and altered motility.</a> The Journal of Biological Chemistry. 289, 30772-30784 (2014).</li><li>Horsthemke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+roles+of+filopodial+dynamics+in+particle+capture+and+phagocytosis+and+phenotypes+of+Cdc42+and+Myo10+deletion.">Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292, 7258-7273 (2017).</li><li>Bachg, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenotypic+analysis+of+Myo10+knockout+(Myo10(tm2/tm2))+mice+lacking+full-length+(motorized)+but+not+brain-specific+headless+myosin+X.">Phenotypic analysis of Myo10 knockout (Myo10(tm2/tm2)) mice lacking full-length (motorized) but not brain-specific headless myosin X.</a> Scientific Reports. 9, 597 (2019).</li><li>Horsthemke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+isoform+of+myosin+18A+(Myo18Agamma)+is+an+essential+sarcomeric+protein+in+mouse+heart.">A novel isoform of myosin 18A (Myo18Agamma) is an essential sarcomeric protein in mouse heart.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294, 7202-7218 (2019).</li><li>Bzymek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+two-+and+three-dimensional+imaging+of+monocyte+motility+and+navigation+on+planar+surfaces+and+in+collagen+matrices:+roles+of+Rho.">Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: roles of Rho.</a> Scientific Reports. 6, 25016 (2016).</li><li>Wang, G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+production+of+macrophages+or+neutrophils+ex+vivo+using+conditional+Hoxb8.">Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8.</a> Nature Methods. 3, 287-293 (2006).</li><li>Gran, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging,+myeloid+precursor+immortalization,+and+genome+editing+for+defining+mechanisms+of+leukocyte+recruitment+in+vivo.">Imaging, myeloid precursor immortalization, and genome editing for defining mechanisms of leukocyte recruitment in vivo.</a> Theranostics. 8, 2407-2423 (2018).</li><li>Magidson, V., Khodjakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circumventing+photodamage+in+live-cell+microscopy.">Circumventing photodamage in live-cell microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Isfort, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+reveals+that+P2Y2+and+P2Y12+receptor+agonists+are+not+chemoattractants+and+macrophage+chemotaxis+to+complement+C5a+is+phosphatidylinositol+3-kinase+(PI3K)-+and+p38+mitogen-activated+protein+kinase+(MAPK)-independent.">Real-time imaging reveals that P2Y2 and P2Y12 receptor agonists are not chemoattractants and macrophage chemotaxis to complement C5a is phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)- and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)-independent.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286, 44776-44787 (2011).</li></ol>

