Name: quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

Исследование, представленное в этой статье, было поддержано предыдущими грантами От Национальных институтов здравоохранения /Национального института стоматологических и краниофациальных исследований (NIH/NIDCR) R01DE020884 j.K.E. и Национальные институты здравоохранения/Национальный институт по злоупотреблению алкоголем и алкоголизмом (NIH/NIAAA) F32AA021320 в C.B.L. и по текущему гранту От Национальных институтов здравоохранения/Национального института по злоупотреблению алкоголем (NIH/NIAAA) R00AA023560 в C.B.L. Мы благодарим Рубена Гонсалеса за предоставление и помощь в анализе хроматографа газа. Мы благодарим Tiahna Ontiveros и д-р Джина Ноблс письменной помощи.

Все эмбрионы зебры, используемые в этой процедуре, были подняты и выведены в соответствии с установленными протоколами IACUC27. Эти протоколы были одобрены Техасским университетом в Остине и Университетом Луисвилла.
ПРИМЕЧАНИЕ: линия зебры Tg (fli1:EGFP)y1 ...

<ol>
	<li>Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+alcohol+syndrome:+a+prospective+national+surveillance+study.">Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study.</a> Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).</li><li>Cudd, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+systems+for+the+study+of+alcohol+teratology.">Animal model systems for the study of alcohol teratology.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).</li><li>Williams, J. F., Smith, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committee+on+Substance+Abuse.+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders.">Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders.</a> Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).</li><li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors.">A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).</li><li>Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+(PAE):+insights+into+FASD+using+mouse+models+of+PAE.">Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).</li><li>Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+Alcohol+Consumption:+Studies+with+Mutant+Mice.">Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice.</a> International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).</li><li>Marquardt, K., Brigman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+prenatal+alcohol+exposure+on+social,+cognitive+and+affective+behavioral+domains:+Insights+from+rodent+models.">The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models.</a> Alcohol. 51, 1-15 (2016).</li><li>Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+of+alcohol-induced+craniofacial+dysmorphism.">Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).</li><li>Lipinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+face-brain+dysmorphology+patterns+are+correlative+and+exposure-stage+dependent.">Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent.</a> PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Parnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders.">The genetics of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).</li><li>Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratogenic+actions+of+ethanol+in+the+mouse:+a+minireview.">Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview.</a> Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).</li><li>Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+rescues+cranial+neural+crest+from+cell+death+induced+by+ethanol+exposure.">Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).</li><li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure.">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).</li><li>Hong, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdon+mutation+and+fetal+ethanol+exposure+synergize+to+produce+midline+signaling+defects+and+holoprosencephaly+spectrum+disorders+in+mice.">Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice.</a> PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).</li><li>Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+ethanol+exposure+activates+protein+kinase+A+and+impairs+Shh+expression+in+prechordal+mesendoderm+cells+in+the+pathogenesis+of+holoprosencephaly.">Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).</li><li>Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+inhibition+of+retinoic+acid+synthesis+as+a+potential+mechanism+for+fetal+alcohol+syndrome.">Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome.</a> The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).</li><li>Wentzel, P., Eriksson, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+fetal+dysmorphogenesis+in+the+mouse+is+diminished+by+high+antioxidative+capacity+of+the+mother.">Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother.</a> Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).</li><li>Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+absence+of+nNOS+worsens+fetal+alcohol+effects+in+mice.+II:+microencephaly+and+neuronal+losses.">Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).</li><li>Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+genetics+in+fetal+alcohol+effects:+null+mutation+of+the+nNOS+gene+worsens+alcohol-induced+cerebellar+neuronal+losses+and+behavioral+deficits.">Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits.</a> Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).</li><li>Bonthius, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+(nNOS)+worsens+alcohol-induced+microencephaly+and+neuronal+loss+in+developing+mice.">Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice.</a> Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).</li><li>Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fancd2+counteracts+the+toxic+effects+of+naturally+produced+aldehydes+in+mice.">Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice.</a> Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).</li><li>Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders:+Zebrafish+as+a+Model+for+Ethanol+Teratogenesis.">Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis.</a> Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).</li><li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis:+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder.">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).</li><li>Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+age+strengthens+barriers+to+ethanol+accumulation+in+zebrafish.">Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish.</a> Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).</li><li>Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol's+molecular+targets.">Ethanol's molecular targets.</a> Science Signaling. 1 (28), (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Distribution+and+permeability+of+zebrafish+embryos,+Brachydanio+rerio.">Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio.</a> Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).</li><li>Lippi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alcohol+used+for+cleansing+the+venipuncture+site+does+not+jeopardize+blood+and+plasma+alcohol+measurement+with+head-space+gas+chromatography+and+an+enzymatic+assay.">The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay.</a> Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).</li><li>Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+concentration+in+56+refillable+electronic+cigarettes+liquid+formulations+determined+by+headspace+gas+chromatography+with+flame+ionization+detector+(HS-GC-FID).">Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).</li><li>Heit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Neural+Ethanol+and+Acetaldehyde+Using+Headspace+GC-MS.">Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).</li><li>Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Validation+of+a+Method+for+Alcohol+Analysis+in+Brain+Tissue+by+Headspace+Gas+Chromatography+with+Flame+Ionization+Detector.">Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector.</a> Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).</li><li>Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+methanol,+acetaldehyde,+acetone,+and+ethanol+in+human+blood+by+gas+chromatography+with+flame+ionization+detection.">Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection.</a> Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).</li><li>Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdialysis+of+ethanol+during+operant+ethanol+self-administration+and+ethanol+determination+by+gas+chromatography.">Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).</li><li>Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+ethanol+kinetics+in+rat+brain.">In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).</li><li>Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+ethanol+concentrations+and+ethanol+discrimination+in+rats:+effects+of+dose+and+time.">Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time.</a> Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).</li><li>Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily-conserved+mechanism+of+calcium-dependent+neurotoxicity.">An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).</li><li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish.">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).</li><li>Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+and+hindbrain+development+in+zebrafish+is+sensitive+to+ethanol+exposure+involving+agrin,+Fgf,+and+sonic+hedgehog+function.">Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).</li></ol>

