Name: quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography
Uploaded: 2020-02-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

Bu makalede sunulan araştırma, Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Diş ve Kraniyofasiyal Araştırma Enstitüsü (NIH/NIDCR) R01DE020884'ten J.K.E.'ye daha önce verilen hibelerle desteklenmiştir. ve Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Alkol Bağımlılığı ve Alkolizm Enstitüsü (NIH/NIAAA) F32AA021320'den C.B.L.'ye ve Ulusal Sağlık Enstitüleri/Ulusal Alkol Bağımlılığı Enstitüsü'nden (NIH/NIAAA) R00AA023560'dan C.B.L'ye verilen hibe. Rueben Gonzales'e gaz kromatograf analizini sağladığı ve yardımcı olduğu için teşekkür ederiz. Tiahna Ontiveros ve Dr. Gina Nobles'a yardım da çok teşekkür ederiz.

Bu işlemde kullanılan tüm zebra balığı embriyoları, kurulan IACUC protokolleri27'yegöre yükseltildi ve yetiştirildi. Bu protokoller Austin'deki Texas Üniversitesi ve Louisville Üniversitesi tarafından onaylandı.
NOT: Bu çalışmada zebra balığı hattı Tg(fli1:EGFP)y1 kullanılmıştır28. Bu işlemde kullanılan tüm su steril ters ozmoz suyudur. Tüm istatistiksel analizler Graphpad Prism v8.2.1 kullanılar...

