Name: quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

Forskningen som presenteres i denne artikkelen ble støttet av tidligere tilskudd fra National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 til J.K.E. og National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 til C.B.L. og ved dagens tilskudd fra National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 til C.B.L. Vi takker Rueben Gonzales for å gi og bistå med gasskromatografanalyse. Vi takker Tiahna Ontiveros og Dr. Gina Nobles skrive hjelp.

Alle sebrafiskembryoer som ble brukt i denne prosedyren ble hevet og avlet etter etablerte IACUC-protokoller27. Disse protokollene ble godkjent av University of Texas i Austin og University of Louisville.
MERK: Sebrafisklinjen Tg(fli1:EGFP)y1 ble brukt i denne studien28. Alt vann som brukes i denne prosedyren er sterilt omvendt osmose vann. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av Graphpad Prism v8.2.1.
<p class...

<ol>
	<li>Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+alcohol+syndrome:+a+prospective+national+surveillance+study.">Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study.</a> Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).</li><li>Cudd, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+systems+for+the+study+of+alcohol+teratology.">Animal model systems for the study of alcohol teratology.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).</li><li>Williams, J. F., Smith, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committee+on+Substance+Abuse.+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders.">Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders.</a> Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).</li><li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors.">A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).</li><li>Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+(PAE):+insights+into+FASD+using+mouse+models+of+PAE.">Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).</li><li>Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+Alcohol+Consumption:+Studies+with+Mutant+Mice.">Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice.</a> International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).</li><li>Marquardt, K., Brigman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+prenatal+alcohol+exposure+on+social,+cognitive+and+affective+behavioral+domains:+Insights+from+rodent+models.">The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models.</a> Alcohol. 51, 1-15 (2016).</li><li>Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+of+alcohol-induced+craniofacial+dysmorphism.">Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).</li><li>Lipinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+face-brain+dysmorphology+patterns+are+correlative+and+exposure-stage+dependent.">Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent.</a> PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Parnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders.">The genetics of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).</li><li>Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratogenic+actions+of+ethanol+in+the+mouse:+a+minireview.">Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview.</a> Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).</li><li>Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+rescues+cranial+neural+crest+from+cell+death+induced+by+ethanol+exposure.">Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).</li><li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure.">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).</li><li>Hong, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdon+mutation+and+fetal+ethanol+exposure+synergize+to+produce+midline+signaling+defects+and+holoprosencephaly+spectrum+disorders+in+mice.">Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice.</a> PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).</li><li>Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+ethanol+exposure+activates+protein+kinase+A+and+impairs+Shh+expression+in+prechordal+mesendoderm+cells+in+the+pathogenesis+of+holoprosencephaly.">Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).</li><li>Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+inhibition+of+retinoic+acid+synthesis+as+a+potential+mechanism+for+fetal+alcohol+syndrome.">Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome.</a> The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).</li><li>Wentzel, P., Eriksson, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+fetal+dysmorphogenesis+in+the+mouse+is+diminished+by+high+antioxidative+capacity+of+the+mother.">Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother.</a> Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).</li><li>Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+absence+of+nNOS+worsens+fetal+alcohol+effects+in+mice.+II:+microencephaly+and+neuronal+losses.">Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).</li><li>Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+genetics+in+fetal+alcohol+effects:+null+mutation+of+the+nNOS+gene+worsens+alcohol-induced+cerebellar+neuronal+losses+and+behavioral+deficits.">Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits.</a> Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).</li><li>Bonthius, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+(nNOS)+worsens+alcohol-induced+microencephaly+and+neuronal+loss+in+developing+mice.">Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice.</a> Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).</li><li>Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fancd2+counteracts+the+toxic+effects+of+naturally+produced+aldehydes+in+mice.">Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice.</a> Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).</li><li>Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders:+Zebrafish+as+a+Model+for+Ethanol+Teratogenesis.">Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis.</a> Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).</li><li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis:+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder.">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).</li><li>Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+age+strengthens+barriers+to+ethanol+accumulation+in+zebrafish.">Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish.</a> Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).</li><li>Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol's+molecular+targets.">Ethanol's molecular targets.</a> Science Signaling. 1 (28), (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Distribution+and+permeability+of+zebrafish+embryos,+Brachydanio+rerio.">Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio.</a> Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).</li><li>Lippi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alcohol+used+for+cleansing+the+venipuncture+site+does+not+jeopardize+blood+and+plasma+alcohol+measurement+with+head-space+gas+chromatography+and+an+enzymatic+assay.">The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay.</a> Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).</li><li>Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+concentration+in+56+refillable+electronic+cigarettes+liquid+formulations+determined+by+headspace+gas+chromatography+with+flame+ionization+detector+(HS-GC-FID).">Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).</li><li>Heit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Neural+Ethanol+and+Acetaldehyde+Using+Headspace+GC-MS.">Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).</li><li>Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Validation+of+a+Method+for+Alcohol+Analysis+in+Brain+Tissue+by+Headspace+Gas+Chromatography+with+Flame+Ionization+Detector.">Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector.</a> Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).</li><li>Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+methanol,+acetaldehyde,+acetone,+and+ethanol+in+human+blood+by+gas+chromatography+with+flame+ionization+detection.">Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection.</a> Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).</li><li>Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdialysis+of+ethanol+during+operant+ethanol+self-administration+and+ethanol+determination+by+gas+chromatography.">Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).</li><li>Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+ethanol+kinetics+in+rat+brain.">In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).</li><li>Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+ethanol+concentrations+and+ethanol+discrimination+in+rats:+effects+of+dose+and+time.">Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time.</a> Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).</li><li>Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily-conserved+mechanism+of+calcium-dependent+neurotoxicity.">An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).</li><li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish.">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).</li><li>Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+and+hindbrain+development+in+zebrafish+is+sensitive+to+ethanol+exposure+involving+agrin,+Fgf,+and+sonic+hedgehog+function.">Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).</li></ol>

