Name: quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

Den forskning som presenteras i denna artikel stöddes av tidigare bidrag från National Institutes of Health / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 till J.K.E. och National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. and by the current grant from National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Vi tackar Rueben Gonzales för att de tillhandahåller och hjälper till med analys av gaskromatograf. Vi tackar Tiahna Ontiveros och Dr Gina Nobles skriva hjälp.

Alla zebrafiskembryon som användes i detta förfarande höjdes och uppfördes efter etablerade IACUC-protokoll27. Dessa protokoll godkändes av University of Texas i Austin och University of Louisville.
OBS: Zebrafish linjen Tg (fli1:EGFP)y1 användes i denna studie28. Allt vatten som används i detta förfarande är sterilt omvänd osmosvatten. Alla statistiska analyser utfördes med Graphpad Prism v8.2.1.
<p class="jov...

<ol>
	<li>Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+alcohol+syndrome:+a+prospective+national+surveillance+study.">Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study.</a> Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).</li><li>Cudd, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+systems+for+the+study+of+alcohol+teratology.">Animal model systems for the study of alcohol teratology.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).</li><li>Williams, J. F., Smith, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committee+on+Substance+Abuse.+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders.">Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders.</a> Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).</li><li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors.">A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).</li><li>Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+(PAE):+insights+into+FASD+using+mouse+models+of+PAE.">Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).</li><li>Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+Alcohol+Consumption:+Studies+with+Mutant+Mice.">Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice.</a> International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).</li><li>Marquardt, K., Brigman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+prenatal+alcohol+exposure+on+social,+cognitive+and+affective+behavioral+domains:+Insights+from+rodent+models.">The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models.</a> Alcohol. 51, 1-15 (2016).</li><li>Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+of+alcohol-induced+craniofacial+dysmorphism.">Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).</li><li>Lipinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+face-brain+dysmorphology+patterns+are+correlative+and+exposure-stage+dependent.">Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent.</a> PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Parnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders.">The genetics of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).</li><li>Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratogenic+actions+of+ethanol+in+the+mouse:+a+minireview.">Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview.</a> Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).</li><li>Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+rescues+cranial+neural+crest+from+cell+death+induced+by+ethanol+exposure.">Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).</li><li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure.">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).</li><li>Hong, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdon+mutation+and+fetal+ethanol+exposure+synergize+to+produce+midline+signaling+defects+and+holoprosencephaly+spectrum+disorders+in+mice.">Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice.</a> PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).</li><li>Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+ethanol+exposure+activates+protein+kinase+A+and+impairs+Shh+expression+in+prechordal+mesendoderm+cells+in+the+pathogenesis+of+holoprosencephaly.">Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).</li><li>Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+inhibition+of+retinoic+acid+synthesis+as+a+potential+mechanism+for+fetal+alcohol+syndrome.">Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome.</a> The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).</li><li>Wentzel, P., Eriksson, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+fetal+dysmorphogenesis+in+the+mouse+is+diminished+by+high+antioxidative+capacity+of+the+mother.">Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother.</a> Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).</li><li>Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+absence+of+nNOS+worsens+fetal+alcohol+effects+in+mice.+II:+microencephaly+and+neuronal+losses.">Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).</li><li>Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+genetics+in+fetal+alcohol+effects:+null+mutation+of+the+nNOS+gene+worsens+alcohol-induced+cerebellar+neuronal+losses+and+behavioral+deficits.">Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits.</a> Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).</li><li>Bonthius, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+(nNOS)+worsens+alcohol-induced+microencephaly+and+neuronal+loss+in+developing+mice.">Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice.</a> Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).</li><li>Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fancd2+counteracts+the+toxic+effects+of+naturally+produced+aldehydes+in+mice.">Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice.</a> Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).</li><li>Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders:+Zebrafish+as+a+Model+for+Ethanol+Teratogenesis.">Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis.</a> Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).</li><li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis:+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder.">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).</li><li>Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+age+strengthens+barriers+to+ethanol+accumulation+in+zebrafish.">Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish.</a> Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).</li><li>Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol's+molecular+targets.">Ethanol's molecular targets.</a> Science Signaling. 1 (28), (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Distribution+and+permeability+of+zebrafish+embryos,+Brachydanio+rerio.">Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio.</a> Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).</li><li>Lippi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alcohol+used+for+cleansing+the+venipuncture+site+does+not+jeopardize+blood+and+plasma+alcohol+measurement+with+head-space+gas+chromatography+and+an+enzymatic+assay.">The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay.</a> Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).</li><li>Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+concentration+in+56+refillable+electronic+cigarettes+liquid+formulations+determined+by+headspace+gas+chromatography+with+flame+ionization+detector+(HS-GC-FID).">Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).</li><li>Heit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Neural+Ethanol+and+Acetaldehyde+Using+Headspace+GC-MS.">Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).</li><li>Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Validation+of+a+Method+for+Alcohol+Analysis+in+Brain+Tissue+by+Headspace+Gas+Chromatography+with+Flame+Ionization+Detector.">Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector.</a> Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).</li><li>Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+methanol,+acetaldehyde,+acetone,+and+ethanol+in+human+blood+by+gas+chromatography+with+flame+ionization+detection.">Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection.</a> Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).</li><li>Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdialysis+of+ethanol+during+operant+ethanol+self-administration+and+ethanol+determination+by+gas+chromatography.">Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).</li><li>Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+ethanol+kinetics+in+rat+brain.">In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).</li><li>Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+ethanol+concentrations+and+ethanol+discrimination+in+rats:+effects+of+dose+and+time.">Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time.</a> Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).</li><li>Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily-conserved+mechanism+of+calcium-dependent+neurotoxicity.">An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).</li><li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish.">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).</li><li>Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+and+hindbrain+development+in+zebrafish+is+sensitive+to+ethanol+exposure+involving+agrin,+Fgf,+and+sonic+hedgehog+function.">Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).</li></ol>

