Name: quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

המחקר המוצג במאמר זה היה נתמך על ידי מענקים קודמים מן המכונים הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי לרפואת שיניים ומחקר הגולגולת (NIH/נדבך) R01DE020884 ל J.K.E. והמכון הלאומי לבריאות/המכון הלאומי על אלכוהול התעללות ואלכוהוליזם (NIH/NIAAA) F32AA021320 כדי C.B.L. ועל ידי המענק הנוכחי מן המוסדות הלאומיים לבריאות/המכון הלאומי על אלכוהול התעללות (NIH/NIAAA) R00AA023560 כדי C.B.L. אנו מודים לרואבן גונזלס למתן ולסייע בניתוח כרומוטוגרף גז. אנחנו מודים לטיטנה בונטיקוס. וד ר ג'ינה נובלס כותבים עזרה

כל העוברים דגים בשימוש בהליך זה הועלו והתרבו בעקבות הוקמה פרוטוקולים IACUC27. פרוטוקולים אלה אושרו על ידי אוניברסיטת טקסס באוסטין ובאוניברסיטת לואיוויל.
הערה: קו הדגים Tg (fli1: EGFP)y1 שימש במחקר זה28. כל המים המשמשים בהליך זה הוא סטרילי מים אוסמו...

<ol>
	<li>Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+alcohol+syndrome:+a+prospective+national+surveillance+study.">Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study.</a> Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).</li><li>Cudd, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+systems+for+the+study+of+alcohol+teratology.">Animal model systems for the study of alcohol teratology.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).</li><li>Williams, J. F., Smith, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committee+on+Substance+Abuse.+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders.">Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders.</a> Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).</li><li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors.">A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).</li><li>Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+(PAE):+insights+into+FASD+using+mouse+models+of+PAE.">Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).</li><li>Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+Alcohol+Consumption:+Studies+with+Mutant+Mice.">Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice.</a> International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).</li><li>Marquardt, K., Brigman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+prenatal+alcohol+exposure+on+social,+cognitive+and+affective+behavioral+domains:+Insights+from+rodent+models.">The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models.</a> Alcohol. 51, 1-15 (2016).</li><li>Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+of+alcohol-induced+craniofacial+dysmorphism.">Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).</li><li>Lipinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+face-brain+dysmorphology+patterns+are+correlative+and+exposure-stage+dependent.">Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent.</a> PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Parnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders.">The genetics of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).</li><li>Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratogenic+actions+of+ethanol+in+the+mouse:+a+minireview.">Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview.</a> Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).</li><li>Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+rescues+cranial+neural+crest+from+cell+death+induced+by+ethanol+exposure.">Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).</li><li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure.">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).</li><li>Hong, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdon+mutation+and+fetal+ethanol+exposure+synergize+to+produce+midline+signaling+defects+and+holoprosencephaly+spectrum+disorders+in+mice.">Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice.</a> PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).</li><li>Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+ethanol+exposure+activates+protein+kinase+A+and+impairs+Shh+expression+in+prechordal+mesendoderm+cells+in+the+pathogenesis+of+holoprosencephaly.">Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).</li><li>Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+inhibition+of+retinoic+acid+synthesis+as+a+potential+mechanism+for+fetal+alcohol+syndrome.">Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome.</a> The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).</li><li>Wentzel, P., Eriksson, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+fetal+dysmorphogenesis+in+the+mouse+is+diminished+by+high+antioxidative+capacity+of+the+mother.">Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother.</a> Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).</li><li>Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+absence+of+nNOS+worsens+fetal+alcohol+effects+in+mice.+II:+microencephaly+and+neuronal+losses.">Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).</li><li>Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+genetics+in+fetal+alcohol+effects:+null+mutation+of+the+nNOS+gene+worsens+alcohol-induced+cerebellar+neuronal+losses+and+behavioral+deficits.">Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits.</a> Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).</li><li>Bonthius, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+(nNOS)+worsens+alcohol-induced+microencephaly+and+neuronal+loss+in+developing+mice.">Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice.</a> Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).</li><li>Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fancd2+counteracts+the+toxic+effects+of+naturally+produced+aldehydes+in+mice.">Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice.</a> Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).</li><li>Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders:+Zebrafish+as+a+Model+for+Ethanol+Teratogenesis.">Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis.</a> Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).</li><li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis:+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder.">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).</li><li>Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+age+strengthens+barriers+to+ethanol+accumulation+in+zebrafish.">Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish.</a> Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).</li><li>Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol's+molecular+targets.">Ethanol's molecular targets.</a> Science Signaling. 1 (28), (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Distribution+and+permeability+of+zebrafish+embryos,+Brachydanio+rerio.">Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio.</a> Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).</li><li>Lippi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alcohol+used+for+cleansing+the+venipuncture+site+does+not+jeopardize+blood+and+plasma+alcohol+measurement+with+head-space+gas+chromatography+and+an+enzymatic+assay.">The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay.</a> Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).</li><li>Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+concentration+in+56+refillable+electronic+cigarettes+liquid+formulations+determined+by+headspace+gas+chromatography+with+flame+ionization+detector+(HS-GC-FID).">Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).</li><li>Heit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Neural+Ethanol+and+Acetaldehyde+Using+Headspace+GC-MS.">Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).</li><li>Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Validation+of+a+Method+for+Alcohol+Analysis+in+Brain+Tissue+by+Headspace+Gas+Chromatography+with+Flame+Ionization+Detector.">Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector.</a> Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).</li><li>Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+methanol,+acetaldehyde,+acetone,+and+ethanol+in+human+blood+by+gas+chromatography+with+flame+ionization+detection.">Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection.</a> Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).</li><li>Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdialysis+of+ethanol+during+operant+ethanol+self-administration+and+ethanol+determination+by+gas+chromatography.">Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).</li><li>Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+ethanol+kinetics+in+rat+brain.">In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).</li><li>Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+ethanol+concentrations+and+ethanol+discrimination+in+rats:+effects+of+dose+and+time.">Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time.</a> Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).</li><li>Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily-conserved+mechanism+of+calcium-dependent+neurotoxicity.">An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).</li><li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish.">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).</li><li>Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+and+hindbrain+development+in+zebrafish+is+sensitive+to+ethanol+exposure+involving+agrin,+Fgf,+and+sonic+hedgehog+function.">Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).</li></ol>