Som et utviklingsmodellsystem er sebrafisk ideelt egnet til å studere virkningen av miljøfaktorer på utvikling. De produserer et stort antall eksternt befruktede embryoer, noe som gir presis timing og doseringparadigmer i etanolstudier. Dette, kombinert med live imaging evner og genetisk og utviklingsmessig bevaring med mennesker, gjør sebrafisk et kraftig modellsystem for teratologi studier. Beskrevet er en protokoll for måling av embryonale etanolkonsentrasjoner i utviklingen av sebrafiskembryoer ved hjelp av hode...

Føtal alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) beskriver et bredt spekter av nevrologiske funksjonsnedsettelser og kraniofaciale dysmorfologier forbundet med embryonisk etanoleksponering1. Flere faktorer, inkludert timing og dosering av etanoleksponering og genetisk bakgrunn, bidrar til variasjonen av FASD2,3. Hos mennesker gjør det komplekse forholdet mellom disse variablene å studere og forstå etiologien til FASD utfordrende. Dyremodeller har vist seg avgjørende for å utvikle vår forståelse av det mekanistiske grunnlaget for etanolteratogenisitet. Et bredt utvalg av dyremodellsystemer har blitt brukt til å studere flere aspekter av FASD, og resultatene har vært bemerkelsesverdig konsistente med det som finnes i eksponering hos mennesker4. Gnagermodellsystemer brukes til å undersøke mange aspekter av FASD, med mus som den vanligste5,6,7. Mesteparten av dette arbeidet har fokusert på utviklingsdefekter til tidlig etanoleksponering8, men senere eksponering for etanol har vist seg å forårsake utviklingsavvik også9. Videre har de genetiske egenskapene til mus i stor grad hjulpet i vår evne til å undersøke de genetiske fundamentene til FASD10,11. Disse studiene hos mus tyder sterkt på at det er gen-etanol interaksjoner med sonic pinnsvin banen, retinsyre signalering, Superoxide dismutase, Nitrogenoksid synthase I, Aldh2 og Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Disse studiene viser at dyremodeller er avgjørende for å fremme vår forståelse av FASD og dens underliggende mekanismer.
Sebrafisken har dukket opp som et kraftig modellsystem for å undersøke mange aspekter av etanol teratogenese22,23. På grunn av deres eksterne befruktning, høy fecundity, genetisk tractability, og levende bildebehandling evner, sebrafisk er ideelt egnet til å studere faktorer som timing, dosering, og genetikk av etanol teratogenese. Etanol kan administreres til nøyaktig iscenesatte embryoer, og embryoene kan deretter avbildet for å undersøke den direkte virkningen av etanol under utviklingsprosesser. Dette arbeidet kan være relatert direkte til mennesker, fordi de genetiske utviklingsprogrammene er høyt bevart mellom sebrafisk og mennesker og kan derfor bidra til å veilede FASD menneskelige studier24. Mens sebrafisk har blitt brukt til å undersøke etanol teratogenese, gjør mangel på konsensus i rapportering av embryonale etanolkonsentrasjoner sammenligning med mennesker vanskelig25. I pattedyrsystemer korrelerer blod-alkoholnivåer direkte med vevsetanolnivåer26. Mange av sebrafiskstudiene behandler embryoer før fullstendig dannelse av sirkulasjonssystemet. Uten maternal prøve å undersøke, er det nødvendig med en prosess for å vurdere etanolkonsentrasjoner for å kvantifisere etanolnivåer i embryoet. Her beskriver vi en prosess for å kvantifisere etanolkonsentrasjoner i et utviklende sebrafiskembryo ved hjelp av hodeplassgasskromatografi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoSampler, CP-8400</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Gas Chromatograph Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>8010-0198</td>