Som utvecklingsmodellsystem är zebrafisk idealisk för att studera miljöfaktorers inverkan på utvecklingen. De producerar ett stort antal externt befruktade embryon, vilket möjliggör exakt timing och dosering paradigm i etanol studier. Detta, i kombination med levande bildbehandling kapacitet och den genetiska och utvecklingsmässiga bevarande med människor, gör zebrafisk ett kraftfullt modellsystem för teratologi studier. Beskrivs är ett protokoll för att mäta embryonala etanolkoncentrationer för att utveckl...

Fetala alkoholspektrumstörningar (FASD) beskriver ett brett spektrum av neurologiska funktionsnedsättningar och kraniofacial dysmorphologies i samband med embryonal etanol exponering1. Flera faktorer, inklusive timing och dosering av etanolexponering och genetisk bakgrund, bidrar till variationen av FASD2,3. Hos människor gör det komplexa förhållandet mellan dessa variabler att studera och förstå etiologin för FASD utmanande. Djurmodeller har visat sig vara avgörande för att utveckla vår förståelse av den mekanistiska grunden för etanolteratogenicitet. Ett brett utbud av djurmodellsystem har använts för att studera flera aspekter av FASD och resultaten har varit anmärkningsvärt förenliga med vad som finns i exponering hos människor4. Gnagare modellsystem används för att undersöka många aspekter av FASD, med möss är den vanligaste5,6,7. Majoriteten av detta arbete har fokuserat på utvecklingsdefekter till tidig etanolexponering8, men senare exponering för etanol har visat sig orsaka utvecklingsavvikelser samt9. Dessutom har mössens genetiska förmåga i hög grad hjälpt till i vår förmåga att undersöka den genetiska grunden för FASD10,11. Dessa studier på möss tyder starkt på att det finns genetanol interaktioner med sonic igelkott en väg, retinoinsyra signalering, Superoxid dismutase, kväveoxid syntas I, Aldh2 och Fancd28,10,11, 12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Dessa studier visar att djurmodeller är avgörande för att främja vår förståelse av FASD och dess underliggande mekanismer.
Zebrafisken har vuxit fram som ett kraftfullt modellsystem för att undersöka många aspekter av etanol teratogenes22,23. På grund av deras externa befruktning, hög fruktbarhet, genetiska tarmeffekter och levande bildförmåga, zebrafisk är idealiska för studier faktorer såsom timing, dosering, och genetik etanol teratogenes. Etanol kan administreras till exakt iscensatta embryon och embryona kan sedan avbildas för att undersöka etanolens direkta effekter under utvecklingsprocesser. Detta arbete kan relateras direkt till människor, eftersom de genetiska utvecklingsprogrammen är mycket bevarade mellan zebrafiskar och människor och kan därför hjälpa till att vägleda FASD mänskliga studier24. Medan zebrafisk har använts för att undersöka etanol teratogenes, en brist på samförstånd i rapporteringembryonaletanol koncentrationer gör jämförelse med människor svårt25. I däggdjurssystem korrelerar alkoholhalten i blodet direkt till vävnadsetanolnivåer26. Många av zebrafiskstudierna behandlar embryon innan de slutför bildandet av deras cirkulationssystem. Utan ett mödraprov att undersöka krävs en process för att bedöma etanolkoncentrationer för att kvantifiera etanolnivåerna inom embryot. Här beskriver vi en process för att kvantifiera etanolkoncentrationer i ett växande zebrafiskembryo med hjälp av gaskromatografi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoSampler, CP-8400</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Gas Chromatograph Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>8010-0198</td>