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

يعود التصوير اللاحيسي إلى القرن التاسع عشر ويوفر وسيلة لدراسة سلوك الخلايا المناعية الحية في بيئتها الطبيعية. ومع ذلك ، حتى مع المجهر المتقدم ة والتقنيات الوراثية اليوم ، من الصعب دراسة استجابة الخلايا لمعالجات كيميائية محددة في الجسم الحي. للتحايل على هذه المشكلة، طوّر بويدن18 مقالات ترانسويل في الستينات، لكن هذه المقالات النهائية لم تقدم تصوراً لكيفية هجرة الخلايا فعلاً نحو المنجذبات الكيميائية، مما يجعل من الصعب التمييز بين العلاج الكيميائي، وحفز الهجرة العشوائية بإشارة كيميائية32،وchemotaxis، والهجرة نحو تركيزات أعلى من المحفزات الكيميائية من بعضها البعض33. تم حل هذه المشكلة عن طريق تصميم غرف مفتوحة مختلفة مع جسر، وعادة 1 مم واسعة، وتقع بين خزانين ويمكن الوصول إليها من خلال عدسة موضوعية21،22،23. تطبيق زلة غطاء مقلوب، مبذرة بخلايا ملتصقة، تغلق الغرف وجاذب كيميائي تضاف إلى أحد الخزانات المنتشرة عبر الجسر إلى الخزان المقابل، مما يخلق تدرج تركيز. هنا نصف الضريبة chemotaxis باستخدام نفس المبدأ ولكن باستخدام غرفة مغلقة تضم أربعة ملء الموانئ. باستخدام هذا النظام والوقت الفاصل، مرحلة التباين المجهري، وضعنا فحص لصورة الماوس القماق الجيومالمقيم المهاجرة في التدرج C5a الكيميائية31،34،35,. هذا القول، جنبا إلى جنب مع نماذج الماوس بالضربة القاضية، أثبتت مفيدة في التحقيق في أدوار مختلف رو GTPases والبروتينات الحركية في مورفولوجيا الضامة، والحركة، وchemotaxis31،34،35،36،37.37 لقد استخدمنا أيضا هذا النهج لتصوير الإنسان أحاديالدم المحيطي المهاجرة على سطح 2D أو في نوع الكولاجين 3D أنا مصفوفة38. وعلاوة على ذلك، والقول هو مناسبة للفواج العظام نخاع العظام المستمدة من الضامة أو الضامة المستمدة من الخلايا السلائف النخاعي الخلدةمشروط39،40. لقد استخدمنا سابقا أكياس البولي تترافلوروإيثيلين (PTFE) مع محولات لور لثقافة خلايا نخاع العظام والحصول على الضامة34. ميزة أكياس PTFE هو أن الخلايا يمكن إعادة تعليقها بسهولة وجاهزة للاستخدام بعد وضع الحقيبة على الجليد لمدة 20-30 دقيقة. لاحظ أننا ملء مسبقا في منطقة مراقبة الشرائح chemotaxis قبل إدخال الخلايا. هذا النهج لديه ميزة أن فقاعات الهواء غير المرغوب فيها يمكن مسح هاون (مع نجاح متغير) ومنطقة المراقبة presoaked تمكن من إدخال بطيء من تعليق الخلية عن طريق الأنابيب. ومع ذلك، فإن التعبئة المسبقة تزيد من احتمال تدفق الوسط جزئيًا إلى أحد الخزانات المحيطة أو كليهما، مما سيعزز بذر الخلايا خارج منطقة المراقبة. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون تعليق الخلية الأنابيب مباشرة في منطقة مراقبة جافة، ولكن لا يمكن طرد فقاعات الهواء غير المرغوب فيها في وقت لاحق.
يحتوي التجويف الجبريلل للفأرة على مجموعتين رئيسيتين من الخلايا: F4/80+ الضامة و(أصغر) خلايا CD19+ B ، بنسبة حوالي 1:2(الشكل 4A). هذه الخلايا اثنين من السكان تمثل أكثر من 95٪ من خلايا تجويف الجهوية، في حين أن F4/80المتبقية -/ CD19- يمكن عادة تحديد الخلايا على أنها CD11c+ خلايا (خلايا التدنو) أو CD3+ الخلايا (الخلايا التائية). يتم غسل الخلايا B ضعيفة الأتباع من منطقة المراقبة أثناء ملء الخزانات بالوسط(الشكل 2). بعد إضافة العلاج الكيميائي إلى أحد الخزانين ، يمكن استخدام المجهر المؤقت ، والتباين في الطور لتصوير الخلايا المتبقية (الضامة) المهاجرة في تدرج كيميائي متحرك متطور. يمكن محاكاة تشكيل تدرج C5a المكمل في منطقة المراقبة ، عن طريق الانتشار من خزان إلى آخر ، باستخدام صبغة فلورية ذات وزن جزيئي مماثل. بديل جيد ليكمل الماوس المؤتلف C5a (الوزن الجزيئي المتوقع ، 9.0 kDa) هو المسمى الفلورسنت dextran (10 كيلو)31. باستخدام المجهر المحوري، يمكن قياس تدرج الفلورسينس في القناة الضيقة (منطقة المراقبة) التي تربط خزانين من شريحة chemotaxis على فترات ثابتة ويمكن رسم ملامح التركيز في النقاط الزمنية المختلفة24،31. نضيف بشكل روتيني صبغة زرقاء غير فلورية (براءة اختراع زرقاء V) إلى الوسط الكيميائي الجذاب لتوفير مؤشر مرئي مناسب للانتشار وتشكيل التدرج. في غضون 1 ح من إدخال 15 ميكرولتر من اللون الأزرق، الذي يحتوي على وسيط كيميائي في خزان، يبدو الخزان أزرق بشكل موحد، ووفقا لقوانين الانتشار فيفيك، سوف يتشكل تدرج عبر منطقة المراقبة الضيقة التي تربط الخزانات(الشكل 3B). مطلوب عدة أيام للمذاب (صبغة زرقاء أو chemoattractant) لتصبح موزعة بشكل موحد.
يمكن استبدال المجهر الفلوري بالمجهر على النقيض من الطور ، والذي يوفر مزايا لتتبع الخلايا الآلي ، لأنه يمكن تمييز الخلايا المسماة بشكل فلوري بسهولة عن الخلفية. ميزة أخرى هي أن مجموعات محددة من الخلايا المناعية يمكن تتبعها بشكل انتقائي بعد وضع علامات سطحية مع الأجسام المضادة الفلورية. استخدمنا هذا النهج لتصوير الدم المحيطي البشري CD14+ الخلايا (monocytes) المهاجرة في fMLP تكتيكي (N-formylmethionine-leucyl-phenylalanine) التدرج38. وبالمثل، يمكن استخدام الأجسام المضادة الفلورية المضادة F4/80 لتصوير الضامة الماوس المهاجرة في التدرج C5a المكمل للتكتيك الكيميائي. السمية الضوئية هو عيب محتمل من استخدام التصوير الفلوري41. ويمكن تخفيض هذا بوسائل مختلفة42، بما في ذلك استخدام الفلوروفوريس متحمس مع أطوال موجية أطول وإضافة مضادات الأكسدة إلى الوسط. وبدلاً من ذلك، يمكن في البداية تحديد الخلايا المسماة عن طريق المجهر الفلوري ثم تصويرها عن طريق المجهر الفاصل الزمني والتباين على الطور. ومع ذلك ، في الممارسة العملية ، يمكن تصوير الخلايا التي تتحرك بسرعات منخفضة بشكل معتدل ، مثل ~ 1 ميكرومتر / دقيقة (الضامة) أو ~ 4 ميكرومتر / دقيقة (أحادية الخلايا) ، بشكل متقطع عن طريق المجهر الفلوري على فترات من الدقائق ، وهو جيد التحمل38. استخدمنا سابقا المجهر الفلوري والشريحة chemotaxis وصفها هنا ل3D chemotaxis المقالات38،43. في هذه الحالة، تم تعبئة كلا الخزانين مسبقًا بمتوسطة و15 ميكرولتر ًا تم سحب هاوية المنجذبة بالكيماويات إلى أحد الخزانات مباشرة قبل أن تُبوّل ببطء الخلايا المسماة بالفلورسنت المعلقة في وسط يحتوي على نوع الكولاجين الأول في منطقة المراقبة. الجزء الصعب من هذا الإجراء هو التعامل مع الكولاجين من النوع الأول ، والذي يتركز في محلول حمضي. يجب تحييد درجة الحموضة في محلول الكولاجين عن طريق إضافة محلول قلوي قبل خلط محلول الكولاجين البارد مع تعليق الخلية. نقل خليط الكولاجين الخلية إلى حاضنة في 37 درجة مئوية سوف تبدأ البلمرة الكولاجين. أثناء الحضانة ، يجب تدوير الشريحة ببطء حول محورها الطويل بحيث تظل الخلايا موزعة بالتساوي في اتجاهات المحور X و Y و Z بينما يبلمرة الكولاجين في هلام. وقد وصفت مؤخرا شريحة chemotaxis مغلقة ذات الصلة مناسبة لassass chemotaxis 3D، مع ستة المقابس بدلا من أربعة المقابس،29. يسمح هذا النظام بإدخال خليط الكولاجين والخلية إلى منطقة المراقبة قبل ملء كل خزان من الخزانات المحيطة بشكل مستقل ، لأن كل خزان يحتوي على مينتي تعبئة ، بدلاً من ميناء واحد.
باختصار، نحن نصف في الوقت الحقيقي العلاج الكيميائي التازي الذي يسمح تصور الخلايا التنقل في التدرج الكيميائي على مدى فترة 6 ساعات أو أكثر. هنا نركز على الضامة، والتي تلعب أدوارا رئيسية في الأمراض الالتهابية ولكن تم تمثيلها في الوقت الحقيقي العلاج الكيميائي assays بالمقارنة مع أسرع الخلايا المتحركة مثل العدلات وDictyostelium أميباي.

