Name: quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

この記事で発表された研究は、国立衛生研究所/国立歯科頭蓋顔面研究所(NIH/NIDCR)R01DE020884からJ.K.E.への以前の助成金によって支えられていました。 国立衛生研究所/アルコール乱用・アルコール依存症研究所(NIH/NIAAA)F32AA021320からC.B.L.への、国立衛生研究所/国立アルコール乱用研究所(NIH/NIAAA)R00AA023560からC.B.L.ガスクロマトグラフ分析を提供し、支援してくれたルーベン・ゴンザレスに感謝します。ティアナ・オンティヴェロスとジーナ・ノーブルズ博士の執筆支援に感謝します。

この手順で使用されるすべてのゼブラフィッシュ胚は、確立されたIACUCプロトコル27に従って飼育および飼育された。これらのプロトコルは、テキサス大学オースティン校とルイビル大学によって承認されました。
注:ゼブラフィッシュラインTg(fli1:EGFP)y1は、この研究で使用されました28.この手順で使用されるすべての水?...

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+concentration+in+56+refillable+electronic+cigarettes+liquid+formulations+determined+by+headspace+gas+chromatography+with+flame+ionization+detector+(HS-GC-FID).">Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).</li><li>Heit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Neural+Ethanol+and+Acetaldehyde+Using+Headspace+GC-MS.">Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).</li><li>Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. 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開発モデルシステムとして、ゼブラフィッシュは環境要因が開発に及ぼす影響を研究するのに理想的です。彼らは、エタノール研究で正確なタイミングと投与パラダイムを可能にする外部受精胚の多数を生成します。これは、ライブイメージング能力と人間との遺伝的および発達的保全と組み合わせることで、ゼブラフィッシュを気象学研究のための強力なモデルシステムにします。記載さ?...

胎児アルコールスペクトル障害(FASD)は、胚性エタノール暴露1に関連する幅広い神経障害および頭蓋顔面異形について説明する。エタノール暴露および遺伝的背景のタイミングと投与量を含む複数の要因は、FASD2、3の変動に寄与する。人間では、これらの変数の複雑な関係は、FASDの病因を研究し、理解することは困難です。動物モデルは、エタノール催奇形性の機械論的基礎に関する我々の理解を深める上で極めて重要であることが証明されている。多種多様な動物モデルシステムがFASDの複数の側面を研究するために使用されており、結果はヒト4の暴露に見られるものと著しく一致している。げっ歯類モデルシステムは、マウスが最も一般的な5、6、7である、FASDの多くの側面を調べるために使用されます。この研究の大半は、初期エタノール暴露8に対する発達欠陥に焦点を当てているが、エタノールへの後の暴露は、同様に9の発達異常を引き起こすことが示されている。さらに、マウスの遺伝的能力は、FASD10,11の遺伝的基盤を調査する能力に大いに役立っています。マウスにおけるこれらの研究は、ソニックヘッジホッグ経路との遺伝子エタノール相互作用があることを強く示唆しています, レチノイン酸シグナル伝達,スーパーオキシドジスムターゼ, 一酸化窒素シンターゼI, Aldh2とFancd28,10, 11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21.これらの研究は、動物モデルがFASDとその根本的なメカニズムに関する我々の理解を進めるために重要であることを示している。
ゼブラフィッシュは、エタノールの多くの側面を調べる強力なモデルシステムとして登場しました22,23.外的受精、高い胎児性、遺伝的な管への影響、および生きている画像化能力のために、ゼブラフィッシュは、エタノールのテラトジェネシスのタイミング、投与量、遺伝学などの因子を研究するのに理想的です。エタノールは、正確にステージされた胚に投与することができ、胚を画像化して、発生過程におけるエタノールの直接的な影響を調べることができます。開発の遺伝的プログラムはゼブラフィッシュとヒトの間で高度に保存されているため、FASDのヒト研究を導くのに役立つため、この研究は、ヒトに直接関連することができます24.ゼブラフィッシュはエタノールのテラトジェネシスを調べるために使用されてきたが、胚エタノール濃度を報告する際のコンセンサスの欠如は、ヒトとの比較を困難にする25.哺乳類システムでは、血中アルコール濃度は組織エタノールレベル26に直接相関する。ゼブラフィッシュ研究の多くは、循環系の完全な形成前に胚を治療する。検査する母体試料が存在しない場合、胚内のエタノール濃度を定量化するにはエタノール濃度を評価するプロセスが必要です。ここでは、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いて、現像するゼブラフィッシュ胚中のエタノール濃度を定量するプロセスについて説明する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoSampler, CP-8400</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Gas Chromatograph Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>8010-0198</td>
			<td>Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Chromatograph, CP-3800</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Innowax capillary column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19095N-123I</td>
			<td>30 m x 0.53 mm x 1.0 &#956;m film thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyrdogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-7021</td>
			<td>Replacement caps/septa for gas chromatograph vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads .5 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079105z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads 1.0 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>57343-U</td>
			<td>Replacement fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Star Chromatography Workstation</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>23154</td>
			<td>Replacement inlet septa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography

胎児アルコールスペクトル障害(FASD)は、顔面変形および神経障害を含むエタノール誘発発達欠陥の非常に可変的な連続体を記述する。複雑な病理を持つFASDは、毎年米国で生まれた約100人に1人の子供に影響を与えます。FASDの非常に可変的な性質のために、動物モデルはエタノール誘発開発欠陥の私達の現在の機械論的理解の重大な証明された。ゼブラフィッシュを使ってエタノールによる発達欠陥を調べることに焦点を当てた研究室が増えています。ゼブラフィッシュは、外部受精、遺伝的に引っ張り可能な半透明の胚を多数産生する。これにより、研究者は複数の遺伝的文脈でエタノール暴露のタイミングと投与量を正確に制御し、ライブイメージング技術を通じて胚性エタノール暴露の影響を定量化することができます。これは、遺伝学とヒトとの発達の両方の高度な保全と相まって、ゼブラフィッシュがエタノール催奇性の機械学的基礎を研究する強力なモデルであることが証明されている。しかし、エタノール暴露レジメンは、これらの研究全体でゼブラフィッシュデータの解釈を混乱させている異なるゼブラフィッシュ研究の間で変化している。ここでは、ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚のエタノール濃度を定量するプロトコルを示します。

血中エタノール濃度は、完全に形成された循環系を欠いているため、初期の胚ゼブラフィッシュでは決定できません。ゼブラフィッシュ胚中のエタノール濃度のレベルを決定するために、エタノールレベルは均質化された胚組織から直接測定される。胚性エタノール濃度を適切に測定するには、胚量を考慮する必要があります。胚(卵黄付)は、胎児の体液で囲まれた絨毛膜(卵殻)の中に位置し...

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Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

この研究は、適切な暴露方法から胚処理およびエタノール分析へのヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いてゼブラフィッシュ胚のエタノールレベルを定量化するプロトコルを記述する。

ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いたゼブラフィッシュ胚におけるエタノール濃度の定量

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚の開発におけるエタノールの薬物動態を理解するのに役立ち、ゼブラフィッシュ研究におけるエタノール暴露体制の標準化に役立つため、重要である。私たちの技術の主な利点は、特に血液供給が利用できない胚において、研究者が胚発生中にエタノールレベルを迅速かつ再現的に測定できることです。この方法は、他のモデルシステムだけでなく、適切な技術や機器のセットアップを前提とした他の環境要因に簡単に適用することができます。私は、このプロトコルを初めて実行する個人が、胚処理中のエタノール蒸発を防ぐために必要な速度に苦労することを期待します。余分な胚液を含む10個の胚を1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移し、250マイクロリットルの体積でラインでマークします。塗りつぶしラインに水を追加します。デコリオネートサンプル用の追加のマイクロ遠心分離管を準備します。絨毛を取り除くために、胚培地中のプロテアーゼカクテル1ミリリットル当たり2ミリグラムのペトリ皿に100ミリメートルのペトリ皿で胚を10分間インキュベートする。数分間おきに皿をそっと渦巻いてチョリオンを壊します。すべての胚が絨毛を含まないと、プロテアーゼカクテルから取り出し、新鮮な培地で2回洗います。その後、胚を新鮮な100ミリメートル皿に移します。すべてのサンプルが体積測定の準備ができたら、可能な限り小さい先端を持つP200マイクロピペットを使用して、胚の周りからすべての液体を慎重に取り除きます。精度が0.1ミリグラム未満のスケールで水の重量を量り、250マイクロリットルから除去された水の重量を差し引くことによって10個の胚の体積を決定する。単一胚の体積を決定するには、その差を10で割る。交配タンクから胚を収集し、標準的な100ミリメートルペトリ皿に入れ、28.5度で皿をインキュベートします。受精後6時間で、胚培地と1%エタノールまたは培地だけで最大100個の胚を新しい皿に移す。ペトリ皿を覆うが、18時間、または受精後24時間に達するまで28.5度のインキュベーターに入れる。50マイクロリットルにセットされた2つのP200マイクロピペットを使用し、プロテアーゼカクテル溶液を1つに吸引し、2番目の水に吸引します。その後、ガラスピペットを使用して1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に10個の胚を素早く入れ、キャップを閉じます。試験対象のすべてのサンプル、コントロールおよびエタノール処理胚に対してこのプロセスを繰り返します。一度に1つのサンプルで作業し、キャップを素早く開き、P200マイクロピペットを200マイクロリットルに設定して残っている胚培地をすべて吸引します。50マイクロリットルの水を素早く静かに加えて取り除き、50マイクロリットルのプロテアーゼカクテルを加え、チューブキャップを閉めます。サンプルを室温で10分間座らせ、450マイクロリットルの塩化ナトリウムモル5個を素早く加え、チューブキャップを閉めます。10分間の渦で試料を均質化し、2マイクロリットルの上清をガスクロマトグラフィーバイアルに移します。バイアルをポリテトラフルオロエチレンキャップで密封します。起動方法を完了した後、436の現在のSPMEエタノールを2〜5分間のRG実行をロードします。サンプルリストの各サンプルの分析ソフトウェアのメソッドメニューからメス。空気、水、および5モル塩化ナトリウムプロテアーゼカクテルブランクから始まるサンプルリストを記入してください。その後、0.3125から40ミリモルの順にエタノール標準を入力します。ブランクの第2ラウンドで標準に従ってください。最も低いエタノール濃度から最も高い予測エタノール濃度までテストされる全ての均質化胚上清サンプルを入力し、第3ラウンドのブランクに入ることによって終了する。サンプルが入力された順序でオートサンプラーにガスクロマトグラフィーバイアルを追加し、10〜15分間温めます。次に、ソフトウェアを使用してサンプル実行を開始します。すべての実行が完了したら、サンプル リストに最終サンプルを追加し、standby.meth を実行して、シャットダウン方法をアクティブにします。サンプル実行中に取得したすべてのデータをバックアップします。シャットダウン方法が完了したら、クロマトグラムを開いてクリックし、結果を含むフォルダを開きます。サンプルは自動的にこのプログラムに統合されます。結果では、正しいピークが統合されていることを確認します。すべてのサンプルが確認されたら、結果を印刷またはエクスポートします。エタノール標準のピーク高さをグラフにプロットし、傾斜、y-切片、r の二乗値を計算します。標準の y-切片からサンプルのピーク高さを減算し、この値を標準の傾きで割ることにより、各サンプルのエタノール値を得る。胚中のエタノール濃度を計算するには、各サンプルの希釈係数を計算し、この希釈係数でサンプルエタノール値を乗算します。最後に、メディアエタノール値に希釈係数10を掛けることで、媒体参照サンプルを計算します。胚エタノール濃度を適切に計算するために、その絨毛膜中およびそれらの絨毛から除去された胚の体積を測定した。この分析では、胚は絨毛膜内の総体積の56%を占めた。以前に発表された研究に基づいて、73.6%が提示されたすべての分析の胚性水分含有量として使用されました。その結果、1.1マイクロリットルの胚体積の0.82マイクロリットルを含む水が得られた。総水量のうち、49%が胚に含まれ、51%が胚外液中である。ガスクロマトグラフィー解析では、15個のサンプルと、それらが処理された培地の2つのグループを、1群につき5回測定して分析した。培地エタノールレベルは、グループ1に対して143.6ミリモル、グループ2に対して133.6ミリモルであった。胚のエタノール濃度は、グループ1と2の平均63.5ミリモルと53.1ミリモルであった。各試料に対するエタノールの培地レベルに対する胚エタノール濃度の比率を算出した。グループ1は培地エタノールレベルの44%を有し、グループは培地エタノールレベルの40%を有していた。未処理の対照胚を、ゼロミリモル培地エタノール濃度で測定した。この手順を試みる際に覚えておくべきことは、エタノールが揮発性であり、すぐに蒸発するので、GC分析のために胚を適切に処理することが重要であるということです。このステップを実行する最善の方法が記載されています, それは適切な筋肉のメモリを開発するために実践する必要があります.この手順は、ゼブラフィッシュのエタノール処理体制を標準化し、将来の研究がエタンの催奇性の遺伝的および細胞的メカニズムを解剖することを可能にする。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

前駆細胞が媒介する肝細胞の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおけるエタノール誘発性線維症肝臓モデルの開発

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

ガスクロマトグラフィー-質量分析法 (GC/MS) のためのショウジョウバエ幼虫サンプル準備-メタボロミクスをベース

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...