			<td>Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Chromatograph, CP-3800</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Innowax capillary column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19095N-123I</td>
			<td>30 m x 0.53 mm x 1.0 &#956;m film thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyrdogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-7021</td>
			<td>Replacement caps/septa for gas chromatograph vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads .5 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079105z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads 1.0 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>57343-U</td>
			<td>Replacement fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Star Chromatography Workstation</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>23154</td>
			<td>Replacement inlet septa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography

Fetala alkoholspektrumstörningar (FASD) beskriver ett mycket varierande kontinuum av etanolinducerade utvecklingsdefekter, inklusive ansiktsdysmorfoser och neurologiska funktionsnedsättningar. Med en komplex patologi drabbar FASD cirka 1 av 100 barn födda i USA varje år. På grund av fasds mycket varierande karaktär har djurmodeller visat sig vara avgörande i vår nuvarande mekanistiska förståelse av etanolinducerade utvecklingsdefekter. Allt fler laboratorier har fokuserat på att använda zebrafisk för att undersöka etanolinducerade utvecklingsdefekter. Zebrafisk producerar ett stort antal externt befruktade, genetiskt ursåtbara, genomskinliga embryon. Detta gör det möjligt för forskare att exakt kontrollera timing och dosering av etanol exponering i flera genetiska sammanhang och kvantifiera effekterna av embryonal etanol exponering genom levande bildframställning tekniker. Detta, i kombination med den höga graden av bevarande av både genetik och utveckling med människor, har visat zebrafisk vara en kraftfull modell för att studera den mekanistiska grunden för etanol teratogenicitet. Etanolexponeringsregimer har dock varierat mellan olika zebrafiskstudier, som har förvirrat tolkningen av zebrafiskdata i dessa studier. Här är ett protokoll för att kvantifiera etanol koncentrationer i zebrafisk embryon med hjälp av huvudet utrymme gaskromatografi.

Blodetanolnivåer kan inte bestämmas i tidiga embryonala zebrafiskar, eftersom de saknar ett fullt bildat cirkulationssystem. För att bestämma nivån av etanolkoncentration i zebrafiskembryona mäts etanolnivåerna direkt från homogeniserad embryonal vävnad. För att på ett korrekt sätt mäta embryonala etanolkoncentrationer måste hänsyn tas till embryonala volymer. Embryot (äggula fäst) sitter inuti chorion (äggskal) omgiven av extraembryonic vätska(figur 1). Varje volymmått a...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Detta arbete beskriver ett protokoll för att kvantifiera etanolnivåer i ett zebrafiskembryo med hjälp av gaskromatografi för huvudutrymmen från lämpliga exponeringsmetoder för embryobearbetning och etanolanalys.