الخلايا المناعية عادة ما تهاجر بشكل مُنسَب على سطح 2D بطريقة الأميبويد1,2, الذي ينطوي على دورات متكررة من نتوء الجبهة, الالتصاق الخلايا بوساطة integrin, وتراجع من الخلف. خطوة شرط أساسي هو الاستقطاب الخلية، التي تشكل الخلايا الأمامية والخلفية ينتهي3. Chemotaxis يبدأ مع الكشف عن chemoattractants من قبل مستقبلات G البروتين المقترنة بالبروتين وشبكة الإشارات المعقدة بوساطة الغشاء الراسية بروتينات G غير الستيروتيرية والبروتينات الصغيرة G أحادية، فضلا عن عوامل تبادل النيوكليوتيدات الفوسفوليبيد (GEFs)4,5. تفعيل RHO GTPases من CDC42 وراك الأسر الفرعية تحفز نتوءات في الجبهة6 وأعضاء الأسرة الفرعية Rho, خصوصا RhoA, تنشيط انكماش الخلفية5,7. في بيئة ثلاثية الأبعاد (3D) ، integrins زائدة إلى حد كبير عن هجرة الكريات البيض وRhoA يصبح أكثر أهمية لعصر الخلايا من خلال الممرات الضيقة8، في حين CDC42 - أو Rac الناجمة عن نشاط Arp2 /3 لا يزال مهمًا لتوجيه chemotactic9،10.
قد تواجه الخلايا المناعية مواد جذب كيميائي مختلفة، خاصة في إعدادات إصابة الأنسجة، وغزو مسببات الأمراض، والالتهاب. يتم إنشاء المنجذبات الكيميائية الذاتية التي يتم التعبير عنها على البلعوم C3a و C5a ، بسرعة عن طريق تنشيط السلسلة التعاقبية المكملة ، ويتم التعرف عليها من خلال مستقبلات C3a و C5a المكملة. وبالمثل، الخلايا النخرية تجنيد البلعوم عبر مستقبلات الببتيد formyl، والتي تعترف الميتوكوندريا المستمدة وكذلك الببتيدات formyl المستمدة من البكتيريا11. الخلايا المناعية أيضا التعبير عن مستقبلات G البروتين المقترنة لchemokines, عائلة كبيرة من الببتيدات chemoattractant تشارك في تنظيم الاتجار بالخلايا المناعية خلال كل من التوازن والالتهاب. يتم تصنيف Chemokines إلى أربع مجموعات اعتمادا على التباعد بين أول اثنين من السيستين (C) بقايا: C, CC, CXC, وCX3C السيتوكينات, حيث X هو حمض أميني. وبالتالي، في الخلايا المناعية على الجسم الحي تحتاج إلى الاستجابة بشكل مناسب للإشارات المكانية والزمنية معقدة للغاية، مما يجعل دراسة chemotaxis مهمة شاقة. وفيما يلي نقدم لمحة تاريخية عن chemotaxis، والتي بدأت مع نهج التصوير intravital.
دراسة الكريات البيض chemotaxis يعود تاريخها إلى 188812, عندما وصف طبيب العيون ثيودور كارل غوستاف ليبر بوضوح الهجرة الموجهة من الكريات البيض إلى, وتراكم في, مواقع الالتهاب في نموذج من التهاب الكيراتي (الفطرية) النخاعي. وأكد ليبر أن جذب الكريات البيض الزائدة من قبل المواد المشتقة من مسببات الأمراض مهم للقضاء على الكائنات الحية الدقيقة الضارة عن طريق البلعوم ، والتي وصفها Metchnikoff (المعروف أيضا باسم Metschnikoff) في وقت سابق من نفس العقد13. في التجارب على الفيفو كما أجريت في 1920s كلارك وكلارك14,15, الذي استغل شفافية الشراغوف وأظهرت أن التهاب معقم الناجمة عن زيت الكروتون14 أو غيرها من المهيجات15 تسبب الكريات البيض على الالتزام الأوعية الدموية, تليها diapedesis (الهجرة عبر الاندوسلي) والهجرة السريعة من خلال مساحات الأنسجة نحو المهيجات. في المختبر التجارب باستخدام طريقة التصوير المجهري التي وضعها جان كوماندون16 أظهرت أن الكريات البيض هاجرت نحو مصدر الجسيمات chemoattractant مثل البكتيريا17. في ذلك الوقت، كانت الهويات الجزيئية للعوامل الكيميائية غير معروفة. في 1960s، ستيفن بويدن18 اعترف بأن تقنيات لدراسة النشاط الكيميائي للمواد القابلة للذوبان كانت تفتقر. ابتكر غرفة، تعرف فيما بعد باسم غرفة بويدن، مع حجرتين يفصل بينهما غشاء ورق مرشح. يتم إضافة تعليق الخلية إلى المقصورة العليا ويتم إضافة مادة الاختبار إما إلى كلا المقصورات أو إلى المقصورة السفلية فقط. بعد فترة الحضانة ، تتم إزالة غشاء الفلتر ، ويتم إصلاح الخلايا وتلطيخها. من خلال مقارنة عدد الخلايا التي تهاجر عبر غشاء الفلتر نحو البئر السفلي مع مادة الاختبار في كلا المقصورات ، أو في أي من المقصورة ، أو فقط في المقصورة السفلية ، يمكن تحديد النشاط الكيميائي. المقالات الترانسويل لا تزال شعبية اليوم وتم تعديلها بطرق مختلفة، بما في ذلك استخدام أغشية البولي المختلفة مع أحجام المسام المحددة والكثافات19،20. عيب رئيسي من المقالات Transwell هو أنه من غير العملي تصور الخلايا الهجرة مباشرة ومسار الهجرة عبر الغشاء عادة لا يتجاوز قطر الخلية المناعية.
وضعت سالي H. زيغموند غرفة chemotaxis21 التي مكنت التصور من كل من تشكيل التدرج ومورفولوجيا الخلية باستخدام الأصباغ الفلورية. تتكون الغرفة من شريحة زجاج شبكي (أكريليك) مع بئرين خطيين متوازيين ، كل منهما بحجم 100 ميكرولتر ~ ، يفصل بينهما جسر بعرض 1 مم 3-10 ميكرومتر تحت المستوى العلوي للشريحة. يتم عكس غطاء مبذر مع الخلايا ووضعها على الشريحة بحيث تمتد على البئرين. بعد إضافة chemoattractant إلى واحدة من الآبار، وانحدار أشكال التدرج الكيميائي عبر الجسر، وعادة في غضون 30-90 دقيقة. ويلاحظ الكريات البيض متعددة الأشكال النووية البشرية (الخلايا الحبيبية) في غرفة زيغموند توجيه أنفسهم نحو chemoattractant. وقد تم الإبلاغ عن اختلافات في غرفة زيغموند، بما في ذلك غرف دان22 وInsall23، وكلاهما يستخدم غطاء مبذر مع خلايا وضعت عبر بئرين يفصل بينهما جسر بعرض 1 مم. تتكون غرفة دان من آبار متحدة المركز يفصل بينها جسر دائري ، في حين أن غرفة Insall أكثر ارتباطًا بغرفة Zigmond ، ولكنها توفر جسورًا بعرضين مختلفين ، 0.5 مم و 1 مم. وقد وصفت غرفة العلاج الكيميائي رواية، يطلق عليها μ-الشريحة Chemotaxis وتصنيعها عن طريق صب حقن البلاستيك، من قبل زيمجيل وآخرون24. تتكون غرفة التكيس الكيميائي من خزانين 40 ميكرولتر تفصل بينهما قناة بعرض 1 مم بطول 2 مم وارتفاع 70 ميكرومتر. الجزء السفلي من الغرفة يتم تشكيله من قبل ورقة بلاستيكية رقيقة وقابلة للنفاذة بالغاز بنفس السماكة والخصائص البصرية لغطاء زجاجي رقم 1.524. هنا نصف قاز chemotaxis باستخدام غرفة Chemotaxis μ-Slide لتصور هجرة الضامة الجبقية المقيمة للفأرة لمدة تصل إلى 14 ساعة في تدرج chemotactic (مكمل C5a).