			<td>Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Chromatograph, CP-3800</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Innowax capillary column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19095N-123I</td>
			<td>30 m x 0.53 mm x 1.0 &#956;m film thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyrdogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-7021</td>
			<td>Replacement caps/septa for gas chromatograph vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads .5 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079105z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads 1.0 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>57343-U</td>
			<td>Replacement fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Star Chromatography Workstation</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>23154</td>
			<td>Replacement inlet septa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography

Føtal alkoholspektrumforstyrrelser (FASD) beskriver et svært variabelt kontinuum av etanolinduserte utviklingsdefekter, inkludert ansiktsdysmorfologier og nevrologiske funksjonsnedsettelser. Med en kompleks patologi påvirker FASD ca. 1 av 100 barn født i USA hvert år. På grunn av FASDs svært variable natur har dyremodeller vist seg å være kritiske i vår nåværende mekanistiske forståelse av etanolinduserte utviklingsdefekter. Et økende antall laboratorier har fokusert på å bruke sebrafisk for å undersøke etanolinduserte utviklingsdefekter. Sebrafisk produserer et stort antall eksternt befruktede, genetisk tractable, gjennomsiktige embryoer. Dette gjør det mulig for forskere å nøyaktig kontrollere timing og dosering av etanoleksponering i flere genetiske sammenhenger og kvantifisere virkningen av embryonisk etanoleksponering gjennom levende bildeteknikker. Dette, kombinert med den høye graden av bevaring av både genetikk og utvikling med mennesker, har vist sebrafisk å være en kraftig modell for å studere mekanistisk grunnlag av etanol teratogenitet. Etanoleksponeringsregimer har imidlertid variert mellom ulike sebrafiskstudier, som har forvirret tolkningen av sebrafiskdata på tvers av disse studiene. Her er en protokoll for å kvantifisere etanolkonsentrasjoner i sebrafiskembryoer ved hjelp av hodeplassgasskromatografi.

Blodetanolnivåer kan ikke bestemmes i tidlig embryonale sebrafisk, fordi de mangler et fullt dannet sirkulasjonssystem. For å bestemme nivået av etanolkonsentrasjon i sebrafiskembryoene, måles etanolnivåene direkte fra homogenisert embryonalvev. For å måle de embryonale etanolkonsentrasjonene må det embryonale volumet tas i betraktning. Embryoet (eggeplomme festet) sitter inne i chorion (eggeskall) omgitt av ekstraembryonisk væske (Figur 1). Ethvert volummål på embryoet må gjøre...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Dette arbeidet beskriver en protokoll for å kvantifisere etanolnivåer i et sebrafiskembryo ved hjelp av hodeplassgasskromatografi fra riktige eksponeringsmetoder for embryobehandling og etanolanalyse.