Kvantifiering av etanolnivåer i zebrafiskembryon med hjälp av kromator

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

Detta protokoll är viktigt eftersom det hjälper till att förstå farmakokinetiken hos etanol i utvecklingen av zebrafisk embryon och detta kommer att bidra till att standardisera etanol exponering regimer i zebrafish studier. Den största fördelen med vår teknik är att det gör det möjligt för forskare att snabbt och reproducera etanolnivåer under embryonal utveckling, särskilt i embryon där blodtillförsel inte är tillgänglig. Denna metod kan enkelt tillämpas på andra modellsystem samt andra miljöfaktorer antar korrekt teknik och utrustning setup.Jag förväntar mig individer som utför detta protokoll för första gången att kämpa med den hastighet som krävs för att förhindra etanol avdunstning under embryo bearbetning. Börja med att överföra 10 embryon med extra embryonal vätska till 1,5 milliliter mikrocentrifugrör markerade med en linje vid en volym av 250 mikroliter. Tillsätt vatten till fyllningslinjen.Förbered ytterligare mikrocentrifugrör för dechorionerade prover. För att ta bort chorion, ruva embryon i en 100 millimeter Petri skålen med två milligram per milliliter proteas cocktail i embryomedia i 10 minuter. Snurra försiktigt skålen med några minuters mellanrum för att bryta chorion.När alla embryon är fria från chorion, ta bort dem från proteas cocktail och tvätta dem två gånger med färska medier. Överför sedan embryona till en färsk 100 millimeters maträtt. När alla prover är klara för volymmätning, använd en P200-mikropipette med minsta möjliga spets för att försiktigt avlägsna all vätska från runt embryona.Väg vattnet med en skala med mindre än 0,1 milligram precision, sedan bestämma volymen av de 10 embryon genom att subtrahera vikten av det borttagna vattnet från 250 mikroliter. För att bestämma volymen av ett enskilt embryo, dividera skillnaden med 10. Samla embryon från parningstankar och placera dem i en standard 100 millimeter Petriskål sedan inkubera skålen på 28,5 grader Celsius.Vid sex timmar efter befruktning, överföra upp till 100 embryon till en ny maträtt med embryo media och 1%etanol eller media ensam. Täck men att inte försegla Petri-diskarna och placera dem i en 28,5 grader Celsius inkubator i 18 timmar eller tills de når 24 timmar efter befruktningen. Använd två P200-mikropipetter ställda på 50 mikroliter och aspirera proteascocktaillösningen i en och vattna i den andra.Placera sedan snabbt 10 embryon i ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör med hjälp av en glaspipett och stäng locket. Upprepa denna process för alla prover som ska testas, kontroller och etanolbehandlade embryon. Arbeta med ett prov i taget, snabbt öppna locket och aspirera alla kvarvarande embryo media med en P200 mikropipette inställd på 200 mikroliter.Snabbt men försiktigt lägga till och ta bort 50 mikroliter vatten, tillsätt sedan 50 mikroliter av proteas cocktail och stäng röret locket. Låt provet sitta i 10 minuter i rumstemperatur och tillsätt sedan snabbt 450 mikroliter av fem molarnatriumklorid och stäng rörlocket. Homogenisera provet genom att vortexa i 10 minuter och överför två mikroliter av supernatant till en gaskromatografiflaska.Täta injektionsflaskan med ett polytetrafluoretylenlock. Efter att ha slutfört startmetoden, ladda 436 nuvarande SPME etanol två till fem minuters RG kör. meth från methods-menyn i analysmjukvaran för varje prov på exempellistan.Fyll i provlistan som börjar med luft, vatten och fem molar natriumkloridproteascocktails. För sedan in i etanol standarderna i ordning från 0,3125 till 40 millimolar. Följ standarderna med den andra omgången av blankor.Ange alla homogeniserade embryo supernatant prover som ska testas från lägsta till högsta förutspådde etanol koncentration och avsluta genom att ange en tredje omgång av ämnen. Tillsätt gaskromatografi injektionsflaskan i autosampler i den ordning som proverna matades in och låt dem värma i 