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide (anodized aluminium) rack</td>
			<td>Ibidi, Martinsried, Germany</td>
			<td>80003</td>
			<td>Autoclavable stackable rack for channel slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide)</td>
			<td>Ibidi, Martinsried, Germany</td>
			<td>80306</td>
			<td>Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x penicillin/streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Used as supplement for RPMI 1640 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-100 &#181;L pipette with volume control ring</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000047</td>
			<td>Eppendorf Research plus pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-200 &#181;L pipette tips</td>
			<td>Greiner Bio-One International</td>
			<td>739261</td>
			<td>Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 ml polypropylene round bottom tubes</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352059</td>
			<td>Used to collect peritoneal cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera</td>
			<td>Hamamatsu Photonics Inc., Japan</td>
			<td></td>
			<td>EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-20 &#181;L pipette with volume control ring</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3123000039</td>
			<td>Eppendorf Research plus pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-G plastic catheter</td>
			<td>B Braun Mesungen AG, Germany</td>
			<td>4254503-01</td>
			<td>Used for peritoneal lavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 nm solid state laser, 50 mW</td>
			<td>Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm solid state laser, 50 mW</td>
			<td>Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>561 nm solid state laser, 50 mW</td>
			<td>Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MF48020</td>
			<td>Mouse macrophage marker and plasma membrane label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115552</td>
			<td>Mouse B cell marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer</td>
			<td>NanoEnTek (distributed by VWR International)</td>
			<td>631-1098</td>
			<td>Used to count cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CSU-X1 spinning disk scanner</td>
			<td>Yokogawa Electric Corporation, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Nipkow spinning disk unit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14170120</td>
			<td>Used for peritoneal lavage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10082139</td>
			<td>Used as supplement for RPMI 1640 media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 34580</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H21486</td>
			<td>Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ (image processing and analysis in Java)</td>
			<td>National Institutes of Health (NIH)</td>
			<td></td>
			<td>Image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4391-1MG</td>
			<td>Toll-like receptor 4 ligand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti inverse microscope</td>
			<td>Nikon, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Inverted microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Patent Blue V, sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21605-10G</td>
			<td>Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant mouse complement C5a protein</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2150-C5-025</td>
			<td>Chemoattractant for mouse macrophages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R7388</td>
			<td>Basis medium for assays</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software</td>
			<td>Perkin Elmer, Rodgau, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Spinning disk confocal microscope system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM 510 + Axiovision software</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