<ol>
	<li>Elliott, E. J., Payne, J., Morris, A., Haan, E., Bower, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+alcohol+syndrome:+a+prospective+national+surveillance+study.">Fetal alcohol syndrome: a prospective national surveillance study.</a> Archive of Diseases in Childhood. 93 (9), 732-737 (2008).</li><li>Cudd, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+model+systems+for+the+study+of+alcohol+teratology.">Animal model systems for the study of alcohol teratology.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 389-393 (2005).</li><li>Williams, J. F., Smith, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Committee+on+Substance+Abuse.+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders.">Committee on Substance Abuse. Fetal Alcohol Spectrum Disorders.</a> Pediatrics. 136 (5), 1395-1406 (2015).</li><li>Patten, A. R., Fontaine, C. J., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+different+animal+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders+and+their+use+in+studying+complex+behaviors.">A comparison of the different animal models of fetal alcohol spectrum disorders and their use in studying complex behaviors.</a> Frontiers in Pediatrics. 2, 93 (2014).</li><li>Petrelli, B., Weinberg, J., Hicks, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+prenatal+alcohol+exposure+(PAE):+insights+into+FASD+using+mouse+models+of+PAE.">Effects of prenatal alcohol exposure (PAE): insights into FASD using mouse models of PAE.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 131-147 (2018).</li><li>Mayfield, J., Arends, M. A., Harris, R. A., Blednov, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+and+Alcohol+Consumption:+Studies+with+Mutant+Mice.">Genes and Alcohol Consumption: Studies with Mutant Mice.</a> International Review Neurobiology. 126, 293-355 (2016).</li><li>Marquardt, K., Brigman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+prenatal+alcohol+exposure+on+social,+cognitive+and+affective+behavioral+domains:+Insights+from+rodent+models.">The impact of prenatal alcohol exposure on social, cognitive and affective behavioral domains: Insights from rodent models.</a> Alcohol. 51, 1-15 (2016).</li><li>Sulik, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+of+alcohol-induced+craniofacial+dysmorphism.">Genesis of alcohol-induced craniofacial dysmorphism.</a> Experimental Biology and Medicine. 230 (6), 366-375 (2005).</li><li>Lipinski, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+face-brain+dysmorphology+patterns+are+correlative+and+exposure-stage+dependent.">Ethanol-induced face-brain dysmorphology patterns are correlative and exposure-stage dependent.</a> PLoS One. 7 (8), 43067 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Parnell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+fetal+alcohol+spectrum+disorders.">The genetics of fetal alcohol spectrum disorders.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (6), 1154-1165 (2016).</li><li>Becker, H. C., Diaz-Granados, J. L., Randall, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Teratogenic+actions+of+ethanol+in+the+mouse:+a+minireview.">Teratogenic actions of ethanol in the mouse: a minireview.</a> Pharmacology, Biochemistry and Behavior. 55 (4), 501-513 (1996).</li><li>Ahlgren, S. C., Thakur, V., Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+rescues+cranial+neural+crest+from+cell+death+induced+by+ethanol+exposure.">Sonic hedgehog rescues cranial neural crest from cell death induced by ethanol exposure.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (16), 10476-10481 (2002).</li><li>Loucks, E. J., Ahlgren, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deciphering+the+role+of+Shh+signaling+in+axial+defects+produced+by+ethanol+exposure.">Deciphering the role of Shh signaling in axial defects produced by ethanol exposure.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 85 (6), 556-567 (2009).</li><li>Hong, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdon+mutation+and+fetal+ethanol+exposure+synergize+to+produce+midline+signaling+defects+and+holoprosencephaly+spectrum+disorders+in+mice.">Cdon mutation and fetal ethanol exposure synergize to produce midline signaling defects and holoprosencephaly spectrum disorders in mice.</a> PLoSGenetics. 8 (10), 1002999 (2012).</li><li>Aoto, K., Shikata, Y., Higashiyama, D., Shiota, K., Motoyama, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+ethanol+exposure+activates+protein+kinase+A+and+impairs+Shh+expression+in+prechordal+mesendoderm+cells+in+the+pathogenesis+of+holoprosencephaly.">Fetal ethanol exposure activates protein kinase A and impairs Shh expression in prechordal mesendoderm cells in the pathogenesis of holoprosencephaly.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 82 (4), 224-231 (2008).</li><li>Deltour, L., Ang, H. L., Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+inhibition+of+retinoic+acid+synthesis+as+a+potential+mechanism+for+fetal+alcohol+syndrome.">Ethanol inhibition of retinoic acid synthesis as a potential mechanism for fetal alcohol syndrome.</a> The FASEB Journal. 10 (9), 1050-1057 (1996).</li><li>Wentzel, P., Eriksson, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-induced+fetal+dysmorphogenesis+in+the+mouse+is+diminished+by+high+antioxidative+capacity+of+the+mother.">Ethanol-induced fetal dysmorphogenesis in the mouse is diminished by high antioxidative capacity of the mother.</a> Toxicological Sciences. 92 (2), 416-422 (2006).</li><li>Karacay, B., Mahoney, J., Plume, J., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+absence+of+nNOS+worsens+fetal+alcohol+effects+in+mice.+II:+microencephaly+and+neuronal+losses.">Genetic absence of nNOS worsens fetal alcohol effects in mice. II: microencephaly and neuronal losses.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 39 (2), 221-231 (2015).</li><li>Bonthius, D. J., Winters, Z., Karacay, B., Bousquet, S. L., Bonthius, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+genetics+in+fetal+alcohol+effects:+null+mutation+of+the+nNOS+gene+worsens+alcohol-induced+cerebellar+neuronal+losses+and+behavioral+deficits.">Importance of genetics in fetal alcohol effects: null mutation of the nNOS gene worsens alcohol-induced cerebellar neuronal losses and behavioral deficits.</a> Neurotoxicology. 46, 60-72 (2015).</li><li>Bonthius, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+neuronal+nitric+oxide+synthase+(nNOS)+worsens+alcohol-induced+microencephaly+and+neuronal+loss+in+developing+mice.">Deficiency of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) worsens alcohol-induced microencephaly and neuronal loss in developing mice.