10 till 15 minuter. Starta sedan provet körs med hjälp av programvaran.När alla körningar har slutförts aktiverar du avstängningsmetoden genom att lägga till ett slutligt prov i exempellistan och kör standby.meth. Säkerhetskopiera alla data som har förvärvats under provkörningen. När avstängningsmetoden är klar, klicka på öppna kromatogram och öppna mappen med resultaten.Prover integreras automatiskt i det här programmet. I resultaten, se till att rätt toppar har integrerats. När alla prover har bekräftats skriver du ut eller exporterar resultaten.Rita topphöjden för etanolstandarderna på ett diagram, beräkna sedan lutningen, y-intercept, och r squared värden. Få etanolvärdet för varje prov genom att subtrahera provets topphöjd från y-intercept av normerna och dividera detta värde med standardernas lutning. För att beräkna etanolkoncentrationen i embryona beräknar du spädningsfaktorn för varje prov och multiplicerar provetanolvärdet med denna utspädningsfaktor.Beräkna slutligen referensprover för media genom att multiplicera medieetanolvärdet med en utspädningsfaktor på 10. För att korrekt beräkna de embryonala etanolkoncentrationerna mättes volymerna av embryon både i deras chorion och avlägsnades från deras chorion. I denna analys bestod embryot 56%av den totala volymen inuti chorion.Baserat på tidigare publicerade arbeten användes 73,6 %som den embryonala vattenhalten för alla de presenterade analyserna. Detta resulterade i vatten som omfattade 0,82 mikroliter av 1,1 mikroliter av embryonal volym. Av den totala vattenvolymen finns 49%i embryot och 51% är i den extraembryoniska vätskan.För analysen av gaskromatografi analyserades två grupper om 15 prover och de media som de behandlades mätt med fem gånger per grupp. Media etanol nivåer var 143,6 millimolar för grupp ett och 133,6 millimolar för grupp två. Embryonas etanolkoncentrationer var i genomsnitt 63,5 millimolar och 53,1 millimolar för grupp ett respektive två.Ett förhållande mellan embryonal etanolkoncentration och medienivåer av etanol för varje prov beräknades. Grupp ett hade 44% av media etanol nivåer medan gruppen hade 40% av media etanol nivåer. Obehandlad kontroll embryon mättes vid noll millimolar media etanol koncentration.Det viktigaste att komma ihåg när man försöker detta förfarande är att bearbetning av embryon för GC analys ordentligt är kritisk som etanol är flyktiga och kommer att avdunsta snabbt. Det bästa sättet att utföra detta steg beskrivs, men det måste praktiseras för att utveckla korrekt muskelminne. Detta förfarande kommer att bidra till att standardisera etanol behandling regimer i zebrafisk och tillåta framtida arbete att dissekera de genetiska och cellulära mekanismerna för etanol teratogenitet.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mätning Protein Stabilitet i Living Zebrafish embryon Använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Mekanisk Vessel Skada i zebrafiskembryon

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

analysera<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Migration använder Cell Transplantationer och Time-lapse avbildning i Zebrafish embryon

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering och karakterisering av enskilda celler från zebrafiskembryon

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Utveckling av en etanol-inducerad Fibrotisk Lever modell i Zebrafish att studera stamceller-medierad Hepatocyte Regeneration

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potential i Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion av hypoxi i levande groda och zebrafiskembryon

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering av cellulära elektrisk aktivitet i zebrafiskar tidiga embryon och tumörer

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Beredning av Drosophila Larval prover för gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS)-baserad metabolomik

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...