time-lapse imaging of mouse macrophage chemotaxis

Chemotaxis هو التوجيه بوساطة مستقبلات الخلايا على طول التدرج الكيميائي، في حين chemokinesis هو تحفيز حركية الخلايا عشوائية من قبل مادة كيميائية. العلاج الكيميائي وchemotaxis أساسية لتعبئة ونشر الخلايا المناعية. على سبيل المثال، يمكن لchemokines (السيتوكينات الكيميائية) تجنيد العدلات وأحاديات الخلايا المتداولة بسرعة إلى مواقع خارج الأوعية الدموية للالتهاب. مستقبلات المنجذبة الكيميائية تنتمي إلى عائلة كبيرة من مستقبلات G التي تقترن بالبروتين. كيف chemoattractant (أي ligand) التدرجات الهجرة الخلايا المباشرة عبر G البروتين مقرونة بإشارات مستقبلات لم يفهم تماما بعد. في مجال علم المناعة، العدلات هي خلايا نموذج شعبية لدراسة chemotaxis في المختبر. هنا نحن نصف في الوقت الحقيقي ثنائي الأبعاد (2D) chemotaxis assay مصممة خصيصا للالضامة الماوس المقيمين، والتي كانت تقليديا أكثر صعوبة في الدراسة. تتحرك الضامة بوتيرة بطيئة تبلغ ~ 1 ميكرومتر/دقيقة على سطح 2D وهي أقل ملاءمة لمقالات الهجرة من مصدر نقطة (على سبيل المثال، الهجرة نحو غيض من ميكروبيبيت مليئة بالمعالج الكيميائي) من العدلات أو ديسكو ديكلوستيليوم، والتي تحرك ترتيب استياب أسرع. مقالات ترانسويل المستخدمة على نطاق واسع مفيدة لدراسة النشاط الكيميائي للمواد المختلفة ، ولكنها لا توفر معلومات عن مورفولوجيا الخلايا أو السرعة أو الملاحة الكيميائية. هنا نحن نصف الوقت الفاصل المجهري القائم على القول الكيميائي التكيس الكلية التي تسمح بالقياس الكمي لسرعة الخلية وكفاءة التكتيك الكيميائي ويوفر منصة لتحديد محولات، ومسارات الإشارة، وتأثيرات chemotaxis.