</a> Brain Research. Developmental Brain Research. 138 (1), 45-59 (2002).</li><li>Langevin, F., Crossan, G. P., Rosado, I. V., Arends, M. J., Patel, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fancd2+counteracts+the+toxic+effects+of+naturally+produced+aldehydes+in+mice.">Fancd2 counteracts the toxic effects of naturally produced aldehydes in mice.</a> Nature. 475 (7354), 53-58 (2011).</li><li>Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fishing+for+Fetal+Alcohol+Spectrum+Disorders:+Zebrafish+as+a+Model+for+Ethanol+Teratogenesis.">Fishing for Fetal Alcohol Spectrum Disorders: Zebrafish as a Model for Ethanol Teratogenesis.</a> Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).</li><li>Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diving+into+the+world+of+alcohol+teratogenesis:+a+review+of+zebrafish+models+of+fetal+alcohol+spectrum+disorder.">Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder.</a> Biochemistry and Cell Biology. 96 (2), 88-97 (2018).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140 (15), 3254-3265 (2013).</li><li>Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+age+strengthens+barriers+to+ethanol+accumulation+in+zebrafish.">Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish.</a> Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).</li><li>Harris, R. A., Trudell, J. R., Mihic, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol's+molecular+targets.">Ethanol's molecular targets.</a> Science Signaling. 1 (28), (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book: A guide for the laboratory use of zebrafish Danio (Brachydanio) rerio. , (1993).</li><li>Lawson, N. D., Weinstein, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+embryonic+vascular+development+using+transgenic+zebrafish.">In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish.</a> Developmental Biology. 248 (2), 307-318 (2002).</li><li>Hagedorn, M., Kleinhans, F. W., Artemov, D., Pilatus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+Distribution+and+permeability+of+zebrafish+embryos,+Brachydanio+rerio.">Water Distribution and permeability of zebrafish embryos, Brachydanio rerio.</a> Journal of Experimental Zoology. 278 (6), 356-371 (1997).</li><li>Lippi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+alcohol+used+for+cleansing+the+venipuncture+site+does+not+jeopardize+blood+and+plasma+alcohol+measurement+with+head-space+gas+chromatography+and+an+enzymatic+assay.">The alcohol used for cleansing the venipuncture site does not jeopardize blood and plasma alcohol measurement with head-space gas chromatography and an enzymatic assay.</a> Biochemia Medica. 27 (2), 398-403 (2017).</li><li>Poklis, J. L., Wolf, C. E., Peace, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+concentration+in+56+refillable+electronic+cigarettes+liquid+formulations+determined+by+headspace+gas+chromatography+with+flame+ionization+detector+(HS-GC-FID).">Ethanol concentration in 56 refillable electronic cigarettes liquid formulations determined by headspace gas chromatography with flame ionization detector (HS-GC-FID).</a> Drug Testing and Analysis. 9 (10), 1637-1640 (2017).</li><li>Heit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Neural+Ethanol+and+Acetaldehyde+Using+Headspace+GC-MS.">Quantification of Neural Ethanol and Acetaldehyde Using Headspace GC-MS.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 40 (9), 1825-1831 (2016).</li><li>Chun, H. J., Poklis, J. L., Poklis, A., Wolf, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+Validation+of+a+Method+for+Alcohol+Analysis+in+Brain+Tissue+by+Headspace+Gas+Chromatography+with+Flame+Ionization+Detector.">Development and Validation of a Method for Alcohol Analysis in Brain Tissue by Headspace Gas Chromatography with Flame Ionization Detector.</a> Journal of Analytical Toxicology. 40 (8), 653-658 (2016).</li><li>Schlatter, J., Chiadmi, F., Gandon, V., Chariot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+methanol,+acetaldehyde,+acetone,+and+ethanol+in+human+blood+by+gas+chromatography+with+flame+ionization+detection.">Simultaneous determination of methanol, acetaldehyde, acetone, and ethanol in human blood by gas chromatography with flame ionization detection.</a> Human and Experimental Toxicology. 33 (1), 74-80 (2013).</li><li>Schier, C. J., Mangieri, R. A., Dilly, G. A., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdialysis+of+ethanol+during+operant+ethanol+self-administration+and+ethanol+determination+by+gas+chromatography.">Microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography.</a> Journal of Visualized Experiments. (67), e4142 (2012).</li><li>Adalsteinsson, E., Sullivan, E. V., Mayer, D., Pfefferbaum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+quantification+of+ethanol+kinetics+in+rat+brain.">In vivo quantification of ethanol kinetics in rat brain.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2683-2691 (2006).</li><li>Quertemont, E., Green, H. L., Grant, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+ethanol+concentrations+and+ethanol+discrimination+in+rats:+effects+of+dose+and+time.">Brain ethanol concentrations and ethanol discrimination in rats: effects of dose and time.</a> Psychopharmacology. 168 (3), 262-270 (2003).</li><li>Flentke, G. R., Klinger, R. H., Tanguay, R. L., Carvan, M. J., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evolutionarily-conserved+mechanism+of+calcium-dependent+neurotoxicity.">An evolutionarily-conserved mechanism of calcium-dependent neurotoxicity.</a> Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 38 (5), 1255-1265 (2014).</li><li>Reimers, M. J., Flockton, A. R., Tanguay, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol-+and+acetaldehyde-mediated+developmental+toxicity+in+zebrafish.">Ethanol- and acetaldehyde-mediated developmental toxicity in zebrafish.</a> Neurotoxicology and Teratology. 26 (6), 769-781 (2004).</li><li>Zhang, C., Ojiaku, P., Cole, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forebrain+and+hindbrain+development+in+zebrafish+is+sensitive+to+ethanol+exposure+involving+agrin,+Fgf,+and+sonic+hedgehog+function.">Forebrain and hindbrain development in zebrafish is sensitive to ethanol exposure involving agrin, Fgf, and sonic hedgehog function.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 97 (1), 8-27 (2013).</li></ol>