Kvantifisering av etanolnivåer i sebrafiskembryoer ved hjelp av hodeplassgasskromatografi

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

Denne protokollen er viktig fordi det bidrar til å forstå farmakokinetikken til etanol i utviklingen av sebrafisk embryoer og dette vil bidra til å standardisere etanol eksponering regimer i sebrafisk studier. Den største fordelen med vår teknikk er at det gjør det mulig for forskere å raskt og reproduserbar måle etanolnivåer under embryonisk utvikling, spesielt i embryoer der blodtilførselen ikke er tilgjengelig. Denne metoden kan enkelt brukes på andre modellsystemer, samt andre miljøfaktorer forutsatt riktig teknikk og utstyr oppsett.Jeg forventer at enkeltpersoner utfører denne protokollen for første gang for å slite med hastigheten som er nødvendig for å forhindre etanolfordampning under embryobehandling. Begynn med å overføre 10 embryoer med ekstra embryonisk væske til 1,5 milliliter mikrocentrifugerør merket med en linje med et volum på 250 mikroliter. Tilsett vann på fylllinjen.Forbered flere mikrocentrifuge rør for deshorionerte prøver. For å fjerne chorion, inkuber embryoene i en 100 millimeter Petriskål med to milligram per milliliter proteasecocktail i embryomedier i 10 minutter. Virvle forsiktig parabolen noen få minutter for å bryte chorion.Når alle embryoene er fri for chorion, fjern dem fra protease cocktail og vask dem to ganger med friske medier. Deretter overfører embryoene til en frisk 100 millimeter tallerken. Når alle prøvene er klare for volummåling, bruk en P200-mikropipette med den minste spissen mulig for å forsiktig fjerne all væske fra rundt embryoene.Vei vannet med en skala med mindre enn 0,1 mg presisjon, og bestem deretter volumet av de 10 embryoene ved å trekke vekten av det fjernede vannet fra 250 mikroliter. For å bestemme volumet av et enkelt embryo, del forskjellen med 10. Samle embryoene fra parringstankene og legg dem i en standard 100 millimeter Petriskål og inkuber parabolen ved 28,5 grader Celsius.På seks timer etter befruktning, overføre opptil 100 embryoer til en ny rett med embryo media og 1% etanol eller media alene. Dekk, men for ikke å forsegle Petri retter og plassere dem i en 28,5 grader Celsius inkubator i 18 timer eller til de når 24 timer etter befruktning. Bruk to P200 mikropipetter satt til 50 mikroliter og aspirer proteasecocktailløsningen i ett og vann inn i den andre.Deretter plasserer du raskt 10 embryoer i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør ved hjelp av en glasspipette og lukk hetten. Gjenta denne prosessen for at alle prøver skal testes, kontroller og etanolbehandlede embryoer. Arbeide med en prøve om gangen, raskt åpne hetten og aspirere alle gjenværende embryomedier med en P200 mikropipette satt til 200 mikroliter.Raskt, men forsiktig legge til og fjerne 50 mikroliter vann, deretter tilsett 50 mikroliter protease cocktail og lukke rørhetten. La prøven sitte i 10 minutter ved romtemperatur og tilsett raskt 450 mikroliter med fem molarnatriumklorid og lukk rørhetten. Homogeniser prøven ved å virvle i 10 minutter og overfør to mikroliter overnatur til et gasskromatografi hetteglass.Forsegle hetteglasset med en polytetrafluoreetyletylhette. Etter å ha fullført oppstartsmetoden, laster du inn 436 gjeldende SPME-etanol to til fem minutters RG-kjøring. meth fra metodemenyen i analyseprogramvaren for hvert utvalg på eksempellisten.Fyll ut prøvelisten som starter med luft, vann og fem molar natriumklorid protease cocktail blanks. Deretter angir du etanolstandarder for fra 0,3125 til 40 millimolar. Følg standardene med den andre runden med blanks.Skriv inn alle homogeniserte embryosupernatante prøver som skal testes fra laveste til høyeste forventede etanolkonsentrasjon og avslutt ved å gå inn i en tredje runde med emner. Tilsett gasskromatografi hetteglassene til autosampleren i den rekkefølgen prøvene ble lagt inn og la dem