Как модельная система развития, зебрабы идеально подходят для изучения влияния экологических факторов на развитие. Они производят большое количество внешне оплодотворенных эмбрионов, что позволяет точное время и дозировка парадигмы в исследованиях этанола. Это, в сочетании с живой в?...

Расстройства спектра фетального алкоголя (FASD) описывает широкий спектр неврологических нарушений и черепно-мозговых дисморфологий, связанных с воздействием эмбрионального этанола1. Несколько факторов, в том числе сроки и дозировка воздействия этанола и генетического фона, способствуют изменению FASD2,3. У людей, сложные отношения этих переменных делает изучение и понимание этиологии FASD сложной задачей. Модели животных доказали свою решающее значение в развитии нашего понимания механистической основы этанола тератогенности. Широкий спектр животных модели систем был использован для изучения нескольких аспектов FASD и результаты были удивительно в соответствии с тем, что находится в воздействии на людей4. Системы моделей грызунов используются для изучения многих аспектов FASD, с мышами, наиболее распространенными5,6,7. Большая часть этой работы была сосредоточена на дефектах развития раннего воздействия этанола8, хотя позднее воздействие этанола было показано, что причиной аномалий развития, а9. Кроме того, генетические возможности мышей в значительной степени способствовали нашей способности зондировать генетические основы FASD10,11. Эти исследования на мышах убедительно свидетельствуют о том, что существуют ген-этанол взаимодействия с звуковым пути ежа, ретиноиновая кислота сигнализации, Супероксид дисмутазы, оксида азота синтазы I, Aldh2 и Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Эти исследования показывают, что модели животных имеют решающее значение для продвижения нашего понимания FASD и ее основных механизмов.
Зебрафиш стала мощной модельной системой для изучения многих аспектов этанола тератогенеза22,23. Из-за их внешнего оплодотворения, высокой плодовитости, генетической уступчивости и возможностей живой визуализации, зебра-рыбы идеально подходят для изучения таких факторов, как время, дозировка и генетика этанола тератогенеза. Этанол может быть введен точно поставил эмбрионов и эмбрионы могут быть изображены для изучения прямого воздействия этанола во время процессов развития. Эта работа может быть связана непосредственно с людьми, потому что генетические программы развития очень сохраняются между зебрафиш и людей и поэтому может помочь руководство FASD человеческих исследований24. В то время как зебрафиш были использованы для изучения этанола тератогенеза, отсутствие консенсуса в отчетности эмбриональных концентраций этанола делает сравнение с людьми трудно25. В системах млекопитающих уровень алкоголя в крови напрямую коррелирует с уровнем этанола в тканях26. Многие исследования зебры лечат эмбрионы до полного формирования их кровеносной системы. При отсутствии материнской выборки для изучения, процесс оценки концентрации этанола необходим для количественной оценки уровня этанола в эмбрионе. Здесь мы описываем процесс количественной оценки концентраций этанола в развивающемся эмбрионе зебры с помощью хроматографии головного космического газа.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoSampler, CP-8400</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Gas Chromatograph Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>8010-0198</td>
			<td>Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Chromatograph, CP-3800</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Innowax capillary column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19095N-123I</td>
			<td>30 m x 0.53 mm x 1.0 &#956;m film thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyrdogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-7021</td>
			<td>Replacement caps/septa for gas chromatograph vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads .5 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079105z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads 1.0 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>57343-U</td>
			<td>Replacement fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Star Chromatography Workstation</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>23154</td>
			<td>Replacement inlet septa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography

Расстройства спектра фетального алкоголя (FASD) описывают весьма переменный континуум этинол-индуцированных дефектов развития, включая лицевой дисморфологии и неврологические нарушения. При сложной патологии, FASD затрагивает примерно 1 из 100 детей, родившихся в Соединенных Штатах каждый год. Из-за весьма изменчивого характера FASD, модели животных оказались критически важными в нашем нынешнем механистическом понимании дефектов развития, вызванных этанолом. Все большее число лабораторий сосредоточилось на использовании зебры для изучения дефектов развития, вызванных этанолом. Зебрафиш производит большое количество внешне оплодотворенных, генетически высохлых, полупрозрачных эмбрионов. Это позволяет исследователям точно контролировать сроки и дозировку воздействия этанола в нескольких генетических контекстах и количественно ехать воздействие воздействия эмбрионального этанола с помощью живых методов визуализации. Это, в сочетании с высокой степенью сохранения генетики и развития с людьми, оказалось, зебрафиш, чтобы быть мощной моделью, в которой для изучения механистической основы этанола тератогенности. Тем не менее, режимы воздействия этанола различаются между различными исследованиями зебры, что смущает интерпретацию данных зебры в этих исследованиях. Вот протокол для количественной оценки концентрации этанола в эмбрионах зебры с помощью хроматографии головного космического газа.

Уровень этанола в крови не может быть определен в ранних эмбриональных зебры, потому что они не имеют полностью сформированной кровеносной системы. Для определения уровня концентрации этанола в эмбрионах зебры, уровни этанола измеряются непосредственно из гомогенизированной эмбрион...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Эта работа описывает протокол для количественной оценки уровня этанола в эмбрионе зебры с использованием хроматографии головного космического газа от надлежащих методов воздействия на обработку эмбрионов и анализ этанола.