ويرد رسم تخطيطي للشريحة chemotaxis المستخدمة لالمجهر الفيديو الفاصل الزمني من الضامة بالماوس الجيوم ية المهاجرة في تدرج chemotactic في الشكل 2A. تحتوي الشريحة على ثلاث غرف chemotaxis ، كل منها يحتوي على أربعة منافذ تعبئة. يمكن إغلاق المنافذ بشكل فردي باستخدام المقابس المعروضة أعلى الشريحة. بدلاً من ذلك، يمكن وضع غطاء غير الختم فوق منفذ غير موصول للحفاظ على العقم. بعد توصيل المنافذ 1 و4، يمكن تعبئة منطقة المراقبة (1 مم واسعة × 2 مم طويلة × 70 ميكرومتر قناة عالية تربط بين المناسير 2 و 3) بين الميناءين 2 و 3 مع المتوسطة عن طريق وضع انخفاض 15 ميكرولتر في الميناء 3 وaspirating مع 2-20 ميكرولتر حجم ماصة في الميناء 2(الشكل 2B). تم زرع تعليق للخلايا الجهوية المقيمة للفأرة (10 × 106 خلايا /مل) في منطقة المراقبة عن طريق وضع قطرة تعليق 10 ميكرولتر في الميناء 3 وaspirating ببطء في الميناء 2(الشكل 2C). تظهر في الشكل 2Cصورة نموذجية للخلايا المصنفة في منطقة المراقبة التي يتم التقاطها بواسطة المجهر على النقيض من الطور باستخدام عدسة موضوعية 10x . بعد احتضان لمدة 2-3 ساعة ، تم تعبئة شريحة chemotaxis ببطء مع المتوسط(الشكل 2D). بعد توصيل المنافذ 1 و 2، تم حقن المتوسطة ببطء عبر المنفذ 3 حتى خرج من المنفذ 4. بعد ذلك، تم تبديل القابس من المنفذ 1 إلى المنفذ 3، ثم تم ملء الخزان الثاني عن طريق حقن المتوسط ببطء عبر المنفذ 4 حتى ظهر في المنفذ 1. في هذه المرحلة، تم إعادة فحص الخلايا في منطقة المراقبة باستخدام المجهر المقلوب(الشكل 2E). من خلال مقارنة الصور قبل فترةوجيزة (الشكل 2C)وبعد(الشكل 2E)ملء الخزانات ، تم غسل ما يصل إلى ثلثي الخلايا من منطقة المراقبة. عموما، تم غسلها CD19* الخلايا (خلايا B1) ضعيفة الأتباع والخلايا المتبقية كانت في الغالب F4/80+ خلايا (الضامة). وقد تجلى ذلك من خلال المجهر الفلوري بعد وضع علامة على كل نوع من أنواع الخلايا مع الأجسام المضادة المحددة المسماة بشكل فلوري(الشكل 4). في الشكل 4A، تم تسمية الخلايا الجعلاقةية المقيمة في الماوس المعزولة حديثًا بمضادات الفلورسنت الخضراء المضادة لـ F4/80 والخلايا المضادة الفلورية الفلورية الحمراء المضادة لCD19 ، وتم تسمية نواة الخلايا بوصمة حمض نواة فلورية زرقاء. F4/80 هو علامة محددة للالضامة الماوس30، في حين CD19 هو علامة الخلية B. الشكل 4B يظهر F4/80+ الخلايا التي تم تصويرها بواسطة تدوير القرص confocal المجهر في منطقة المراقبة من غرفة chemotaxis. تم تسمية الخلايا بعد فحص chemotaxis بين عشية وضحاها سجلت هاوية زمنية، المجهر على النقيض من المرحلة.
تم إدخال C5a (chemoattractant) إلى أحد الخزانين عن طريق وضع قطرة 15 ميكرولتر من المتوسط تحتوي على 0.54 ميكروغرام/مل (الماوس المؤتلف) تكمل C5a و 10 ميكروغرام/مل براءة اختراع زرقاء V في ميناء التعبئة 1(الشكل 3A)بعد توصيل المنافذ 2 و 3. تم جذب الوسط الكيميائي الجذاب ببطء إلى الخزان عن طريق الطموح البطيء مع ماصة عبر الميناء 4. ويبين الشكل 3باء انتشار الصبغة الزرقاء بعد سحب قطرة 15 ميكرولتر في خزان. تم استخدام براءة الاختراع الزرقاء V كمؤشر مرئي غير مباشر للانتشار الكيميائي. مكملC5a الجزيئات هي أكبر بكثير من تلك التي من براءات الاختراع الأزرق الخامس (9.0 kDa مقابل 0.57 كيلو) وتنتشر ببطء أكبر. وبعد نشر مكمل C5a في الخزان، كان تركيزه ~ 0.2 ميكروغرام/مل (15 ميكرولتر/40 ميكرولتر [حجم الخزان] × 0.54 ميكروغرام/مل = 0.2 ميكروغرام/مل)، أي ما يعادل ~ 22.5 مليون متر. تدرج حاد متواضع تشكلت عبر منطقة المراقبة بعد 3 ساعة واستمر في الزيادة، لتصل إلى الحد الأقصى في حوالي 12 ساعة31. يوضح الشكل 3C مسارات الهجرة للضامة الهاجرة في تدرج C5a مكمل، بين 6-12 ساعة بعد إضافة العلاج الكيميائي. سرعة الخلية وكفاءة التكتيك الكيميائي، مفهرسة باسم y-FMI (مؤشر الهجرة y-forward؛ النطاق: -1 إلى +1) وx-FMI، من الضامة الفردية تم حسابها من مؤامرات الترحيل(الشكل 3D). يوضح الشكل 3D أيضًا مؤامرة ترحيل تم إنتاجها بعد تطبيع نقطة البداية لكل مسار ترحيل إلى X = 0 و Y = 0 أسفل مخططات المربع. توضح المجموعة الواردة في مخطط الترحيل كيفية حساب y-FMI لكل مسار ترحيل.