Gelişimsel bir model sistemi olarak, zebra balıkları çevresel faktörlerin gelişim üzerindeki etkisini incelemek için idealdir. Onlar etanol çalışmalarında kesin zamanlama ve dozaj paradigmaları sağlar dıştan döllenmiş embriyolar, çok sayıda üretmek. Bu, canlı görüntüleme yetenekleri ve insanlar ile genetik ve gelişimsel koruma ile birlikte, zebra balığı teratoloji çalışmaları için güçlü bir model sistemi yapmak. Açıklanan kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı emb...

Fetal Alkol Spektrum Bozuklukları (FASD) nörolojik bozukluklar ve embriyonik etanol maruziyeti ile ilişkili kraniyofasiyal dismorfolojileri geniş bir dizi açıklar1. Birden fazla faktör, zamanlama ve etanol maruziyeti ve genetik arka plan dozajı da dahil olmak üzere, FASD varyasyonkatkıda2,3. İnsanlarda, bu değişkenlerin karmaşık ilişkisi, FASD'nin etyolojisini incelemeyi ve anlamayı zorlaştırır. Hayvan modelleri etanol teratojenite mekanistik temelanlayışımızı geliştirmede önemli olduğunu kanıtlamıştır. Hayvan modeli sistemleri geniş bir yelpazede FASD birden fazla yönünü incelemek için kullanılmıştır ve sonuçlar son derece insanlarda maruz kalma bulunan ne ile tutarlı olmuştur4. Kemirgen model sistemleri FASD birçok yönünü incelemek için kullanılır, fareler en yaygın olan5,6,7. Bu çalışmanın çoğunluğu erken etanol maruziyeti gelişimsel bozukluklar üzerinde duruldu8, daha sonra etanol maruz ilikal anomalilere neden olduğu gösterilmiştir rağmen9. Ayrıca, farelerin genetik yetenekleri büyük ölçüde FASD10,11genetik temelleri araştırmak için yeteneğimizi yardımcı olmuştur. Farelerde bu çalışmalar kuvvetle sonik kirpi yolu ile gen-etanol etkileşimleri olduğunu göstermektedir, retinoik asit sinyalizasyonu, Süperoksit dismutaz, Nitrik oksit synthase I, Aldh2 ve Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21. Bu çalışmalar, hayvan modellerinin FASD ve onun altında yatan mekanizmaları anlamamızı ilerletmek için kritik öneme sahip olduğunu göstermektedir.
Zebra balığı etanol teratogenez22,23birçok yönünü incelemek için güçlü bir model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Dış döllenme, yüksek fecundity, genetik sedatability ve canlı görüntüleme yetenekleri nedeniyle, zebrabalığı ideal zamanlama, dozaj ve etanol teratogenez genetik gibi faktörlerir çalışma için uygundur. Etanol tam olarak sahnelenen embriyolar için uygulanabilir ve embriyolar daha sonra gelişimsel süreçler sırasında etanol doğrudan etkisini incelemek için görüntülenebilir. Bu çalışma doğrudan insanlarla ilgili olabilir, çünkü genetik gelişim programları zebra balığı ve insanlar arasında son derece korunur ve bu nedenle FASD insan çalışmaları24rehberlik yardımcı olabilir. Zebra balığı etanol teratogenezini incelemek için kullanılırken, embriyonik etanol konsantrasyonlarının raporlanmasında konsensüs eksikliği insanlara kıyasla zor25. Memeli sistemlerinde, kan-alkol düzeyleri doku etanol düzeyleri ile doğrudan ilişkilidir26. Zebra balıklarının çoğu, dolaşım sistemleri tam olarak oluşmadan önce embriyoları tedavi eder. İncelemek için hiçbir anne örneği ile, embriyo içinde etanol düzeylerini ölçmek için etanol konsantrasyonlarını değerlendirmek için bir süreç gereklidir. Burada kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak gelişmekte olan bir zebra balığı embriyosundaki etanol konsantrasyonlarını ölçmek için bir süreç anlatıyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Air</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10204-962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoSampler, CP-8400</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Gas Chromatograph Autosampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-590</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Decon Labs</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>8010-0198</td>
			<td>Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Chromatograph, CP-3800</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Helium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HP Innowax capillary column</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>19095N-123I</td>
			<td>30 m x 0.53 mm x 1.0 &#956;m film thick</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyrdogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Provided by contract to the university</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Sulfate (Heptahydrate)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>M63-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube 1.5 mL</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2682002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 10 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 1000 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips 200 &#956;L</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13611112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes 100 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB012924</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p1000L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10006M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p200L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10005M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman L p2L Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>FA10001M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5190-7021</td>
			<td>Replacement caps/septa for gas chromatograph vials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P217-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9266-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97062-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads .5 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079105z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica Beads 1.0 mm</td>
			<td>Biospec Products</td>
			<td>11079110z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9280-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate (Dibasic)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S374-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>57343-U</td>
			<td>Replacement fibers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Star Chromatography Workstation</td>
			<td>Varian</td>
			<td></td>
			<td>Chromatography software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>23154</td>
			<td>Replacement inlet septa</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of ethanol levels in zebrafish embryos using head space gas chromatography