כמערכת מודל התפתחותית, הדגים מתאימים באופן אידיאלי לחקר ההשפעה של גורמים סביבתיים בפיתוח. הם מייצרים מספר גדול של עוברים מופרות חיצוני, אשר מאפשר תזמון מדויק ומינון בלימודי אתנול. זה, בשילוב עם יכולות הדמיה חיה ושימור גנטי והתפתחותי עם בני אדם, להפוך את הדגים מערכת מודל רבת עוצמה ללימודי ה...

הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) מתאר מגוון רחב של ליקויי נוירולוגיות ו הגולגולת דיסקוורפולוגיות הקשורים לחשיפה האתנול העובריים1. גורמים מרובים, כולל עיתוי ומינון של חשיפה אתנול ורקע גנטי, לתרום וריאציה של fasd2,3. בבני אדם, מערכת היחסים המורכבת של משתנים אלה עושה לימוד והבנה של האטיולוגיה של FASD מאתגרת. דגמי בעלי חיים הוכיחו באופן קריטי בפיתוח ההבנה שלנו לגבי הבסיס המכניסטי של האתנול הטרוגניות. מגוון רחב של מערכות מודל בעלי חיים נעשה שימוש כדי ללמוד היבטים מרובים של FASD ותוצאות היו עקביים במידה ניכרת עם מה נמצא בחשיפה בבני אדם4. מערכות דגם מכרסמים משמשים כדי לבחון היבטים רבים של fasd, עם עכברים להיות הנפוצים ביותר5,6,7. רוב העבודה התמקדה פגמים התפתחותיים לחשיפה מוקדמת של אתנול8, למרות מאוחר יותר חשיפה לאתנול הוכח לגרום לחריגות התפתחותיות כמו גם9. יתר על כן, היכולות הגנטיות של עכברים סייעו מאוד היכולת שלנו לחקור את בסיס גנטי של fasd10,11. מחקרים אלה בעכברים מצביעים מאוד על כך יש אינטראקציות ג'ין אתנול עם מסלול קיפוד סוניק, חומצה retinoic איתות, סופראוקסיד dismutase תחמוצת חנקן סטנדרטים I, Aldh2 ו Fancd28,10,11,12,13,14,15,16, 17, 18, 5, 19,19,19, 19,20,21. מחקרים אלה מראים כי מודלים בעלי חיים הם קריטיים כדי לקדם את ההבנה שלנו של FASD ואת המנגנונים הבסיסיים שלה.
דג דג זברה התפתחה כמערכת דגם רב עוצמה כדי לבחון היבטים רבים של אתנול teratogenesis22,23. בשל ההפריה החיצונית שלהם, פוריות גבוהה, מעקב גנטי, ויכולות הדמיה חיה, מתאימים באופן אידיאלי לגורמי לימוד כגון עיתוי, מינון, וגנטיקה של האתנול teratogenesis. האתנול יכול להינתן לעוברים מבויים בדיוק והעוברים יכולים להיות בתמונה כדי לבחון את ההשפעה הישירה של אתנול במהלך תהליכים התפתחותיים. עבודה זו יכולה להיות קשורה ישירות לבני אדם, כי התוכניות הגנטיות של הפיתוח הם שימור מאוד בין דג ובני אדם ולכן יכול לעזור להנחות FASD מחקרים אנושיים24. בעוד דגים שימשו כדי לבחון את האתנול teratogenesis, חוסר הסכמה בדיווח ריכוזי אתנול עובריים עושה השוואה לבני אדם קשה25. במערכות היונקים, רמות אלכוהול בדם מתאם ישירות לרמות האתנול של רקמות26. רבים ממחקרי הדגים מתייחסים לעוברים לפני היווצרות מוחלט של מערכת הדם שלהם. ללא מדגם אימהי לבחון, תהליך להערכת ריכוזי אתנול נדרש כדי לכמת את רמות האתנול בתוך העובר. כאן אנו מתארים תהליך לכמת ריכוזי אתנול בתוך העובר בפיתוח דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה גז שטח הראש.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoSampler, CP-8400</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Gas Chromatograph Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>8010-0198</td>