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60750/60750fig01.jpg"> الشكل 1: سير عمل الضريبة الكيميائية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60750/60750fig01large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60750/60750fig02.jpg"> الشكل 2: التعامل مع الشرائح chemotaxis. (A)عرض 3D من الشريحة chemotaxis مع أربعة المقابس وأربع قبعات. تحتوي الشريحة على ثلاث غرف للتكزّل الكيميائي، تتكون كل منها من خزانين 40 ميكرولتر متصلين بقناة 1 مم × 2 مم، والتي يبلغ ارتفاعها 70 ميكرومتر، ويطلق عليها منطقة المراقبة. (ب)تمتد قناة الاتصال في كلا الطرفين إلى ملء المنافذ 2 و 3. بعد إدخال المقابس في ميناءي التعبئة 1 و4، تم تعبئة منطقة المراقبة مسبقًا بمتوسطة (حمراء) من خلال تطبيق قطرة متوسطة إلى المنفذ 3 وإعادة التعبئة في المنفذ 2 مع طرف ماصة 10-200 ميكرولتر. وفي وقت لاحق، طُبقت قبعات على الميناءين 2 و3 قبل احتضان الشريحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وإعداد تعليق الخلية. (C)تم زرع منطقة المراقبة، حيث تشكل التدرج الكيميائي، مع الضامة من خلال تطبيق قطرة 10 ميكرولتر من الخلايا الجهوية المقيمة الماوس في الميناء 3 وaspirating ببطء في الميناء 2. ثم احتضنت الشريحة في غرفة الرطوبة في 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة. تظهر صورة تباين المرحلة المعروضة على اليمين، التي تم الحصول عليها عبر عدسة موضوعية 10x، الخلايا الجبقية بعد البذر والاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (D)تمتلئ غرف Chemotaxis بالمتوسطة عن طريق توصيل المنافذ 1 و 2 ثم حقن المتوسطة ببطء عبر المنفذ 3 حتى ظهرت في الميناء 4. يمكن تحقيق التعبئة البطيئة والثابتة عن طريق تحويل حلقة إعداد مستوى الصوت من ماصة حجم 20-100 ميكرولتر. بعد ملء الخزان الأول، يمكن ملء الخزان الثاني عن طريق توصيل المنافذ 2 و 3 ثم حقن المتوسط ببطء في الميناء 4 حتى يظهر في الميناء 1. (E)صورة تباين المرحلة لنفس منطقة المراقبة الموضحة أعلاه(C)بعد ملء الخزانين. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. عناصر الرسم المقدمة من الياس هورن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60750/60750fig02large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60750/60750fig03.jpg"> الشكل 3: القول بـ"Chemotaxis". (أ)تم إدخال Chemoattractant إلى أحد خزاني غرفة التازي الكيميائي من خلال تطبيق انخفاض 15 ميكرولتر من المتوسط يحتوي على 0.54 ميكروغرام/مل مكمل C5a و 10 ميكروغرام/مل براءة اختراع زرقاء V لملء الميناء 1، يليه الطموح البطيء في الميناء 4. (B)في البداية بعد أن تم جرها إلى الخزان الأزرق، وكان المتوسطة التي تحتوي على chemoattractant شكل قطرة مقلوبتقريبا، ثم انتشرت ببطء في جميع أنحاء الخزان. (C)مسارات الهجرة من الضامة المهاجرة في التدرج الكيميائي (تكملة C5a) بين 6-12 ح بعد إدخال chemoattractant إلى أحد الخزانات. يشار إلى اتجاه التدرج على اليمين. تتم الإشارة إلى نهاية كل مسار ترحيل بواسطة دائرة ممتلئة. (D)قطع الأراضي Blox من السرعة، x-FMI (مؤشر الهجرة x-إلى الأمام) و y-FMI (مؤشر الهجرة y-إلى الأمام)، وهو مؤشر لكفاءة التكتيك الكيميائي الذي يتراوح من -1 إلى +1. وتم الحصول على البيانات عن طريق تحليل 25 مسارا ً لهجرة الضامة. تم اختيار الضامة في النصف السفلي من منطقة المراقبة وإظهار إزاحة عرض خلية واحدة على الأقل على مدى 6 ساعة بشكل عشوائي للتحليل. فيما يلي مؤامرة من مسارات الترحيل بعد تطبيع نقطة البداية إلى X = 0 و Y = 0. تم حساب مؤشر الضريبة الكيميائية (y-FMI) بقسمة صافي الإزاحة على طول المحور Y (د) على الطول المتراكم (ل) مسار الهجرة، كما هو موضح تخطيطياً. عناصر بيانية في الألواح A و B مقدمة من الياس هورن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60750/60750fig03large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60750/60750fig04.jpg"> الشكل 4: صور الفلورسنت للخلايا الجبقية المقيمة في الماوس الحية التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر confocal القرص الغزل. (أ)صورة التركيز الموسعة (ألمع نقطة دمج جميع الطائرات Z) من الخلايا الجبيئة الماوس معزولة حديثا وصفت مع الأخضر الفلورسنت المضادة F4/80 (علامة الضامة) الأجسام المضادة، الأحمر الفلورسنت المضادة CD19 (B علامة الخلية) الأجسام المضادة، وبقعة حمض النووي الفلورسنت الأزرق. شريط مقياس = 10 ميكرون.(B)لقطة (طائرة Z-plane واحدة) من F4/80+ خلايا (الضامة) في منطقة المراقبة لغرفة chemotaxis التي اتخذت بعد قياس chemotaxis بين عشية وضحاها. تم تسمية الخلايا بأجسام مضادة للفلورسنت الأخضر المضاد ة F4/80 وبقعة حمض نوي فلوري ة زرقاء. تم غسل التدرجات C5a و براءات الاختراع الزرقاء V من خلال إجراء وضع العلامات الخلوية ، مما يفسر لماذا الخزان العلوي في الرسم التخطيطي لغرفة chemotaxis ليس أزرق. شريط المقياس = 10 ميكرون. عنصر الرسم المقدمة من الياس هورن. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60750/60750fig04large.jpg" target="_blank">يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis at JoVE.com