Количественная оценка уровней этанола в эмбрионах зебрафиш с использованием хроматографии космического газа головы

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

Этот протокол имеет важное значение, поскольку он помогает в понимании фармакокинетики этанола в разработке эмбрионов зебры, и это поможет стандартизировать режимы воздействия этанола в исследованиях зебры. Основным преимуществом нашей техники является то, что она позволяет исследователям быстро и воспроизводимо измерять уровень этанола во время эмбрионального развития, особенно в эмбрионах, где кровоснабжение отсутствует. Этот метод может быть легко применен к другим модельм систем, а также другие факторы окружающей среды при условии надлежащей техники и установки оборудования.Я ожидаю, что люди, выполняющие этот протокол в первый раз бороться со скоростью, необходимой для предотвращения испарения этанола во время обработки эмбрионов. Начните с переноса 10 эмбрионов с дополнительной эмбриональной жидкостью в 1,5 миллилитровые микроцентрифуги, отмеченные линией объемом 250 микролитров. Добавить воду в линию заполнения.Подготовь дополнительные микроцентрифуговые трубки для дехорионированных образцов. Чтобы удалить хорион, инкубировать эмбрионы в 100 миллиметров Петри блюдо с двумя миллиграммами на миллилитр протеазы коктейль в эмбрионе средств массовой информации в течение 10 минут. Аккуратно закружить блюдо каждые несколько минут, чтобы сломать хорион.Как только все эмбрионы будут свободны от хориона, удалите их из коктейля протеазы и дважды вымойте свежими средствами массовой информации. Затем перенесите эмбрионы в свежую 100-миллиметровую тарелку. Когда все образцы будут готовы к измерению объема, используйте микропайпет P200 с самым маленьким наконечником можно тщательно удалить всю жидкость со всего эмбриона.Взвесить воду по шкале с точностью менее 0,1 миллиграмма, а затем определить объем 10 эмбрионов, вычитая вес удалены воды из 250 микролитров. Чтобы определить объем одного эмбриона, разделите разницу на 10. Соберите эмбрионы из брачных резервуаров и поместите их в стандартную 100-миллиметровую чашку Петри, затем инкубировать блюдо при 28,5 градусах по Цельсию.На шесть часов после оплодотворения, передать до 100 эмбрионов в новое блюдо с эмбрионом средств массовой информации и 1%этанола или средств массовой информации в одиночку. Обложка, но не запечатать чашки Петри и поместить их в 28,5 градусов по Цельсию инкубатор в течение 18 часов или до тех пор, пока они достигают 24 часов после оплодотворения. Используйте два микропипта P200, установленных на 50 микролитров, и аспирировать раствор коктейля протеазы в один и воду во второй.Затем быстро поместите 10 эмбрионов в 1,5 миллилитровую микроцентрифугную трубку с помощью стеклянной пипетки и закройте крышку. Повторите этот процесс для всех образцов, которые будут протестированы, контроля и этанола обработанных эмбрионов. Работая с одним образцом за один раз, быстро откройте крышку и аспирировать все остаточные эмбриональные средства с микропипертом P200, установленным на 200 микролитров.Быстро, но осторожно добавить и удалить 50 микролитров воды, затем добавить 50 микролитров коктейля протеазы и закрыть крышку трубки. Пусть образец сидеть в течение 10 минут при комнатной температуре, то быстро добавить 450 микролитров пяти хлорида натрия моляра и закрыть крышку трубки. Гомогенизировать образец путем вихря в течение 10 минут и передачи двух микролитров супернатанта в газовый хроматографический флакон.Печать флакона с полиэтиленовой крышкой. После завершения метода запуска загрузите 436 текущих SPME этанола от двух до пяти минут RG перспективе. метамфетамин из меню методов в программном обеспечении анализа для каждого образца в списке образцов.Заполните список образцов, начиная с воздуха, воды и пяти молярных хлорид натрия протеазы коктейль пробелы. Затем введите стандарты этанола в порядке от 0,3125 до 40 миллимолей. Следуйте стандартам со вторым раундом пробелов.Введите все однородные образцы супернатантов эмбрионов, которые будут протестированы от самой низкой до самой высокой прогнозируемой концентрации этанола и закончить, введя третий раунд пробелов. Добавьте газовые хроматографические флаконы в автосамплер в том порядке, в котором были введены образцы, и дайте им прогреться в течение 10-15 минут. Затем запустите пример работает с помощью программного обеспечения.