Fetal Alkol Spektrum Bozuklukları (FASD), yüz dismorfolojileri ve nörolojik bozukluklar da dahil olmak üzere etanol kaynaklı gelişimsel defektlerin son derece değişken bir sürekliliğini tanımlar. Karmaşık bir patoloji ile, FASD her yıl Amerika Birleşik Devletleri'nde doğan her 100 çocuktan yaklaşık 1'ini etkiler. FASD'nin son derece değişken doğası nedeniyle, hayvan modelleri etanol kaynaklı gelişim kusurları mevcut mekanistik anlayış kritik kanıtlamıştır. Laboratuvarların giderek artan sayıda etanol kaynaklı gelişimsel kusurları incelemek için zebra balığı kullanarak odaklanmıştır. Zebra balıkları çok sayıda dıştan döllenmiş, genetik olarak çıkarılabilir, yarı saydam embriyo üretirler. Bu araştırmacılar tam olarak zamanlaması ve birden fazla genetik bağlamda etanol maruziyetinin dozajını kontrol etmek ve canlı görüntüleme teknikleri ile embriyonik etanol maruziyetinin etkisini ölçmek için izin verir. Bu, insanlar ile hem genetik ve gelişme koruma yüksek derecede ile birlikte, hangi etanol teratojenite mekanistik temeli çalışma için güçlü bir model olduğu zebra balığı kanıtlamıştır. Ancak, etanol maruziyetrejimleri bu çalışmalar arasında zebra balığı verilerinin yorumlanması şaşırttı farklı zebra balığı çalışmaları arasında farklılık göstermiştir. Burada kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyolarında etanol konsantrasyonları ölçmek için bir protokoldür.

Kan etanol düzeyleri erken embriyonik zebra balıklarında belirlenemez, çünkü tam olarak oluşmuş bir dolaşım sistemi vardır. Zebra balığı embriyolarında etanol konsantrasyonu düzeyini belirlemek için, etanol düzeyleri doğrudan homojenize embriyonik doku dan ölçülür. Düzgün embriyonik etanol konsantrasyonları ölçmek için, embriyonik hacim dikkate alınmalıdır. Embriyo (sarısı ekli) ekstraembriyonik sıvı ile çevrili chorion (yumurta kabuğu) içinde oturur(Şekil 1).<...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography at JoVE.com

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Bu çalışma, uygun maruzkalma yöntemlerinden embriyo işleme ve etanol analizine kadar kafa uzayı gaz kromatografisi kullanarak zebra balığı embriyosundaki etanol düzeylerini ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır.

Kafa Uzayı Gaz Kromatografisi Kullanan ZebraBalığı Embriyolarında Etanol Düzeylerinin Ölçülmesi

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...