Time-lapse Imaging of Mouse Macrophage Chemotaxis

هنا نحن نصف أساليب استخدام الفاصل الزمني، والمجهر المرحلة التباين لتصوير البلعامة المقيم الماوس في التدرج المكمل الكيميائي C5a. يمكن توسيع البروتوكولات إلى الخلايا المناعية الأخرى.

الوقت الفاصل تصوير الماوس ماكروفاج Chemotaxis

Chemotaxis is receptor-mediated guidance of cells along a chemical gradient, whereas chemokinesis is the stimulation of random cell motility by a ...

تقليديا، كان من الصعب دراسة الضامة في الوقت الحقيقيchemotaxis المقايسة لأن الخلايا تتحرك ببطء. يوفر هذا البروتوكول وسيلة لصورة الضامة التي يتم ترحيلها في تدرج كيميائي لمدة تصل إلى ست ساعات أو أكثر. بالمقارنة مع مقايسات الزرع مثل المقايسات نقل، هذه التقنية لديها مزايا يمكن ملاحظتها في مورفولوجيا الضامة، ويمكن قياس المعلمات مثل سرعة الخلية وكفاءة العلاج الكيميائي.وتشارك الضامة في العديد من الأمراض الالتهابية، وهذه التقنية يمكن أن تكون مفيدة لدراسة الأدوية المصممة لمنع chemotaxis. ويمكن أيضا أن تطبق على أنواع الخلايا الأخرى مثل monocytes الإنسان. عند محاولة هذه التقنية للمرة الأولى، فمن الأفضل لممارسة ملء غرف chemotaxis قبل العمل مع الخلايا.واحدة من أهم جوانب هذه التقنية هو تجنب فقاعات الهواء. ابدأ بملء القنوات المتصلة لواحد أو اثنين من الشرائح chemotaxis مع تعديل RPMI 1640 HEPES Medium المعدة وفقًا لاتجاهات المخطوطات. ضع شريحة في طبق ثقافة الخلية ، واضبط الطبق على كتلة من الألومنيوم ساخنة إلى 37 درجة مئوية.ثم إدراج المقابس في الموانئ واحد وأربعة. استخدام 200 ميكروليتر مشطوف الأنابيب تلميح لإيداع 15 ميكرولترات من تعديل RPMI 1640 HEPES المتوسطة في ملء ميناء ثلاثة. بعد ذلك ، أدخل طرف الأنابيب في المنفذ الثاني ، وpirate 15 ميكروليتر بمعدل سريع معتدل ، والذي سيملأ مسبقًا القناة المتصلة بالإضافة إلى قناتي العرض المرافقتين.غطي الموانئ التعبئة 2 و3 بقبعات ووضع شريحة chemotaxis على رف في غرفة رطوبة مغلقة داخل حاضنة جافة وخالية من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. لعزل الضامة، أدخل قسطرة بلاستيكية قياس 24 في تجويف الصفاق من ماوس من العمر ثلاثة إلى أربعة أشهر التضحية، واستخدام حقنة بلاستيكية خمسة ملليلتر ل lavage تجويف مع محلول الملح الاحتياطية هانك الباردة الجليد دون الكالسيوم أو المغنيسيوم. بعد جمع المتوسطة المراحيض في أنبوب، الطرد المركزي في 300 مرة G لمدة 6.5 دقيقة.تجاهل عظمى، وإعادة تعليق الخلايا في 200 ميكرولترات من معدلة RPMI 1640 المتوسطة. تميّف aliquot من الخلايا تعليق واحدة إلى 20. ثم استخدم جهاز عد لحساب الخلايا.تمييع الخلايا إلى تركيز نهائي من 10 مرات 10 إلى الخلايا الست لكل ملليلتر، والحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية في كتلة الألومنيوم ساخنة. Pipet تعليق الخلية صعودا وهبوطا خمس مرات للحد من التكتل، وإيداع بلطف 10 ميكرولتررس على ميناء ثلاثة من غرفة chemotaxis. ضع طرف الأنابيب في المنفذ الثاني، وارسم ببطء تعليق الخلية في قناة الاتصال.بمجرد أن تم إدخال تعليق الخلية ، وإزالة المقابس في الموانئ واحد وأربعة لوقف تدفق ، ووضع قبعات على جميع الموانئ الأربعة ملء. ثم، ضع الشرائح chemotaxis في غرفة الرطوبة درجة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. افحص منطقة المراقبة بمجهر مقلوب.ثم ضع المقابس في التعبئة الموانئ واحد واثنين، والتحقق ما إذا كان يتم تعبئة ميناء ملء ثلاثة إلى الأعلى مع المتوسطة، وخالية من فقاعات الهواء. إذا لزم الأمر، استخدم إبرة حقنة قياس 27 معقم لإزاحة فقاعات الهواء. المقبل، وpirate 60 ميكرولترات من المتوسطة مع الأنابيب الميكانيكية 100 ميكرولتر، ووضع الطرف في ملء الميناء ثلاثة.استخدام حجم إعداد حلقة لحقن ببطء وباطراد المتوسطة في الخزان حتى تصل إلى أعلى ميناء ملء أربعة بعد دقيقة إلى دقيقتين. لتعبئة الخزان الثاني، قم بتحريك المكونات من المنفذ الأول وأدخلها ببطء إلى المنفذ الثالث. 50 microliters 50 من المتوسطة، ووضع تلميح الأنابيب في الميناء أربعة، وحقن ببطء المتوسطة في الخزان الثاني بحيث تصل إلى أعلى ميناء ملء واحد بعد دقيقة إلى دقيقتين.إضافة 495 ميكرولترات من متوسطة إلى اثنين ملليلتر أنبوب أجهزة الطرد المركزي الصغيرة، وإضافة خمسة ميكرولترات من براءات الاختراع الأزرق خمسة. دوامة لفترة وجيزة الخليط، ثم إضافة 5.4 ميكرولترات من الماوس المؤتلف تكمل C5a ودوامة مرة أخرى لخلط. تأكد من أن الاكتئاب الضحلة في الجزء العلوي من ميناء واحد هو المتوسطة خالية، وإيداع 15 ميكرولترات من تكملة الأزرق C5a التي تحتوي على المتوسطة.ثم إدراج 200 تلميح الأنابيب ميكرولتر في ملء الميناء أربعة، وتدوير ببطء حلقة إعداد وحدة التخزين لرسم المتوسطة في الخزان المعاكس. ارسم الهواء في العمود العمودي القصير للتعبئة المنفذ واحد حتى واجهة السائل والهواء في منتصف الطريق في العمود. ثم قم بتوصيل المنفذ واحد قبل رفع بلطف pipet من المنفذ أربعة، والتأكد من أن الشريحة لا تزال في مكانها، وببطء المكونات المنفذ أربعة.لأداء التصوير الفاصل الزمني، ضع شريحة chemotaxis على خشبة المجهر المقلوب مزودة حاضنة المرحلة، وصور منطقة المراقبة مع عدسة هدف 10X المرحلة النقيض، مع التركيز على لاميليبوجيا الضامة. الشريحة chemotaxis المستخدمة لمجهر الفيديو الفاصل الزمني من الضامة الصفاقية الماوس لديه ثلاث غرف chemotaxis، كل منها لديه أربعة منافذ ملء. وكانت الخلايا مبذرة في منطقة المراقبة في كل غرفة.وبعد فترة حضانة لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات، كانت الغرف مليئة ببطء بالوسط. وعندما تم تفتيش الزنزانات الموجودة في منطقة المراقبة، تم غسل ما يصل إلى ثلثي الزنزانات. عموما, تم غسلها ضعيفة أتباع خلايا B-1, وكانت الخلايا المتبقية في الغالب الضامة.للتمييز بين الضامة من الخلايا B، تم تسمية الخلايا المعزولة حديثًا بأضداد محددة. تم تسمية الضامة مع الفلورسي الخضراء، والخلايا B مع الأحمر، وnuclei الخلية مع الأزرق. تم التحقيق في هجرة الضامة من خلال إدخال مكملة C5a، وهو كيميائي، إلى أحد الخزانين.تم تسجيل مسارات الترحيل للزوام المهاجرة في تدرج C5 التكميلي. تم تطبيع نقطة بداية كل مسار ترحيل إلى X يساوي صفر و ص يساوي صفر لإنشاء مخطط ترحيل. ثم تم حساب سرعة الخلية وكفاءة العلاج الكيميائي لل الضامة الفردية.وقد كانت هذه التقنية مفيدة لدراسة أدوار الوحدات الفرعية البروتين G، ورو GTPases، وحركة الضامة في chemotaxis.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

تعيش خلية من التصوير<emالعصوية الرقيقة> و العقدية الرئوية الآلي باستخدام الميكروسكوب مرور الزمن

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Intravital Imaging of the Mouse Popliteal Lymph Node

Intravital التصوير من العقدة اللمفية الفأر المأبضية

Lymph nodes (LNs) are secondary lymphoid organs, which are strategically located throughout the body to allow for trapping and presentation of foreign ...

Non-invasive Optical Imaging of the Lymphatic Vasculature of a Mouse

غير الغازية التصوير الضوئي من الأوعية الدموية اللمفية على فأرة الحاسوب

The lymphatic  vascular system is an important component of the circulatory system that  maintains fluid homeostasis, provides immune surveillance, and ...

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

دراسة تفاعلات<em&gt; المكورات العنقودية الذهبية</em&gt; مع العدلات بواسطة التدفق الخلوي والوقت الفاصل بين المجهري

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

نخاع العظام المستمدة من بلعم الإنتاج

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

Fluorescence Time-lapse Imaging of the Complete S. venezuelae Life Cycle Using a Microfluidic Device

مضان الوقت الفاصل بين التصوير من كامل<em&gt; S. venezuelae</em&gt; دورة الحياة عن طريق جهاز ميكروفلويديك

Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of ...

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

طريقة الكل على رقاقة للتحليل الكيميائي العدلات السريعة مباشرة من قطرة الدم

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

تصور بلعم الفخاخ خارج الخلية باستخدام المجهر [كنفوكل]

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Fabricating Optical-quality Glass Surfaces to Study Macrophage Fusion

اختﻻق الواجهات الزجاجية الجودة البصرية لدراسة الانصهار بلعم

Visualizing the formation of multinucleated giant cells (MGCs) from living specimens has been challenging due to the fact that most live imaging ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

الوقت الفاصل بين التصوير 3D البلعمه التي الضامة الماوس

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...