После завершения всех запусков активируйте метод выключения, добавив окончательный образец в список образцов и вытехав standby.meth. Резервное время всех данных, полученных во время пробного запуска. Как только метод выключения завершен, нажмите на открытую хроматограмму и откройте папку с результатами.Образцы автоматически интегрируются в эту программу. В результатах убедитесь, что правильные пики были интегрированы. После того, как все образцы были подтверждены, распечатать или экспортировать результаты.Участок пиковой высоты стандартов этанола на графике, а затем рассчитать склон, y-перехват, и r квадратных значений. Получить значение этанола для каждого образца путем вычитания пиковой высоты образца из у-перехвата стандартов и деления этого значения на наклон стандартов. Для расчета концентрации этанола в эмбрионах вычислите коэффициент разбавления для каждого образца и умножьте значение образца этанола с помощью этого фактора разбавления.Наконец, вычислите образцы ссылок на средства массовой информации путем умножения значения медиа-этанола на коэффициент разбавления в 10. Для правильного расчета концентрации эмбрионального этанола измерялись объемы эмбрионов как в хорионе, так и при их удалении из хориона. В этом анализе, эмбрион составил 56% от общего объема внутри хориона.На основе ранее опубликованных работ, 73,6% было использовано в качестве эмбрионального содержания воды для всех представленных анализов. В результате вода составила 0,82 микролитера 1,1 микролитров эмбрионального объема. Из общего объема воды 49% содержится в эмбрионе и 51% - во внеэмбрионной жидкости.Для анализа газовой хроматографии были проанализированы две группы из 15 образцов и средства массовой информации, с помощью которых они были обработаны, измеренные пять раз на группу. Уровни медийного этанола были 143,6 миллимоляра для группы 1 и 133,6 миллимолара для группы 2. Концентрации этанола эмбрионов в среднем 63,5 миллимоляра и 53,1 миллимолара для групп один и два соответственно.Было рассчитано соотношение концентрации эмбрионального этанола к медиа-уровням этанола для каждой выборки. В первой группе было 44% уровней медиа-этанола, в то время как у группы было 40% уровней медиа-этанола. Необработанные контрольные эмбрионы измерялись при нулевой концентрации миллимолярского медийного этанола.Самое главное помнить при попытке этой процедуры является то, что обработка эмбрионов для анализа GC правильно имеет решающее значение, как этанол летучих и будет быстро испаряться. Лучший способ выполнить этот шаг описывается, но это должно быть на практике для развития надлежащей мышечной памяти. Эта процедура поможет стандартизировать режимы лечения этанола у зебры и позволит в будущем работать, чтобы вскрыть генетические и клеточные механизмы этанальной тератогенности.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Измерение белка стабильности в жизни у эмбрионов данио рерио с помощью флуоресцентной упадок после фотопреобразования (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Механическая судно Травмы у эмбрионов данио рерио

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Анализ<em&gt; В Vivo</em&gt; Миграция клеток с использованием мобильных трансплантаций и время покадровой визуализации у эмбрионов данио рерио

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Выделение и характеристика отдельных клеток из эмбрионов данио рерио

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Разработка Этанол-индуцированной фиброзных модели печени в данио рерио для изучения прогениторных клеток-гепатоцитов опосредуется Регенерация

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Мембранный потенциал монокристалла монокристалла в живых эмбрионах данио

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Визуализация сотовой электрической активности в Zebrafish ранних эмбрионов и опухоли

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Подготовка дрозофилы личиночной образцов для газовой хроматографии масс-спектрометрии (ГХ МС)-на основе Метаболомика

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...