Bu protokol, zebra balığı embriyolarının geliştirilmesinde etanolün farmakokinetiğinin anlaşılmasına yardımcı olduğu ve zebra balığı çalışmalarında etanol maruziyeti rejimlerinin standartlaştırılmasına yardımcı olacağı için önemlidir. Tekniğimizin en büyük avantajı, araştırmacıların embriyonik gelişim sırasında, özellikle kan akımının mevcut olmadığı embriyolarda etanol düzeylerini hızla ve tekrarlamayla ölçmelerine olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, diğer model sistemlerine ve uygun teknik ve ekipman kurulumu nun varsayılmasında diğer çevresel faktörlere kolayca uygulanabilir.Bu protokolü ilk kez gerçekleştiren bireylerin embriyo işleme sırasında etanol buharlaşmasını önlemek için gerekli hızile mücadele etmesini beklerdim. 250 mikrolitre lik bir hacimde bir çizgi ile işaretlenmiş 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpler içine ekstra embriyonik sıvı ile 10 embriyo transfer ederek başlayın. Dolgu hattına su ekleyin.Dechorionated numuneler için ek mikrosantrifüj tüpleri hazırlayın. Chorion kaldırmak için, 10 dakika boyunca embriyo medyada proteaz kokteyl mililitre başına iki miligram ile 100 milimetre petri çanak embriyolar kuluçka. Yavaşça chorion kırmak için her birkaç dakikada bir çanak girdap.Bir kez tüm embriyolar chorion ücretsiz, proteaz kokteyl onları kaldırmak ve taze medya ile iki kez yıkayın. Sonra embriyoları 100 milimetrelik yeni bir tabağa aktarın. Tüm numuneler hacim ölçümü için hazır olduğunda, embriyoların etrafındaki tüm sıvıyı dikkatlice çıkarmak için mümkün olan en küçük ucuna sahip bir P200 mikropipet kullanın.Suyu 0,1 miligramdan daha az hassasiyetle tartın, ardından çıkarılan suyun ağırlığını 250 mikrolitreden çıkararak 10 embriyonun hacmini belirleyin. Tek bir embriyonun hacmini belirlemek için farkı 10'a bölün. Embriyoları miyom tanklarında toplayın ve standart 100 milimetrelik Petri kabına yerleştirin ve sonra kabı 28,5 santigrat derecede kuluçkaya yatırın.Döllenmeden altı saat sonra, 100 embriyoya kadar embriyo ve %1'lik etanol veya medya ile yeni bir tabağa transfer edin. Petri kaplarını örtmemek ve 28,5 derecelik bir inkübatöre 18 saat veya döllenme sonrası 24 saat ulaşına kadar yerleştirin. 50 mikrolitreye ayarlanmış iki P200 mikropipeti kullanın ve proteaz kokteyl çözeltisini bir eve, ikincisine de suya aspire edin.Daha sonra cam pipet kullanarak 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne 10 embriyoyu hızlıca yerleştirin ve kapağı kapatın. Tüm örnekler, kontroller ve etanol tedavi embriyolar test edilmesi için bu işlemi tekrarlayın. Bir seferde bir örnekle çalışarak, kapağı hızla açın ve 200 mikrolitreye ayarlanmış bir P200 mikropipeti ile tüm artık embriyo ortamını aspire edin.Hızlı ama yavaşça ekleyin ve su 50 mikrolitre kaldırmak, sonra proteaz kokteyl 50 mikrolitre ekleyin ve tüp kapağıkapatın. Örnek oda sıcaklığında 10 dakika oturup sonra hızlı bir şekilde beş azı lı sodyum klorür 450 mikrolitre ekleyin ve tüp kapağı kapatın. 10 dakika girdap ve bir gaz kromatografi şişesine supernatant iki mikrolitre aktarArak örnek homojenize.Şişeyi politetrafloroetilen kapakla kapatın. Başlatma yöntemini tamamladıktan sonra, 436 geçerli SPME etanol 2-5 dakikalık RG çalıştırın yükleyin. örnek listedeki her örnek için analiz yazılımındaki yöntem menüsünden meth.Hava, su ve beş azı lı sodyum klorür proteaz kokteyl boşlukları ile başlayan örnek listesini doldurun. Daha sonra 0,3125 ile 40 milimolar arasında etanol standartlarına girin. Boşlukların ikinci turuyla standartları uygulayın.En düşükten en yüksek öngörülen etanol konsantrasyonuna kadar test edilecek tüm homojenize embriyo supernatant örneklerini girin ve üçüncü tur boşluklargirerek bitirin. Numunelerin girildiği sırada gaz kromatografi şişelerini otonumuneye ekleyin ve 10 ila 15 dakika ısınmalarını bekleyin. Sonra yazılımı kullanarak örnek çalışır başlatın.Tüm çalıştırmalar tamamlandıktan sonra, örnek listesine son bir örnek ekleyerek ve bekleme.meth çalıştırarak kapatma yöntemini etkinleştirin. Örnek çalışma sırasında elde edilen tüm verileri yedekle. Kapatma yöntemi tamamlandıktan sonra, açık kromatogramı tıklatın ve sonuçları ile klasörü açın.