			<td>Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Chromatograph, CP-3800</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Innowax capillary column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19095N-123I</td>
			<td>30 m x 0.53 mm x 1.0 &#956;m film thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyrdogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-7021</td>
			<td>Replacement caps/septa for gas chromatograph vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads .5 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079105z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads 1.0 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>57343-U</td>
			<td>Replacement fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Star Chromatography Workstation</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>23154</td>
			<td>Replacement inlet septa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography

הפרעות בספקטרום האלכוהול העוברי (FASD) לתאר רצף משתנה מאוד של מומים התפתחותיים המושרה אתנול, כולל מורפולוגיות הפנים וליקויים נוירולוגיים. עם פתולוגיה מורכבת, FASD משפיע על כ 1 ב 100 ילדים שנולדו בארצות הברית בכל שנה. בשל האופי המשתנה מאוד של FASD, מודלים בעלי חיים הוכיחו ביקורתית הבנה המכונה הנוכחי שלנו של פגמים המושרה בפיתוח אתנול. מספר גדל והולך של מעבדות התמקד בשימוש בדגים כדי לבחון פגמים התפתחותיים המושרה אתנול. Zebrafish לייצר מספר גדול של הופרות חיצוני, מעוקב גנטית, עוברים שקופים. זה מאפשר לחוקרים לשלוט בדיוק בעיתוי והמינון של חשיפה אתנול בהקשרים גנטיים מרובים לכמת את ההשפעה של חשיפה האתנול עובריים באמצעות טכניקות הדמיה חיה. זה, בשילוב עם הרמה הגבוהה של שימור של גנטיקה ופיתוח עם בני אדם, הוכיחה הדגים להיות מודל רב עוצמה שבו ללמוד את הבסיס המכונה של הטרוגניות האתנול. עם זאת, חשיפה האתנול משטרי יש מגוון בין מחקרים שונים דג זברה, אשר יש לבולבל את הפרשנות של נתוני דג זברה על פני מחקרים אלה. הנה פרוטוקול כדי כמת ריכוזי האתנול בעוברי דג דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי.

רמות האתנול בדם לא יכול להיקבע ב zebrafish מוקדם, כי הם חסרי מערכת הדם שנוצר במלואו. כדי לקבוע את רמת הריכוז האתנול בעוברי הדגים דג זברה, רמות האתנול נמדדות ישירות מרקמת הומוגניים מעובריים. כדי למדוד כראוי את ריכוזי האתנול עובריים, נפח עובריים יש לקחת בחשבון. העובר (החלמון מוצמד) יושב בתוך הצ (קל?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכמת רמות האתנול בעובר דג זברה באמצעות כרומטוגרפיה הראש שטח גז משיטות חשיפה נכונה לעיבוד העובר ניתוח אתנול.

קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

פרוטוקול זה הוא משמעותי כי זה עוזר להבין את הפרמקוקינטיקה של אתנול בפיתוח עוברי זברה וזה יעזור לתקנן אתנול חשיפה משטרים במחקרים זברה. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שהיא מאפשרת לחוקרים למדוד במהירות ובשכפול רמות אתנול במהלך התפתחות עוברית, במיוחד בעוברים שבהם אספקת הדם אינה זמינה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת בקלות על מערכות מודל אחרות, כמו גם גורמים סביבתיים אחרים בהנחה טכניקה נכונה והגדרת ציוד.הייתי מצפה מאנשים המבצעים פרוטוקול זה בפעם הראשונה להיאבק עם המהירות הדרושה כדי למנוע אידוי אתנול במהלך עיבוד עובר. התחל בהעברת 10 עוברים עם נוזל עוברי נוסף לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר המסומנים בקו בנפח של 250 מיקרוליטרים. מוסיפים מים לקו המילוי.הכינו צינורות מיקרוצנטריפוגה נוספים לדגימות מנוונות. כדי להסיר את chorion, דגירה העוברים בצלחת פטרי 100 מילימטר עם שני מיליגרם למיליליטר של קוקטייל פרוטאז במדיית עובר במשך 10 דקות. בעדינות מערבל את המנה כל כמה דקות כדי לשבור את המקהלה.לאחר שכל העוברים חופשיים מהבחירה, מוציאים אותם מקוקטייל הפרוטאז ושוטפים אותם פעמיים עם מדיה טרייה. ואז להעביר את העוברים לצלחת 100 מילימטר טרי. כאשר כל הדגימות מוכנות למדידת נפח, השתמש במיקרופייפאט P200 עם הקצה הקטן ביותר האפשרי כדי להסיר בזהירות את כל הנוזלים מרחבי העוברים.לשקול את המים עם סולם עם פחות מ 0.1 מיליגרם דיוק, ולאחר מכן לקבוע את הנפח של 10 עוברים על ידי חיסור המשקל של המים שהוסרו מ 250 microliters. כדי לקבוע את הנפח של עובר יחיד, חלק את ההפרש ב- 10. אוספים את העוברים ממיכלי ההזדווגות ומ מניחים אותם בצלחת פטרי סטנדרטית של 100 מ"מ ואז דוגרים את המנה ב-28.5 מעלות צלזיוס.בשש שעות לאחר ההפריה, מעבירים עד 100 עוברים לתבשיל חדש עם תקשורת עוברית ו-1%אתנול או מדיה בלבד. מכסים אך לא לאטום את צלחות פטרי ומ מניחים אותן באינקובטור של 28.5 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות או עד שהן מגיעות ל-24 שעות לאחר ההפריה. השתמשו בשני מיקרופיפטים P200 מוגדרים ל-50 מיקרוליטרים ושאפו את תטגם קוקטייל הפרוטאז לאחד ומים לשנייה.ואז במהירות למקם 10 עוברים בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה זכוכית ולסגור את הכובע. חזור על תהליך זה עבור כל הדגימות להיבדק, פקדים ועוברים שטופלו באתנול. עבודה עם מדגם אחד בכל פעם, לפתוח במהירות את הכובע ולחושף את כל המדיה עובר שיורית עם micropipette P200 להגדיר 200 microliters.במהירות אך בעדינות להוסיף ולהסיר את 50 microliters של מים, ולאחר מכן להוסיף את 50 microliters של קוקטייל פרוטאז ולסגור את מכסה הצינור. תן את המדגם לשבת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואז במהירות להוסיף 450 microliters של חמישה נתרן כלורי טוחן ולסגור את כובע הצינור. הומוגניזציה המדגם על ידי מערבולת במשך 10 דקות ולהעביר שני microliters של על טבעי לבקבוקון כרומטוגרפיה גז.לאטום את הבקבוקון עם כובע polytetrafluoroethylene. לאחר השלמת שיטת האתחול, טען 436 אתנול SPME נוכחי שתיים עד חמש דקות של הפעלת RG. ספיד מתפריט השיטות בתוכנת הניתוח עבור כל מדגם ברשימת הדוגמיות.