varme i 10 til 15 minutter. Start deretter prøvekjøringene ved hjelp av programvaren.Når alle kjøringer er fullført, aktiverer du avslutningsmetoden ved å legge til et endelig eksempel i eksempellisten og kjøre standby.meth. Sikkerhetskopier alle data som ble anskaffet under prøvekjøringen. Når avslutningsmetoden er fullført, klikker du på åpent kromatogram og åpner mappen med resultatene.Eksempler integreres automatisk i dette programmet. I resultatene må du kontrollere at de riktige toppene er integrert. Når alle prøvene er bekreftet, skriver du ut eller eksporterer resultatene.Plott topphøyden på etanolstandardene på en graf, og beregn deretter skråningen, y-intercept og r kvadrerte verdier. Få etanolverdien for hver prøve ved å trekke topphøyden på prøven fra y-avskjæringen av standardene og dele denne verdien ved hellingen av standardene. For å beregne etanolkonsentrasjonen i embryoene, beregn fortynningsfaktoren for hver prøve og multiplisere prøven etanolverdien med denne fortynningsfaktoren.Til slutt beregner du mediereferanseprøver ved å multiplisere medieetanolverdien med en fortynningsfaktor på 10. For å beregne embryonale etanolkonsentrasjoner riktig, ble volumene av embryoer både i deres chorion og fjernet fra deres chorion målt. I denne analysen besto embryoet 56% av det totale volumet inne i chorion.Basert på tidligere publisert arbeid ble 73,6 % brukt som embryonalt vanninnhold for alle de presenterte analysene. Dette resulterte i vann bestående av 0,82 mikroliter av de 1,1 mikroliter embryonale volum. Av det totale vannvolumet finnes 49% i embryoet og 51% er i den ekstraembryoniske væsken.For gasskromatografianalysen ble to grupper på 15 prøver og mediene de ble behandlet målt fem ganger per gruppe analysert. Media etanol nivåer var 143,6 millimolar for gruppe en og 133,6 millimolar for gruppe to. Etanolkonsentrasjonen av embryoene var i gjennomsnitt 63,5 millimolar og 53,1 millimolar for henholdsvis grupper 1 og 2.Et forhold mellom embryonisk etanolkonsentrasjon og medienivåer av etanol for hver prøve ble beregnet. Gruppe 1 hadde 44 % av medieetanolnivåene, mens gruppen hadde 40 % av medieetanolnivåene. Ubehandlede kontrollembryoer ble målt ved null millimolar media etanolkonsentrasjon.Det viktigste å huske når du prøver denne prosedyren er at behandling av embryoer for GC-analyse riktig er kritisk som etanol er flyktig og vil fordampe raskt. Den beste måten å utføre dette trinnet er beskrevet, men det må praktiseres for å utvikle riktig muskelminne. Denne prosedyren vil bidra til å standardisere etanolbehandlingsregimer i sebrafisk og tillate fremtidig arbeid å dissekere de genetiske og cellulære mekanismene for etanal teratogenetitet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Måling Protein Stabilitet på Living Sebrafisk embryo med fluoresens Decay Etter Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Mekanisk Vessel Injury i sebrafisk embryo

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyserer<em&gt; I Vivo</em&gt; Cell Migration bruker Cell transplantasjoner og Time-lapse Imaging in Sebrafisk embryo

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering av enkeltceller fra sebrafisk embryo

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Utvikling av en etanol-indusert Fibrotiske Liver Modell i Sebrafisk å studere stamceller-mediert hepatocytter Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potensial i Live Zebrafish Embryoer

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induksjon av hypoksi i levende frosk og sebrafiskembryoer

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering av mobilnettet elektrisk aktivitet i sebrafisk tidlig embryo og svulster

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Utarbeidelse av Drosophila larver prøver for gass kromatografi-massespektrometri (GC-MS)-basert Metabolomics

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...