Örnekler otomatik olarak bu programa entegre edilir. Sonuçlarda, doğru zirvelerin tümleşik olduğundan emin olun. Tüm numuneler onaylandıktan sonra sonuçları yazdırın veya dışa aktarın.Bir grafikte etanol standartlarının en yüksek yüksek liğini çizin, ardından eğimi, y-intercept'i ve r kare değerlerini hesaplayın. Her numune için etanol değerini, numunenin en yüksek yüksek liğini standartların y-kesişme noktasından çıkararak ve bu değeri standartların eğimine bölerek elde edin. Embriyolarda etanol konsantrasyonu hesaplamak için, her örnek için seyreltme faktörü hesaplamak ve bu seyreltme faktörü ile örnek etanol değeri çarp.Son olarak, ortam etanol değerini 10'luk bir seyreltme faktörüyle çarparak ortam referans örneklerini hesaplayın. Embriyonik etanol konsantrasyonlarını doğru hesaplamak için, embriyoların hacimleri hem korolarında hem de korrionlarından çıkarıldı. Bu analizde, embriyo chorion içindeki toplam hacmin %56'sını oluşturmıştır.Daha önce yayınlanmış çalışmalara dayanarak, sunulan tüm analizlerde embriyonik su içeriği olarak %73,6'sı kullanılmıştır. Bu, 1,1 mikrolitre embriyonik hacmin 0,82 mikrolitresini içeren su yla sonuçlandı. Toplam su hacminin %49'u embriyoda, %51'i ise ekstraembriyonik sıvıda bulunur.Gaz kromatografisi analizi nde 15 örnekten oluşan iki grup ve tedavi edildikleri ortam grup başına beş kez ölçüldü. Media etanol düzeyleri grup 1 için 143.6 milimolar ve ikinci grup için 133.6 milimolar idi. Embriyoların etanol konsantrasyonları sırasıyla grup bir ve iki için ortalama 63.5 milimolar ve 53.1 milimolar.Embriyonik etanol konsantrasyonunun her bir örnek için ortam etanol düzeylerine oranı hesaplandı. Birinci grup medya etanol düzeylerinin %44'üne, grup ise medya etanol düzeylerinin %40'ına sahipti. Tedavi edilmeyen kontrol embriyoları sıfır milimolar media etanol konsantrasyonu ile ölçüldü.Bu prosedürü çalışırken hatırlanması gereken en önemli şey, etanol uçucu olduğu ve hızlı bir şekilde buharlaşacağı için GC analizi için embriyoların düzgün bir şekilde işlenmesinin kritik öneme sahip olmasıdır. Bu adımı gerçekleştirmek için en iyi yolu açıklanmıştır, ancak uygun kas hafızası geliştirmek için uygulanması gerekir. Bu prosedür zebra balığında etanol tedavi rejimlerinin standartlaştırılmasına yardımcı olacak ve gelecekteki çalışmaların etanal teratojenitenin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemesine olanak sağlayacaktır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Fotoçevrim sonra Floresans Bozunma kullanarak Oturma balığı Embriyolar protein stabilitesi ölçümü (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebra balığı Embriyolar Mekanik Gemi Sakatlık

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Analiz<em&gt; İn Vivo</em&gt; Hücre Göç Zebra balığı Embriyolar hücre nakli ve Time-lapse Görüntüleme kullanılarak

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Development of an Ethanol-induced Fibrotic Liver Model in Zebrafish to Study Progenitor Cell-mediated Hepatocyte Regeneration

Zebra balığı bir Etanol kaynaklı Fibrotik Karaciğer Modelinin Geliştirilmesi progenitör hücre-aracılı Hepatosit Rejenerasyon Eğitim

Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Kurbağa ve Zebra balığı Embriyolarında Hipoksinin İndüklenmesi

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Gaz kromatografi-kütle spektrometresi (GC-MS) Drosophila larva örnekleri hazırlanması-Metabolomics dayalı

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...