מלאו את רשימת הדגימות החל מהאוויר, המים, וחמישה בקבוקי פרוטאז נתרן כלורי טוחנים. לאחר מכן הזן את תקני אתנול לפי סדר מ 0.3125 כדי 40 מילימולר. בצע את הסטנדרטים עם הסיבוב השני של החסר.הזן את כל דגימות עובר הומוגני supernatant להיבדק מן הנמוך ביותר לריכוז אתנול החזוי הגבוה ביותר ולסיים על ידי הזנת סיבוב שלישי של כדורי סרק. מוסיפים את בקבוקוני כרומטוגרפיה גז לדגימה כדי שבו הדגימות הוזנו ולאפשר להם להתחמם במשך 10 עד 15 דקות. לאחר מכן התחל את הפעלת הדוגמה באמצעות התוכנה.לאחר השלמת כל הפעולות, הפעל את שיטת הכיבוי על-ידי הוספת דוגמה סופית ברשימת הדוגמיות והפעלת המתנה.meth. גבה את כל הנתונים שנרכשו במהלך הריצה לדוגמה. לאחר השלמת שיטת הכיבוי, לחץ על כרומטוגרמה פתוחה ולפתוח את התיקייה עם התוצאות.דוגמאות משולבות באופן אוטומטי בתוכנית זו. בתוצאות, ודא שהפסגות הנכונות שולבו. לאחר שכל הדגימות אושרו, הדפס או יצא את התוצאות.התווה את גובה השיא של תקני האתנול בגרף ולאחר מכן חשב את ערכי השיפוע, y-intercept וה- r בריבוע. השג את ערך האתנול עבור כל מדגם על-ידי חיסור גובה השיא של המדגם מחיתוך-y של התקנים וחלוקת ערך זה על-ידי שיפוע התקנים. כדי לחשב את ריכוז האתנול בעוברים, לחשב את גורם הדילול עבור כל מדגם ולהכפיל את ערך אתנול המדגם על ידי גורם דילול זה.לבסוף, לחשב דגימות הפניה למדיה על ידי הכפלת ערך אתנול התקשורת על ידי גורם דילול של 10. כדי לחשב כראוי את ריכוזי האתנול העובריים, נמדדו כמויות העוברים הן בכוריון שלהם והן הוסרו מה chorion שלהם. בניתוח זה, העובר היווה 56% מהנפח הכולל בתוך המקהלה.בהתבסס על עבודה שפורסמה בעבר, 73.6% שימשו כתכני המים העובריים עבור כל הניתוחים שהוצגו. זה הביא מים הכוללים 0.82 microliters של 1.1 microliters של נפח עוברי. מתוך נפח המים הכולל, 49% כלולים בעובר ו-51% נמצאים בנוזל החוץ-מבריוני.לצורך ניתוח כרומטוגרפיה של גז, נותחו שתי קבוצות של 15 דגימות והתקשורת שבה טופלו נמדדו חמש פעמים לכל קבוצה. רמות אתנול התקשורת היו 143.6 מילימולר לקבוצה אחת ו 133.6 מילימולר לקבוצה 2. ריכוזי האתנול של העוברים היו בממוצע 63.5 מילימולרים ו-53.1 מילימולרים לקבוצות 1 ו-2 בהתאמה.יחס של ריכוז אתנול עוברי לרמות התקשורת של אתנול עבור כל מדגם חושב. לקבוצה הראשונה היו 44% מרמות האתנול במדיה, בעוד שלקבוצה היו 40% מרמות האתנול התקשורתי. עוברי בקרה לא מטופלים נמדדו בריכוז אתנול תקשורתי אפס מילימולרי.הדבר החשוב ביותר לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא כי עיבוד העוברים לניתוח GC כראוי הוא קריטי כמו אתנול הוא נדיף יהיה להתאדות במהירות. הדרך הטובה ביותר לבצע שלב זה מתוארת, אבל זה צריך להיות מתורגל לפתח זיכרון שריר תקין. הליך זה יסייע לתקנן משטרים לטיפול באתנול בזברהפיש ויאפשר לעבודה עתידית לנתח את המנגנונים הגנטיים והתאיים של טרטוגניות אתנית.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

מדידת יציבות חלבון בחיים עוברי דג הזברה שימוש הקרינה רדיואקטיבית לאחר photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

פגיעה כלי מכאנית בעוברי דג הזברה

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

הכנת דוגמאות זחל דרוזופילה עבור גז כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית (GC-MS)-מבוסס מטבולומיקס

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...