Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

我们感谢NICHD显微镜和成像核心的文森特·施拉姆协助共聚焦图像采集，以及张青惠在殖民地管理和小鼠护理方面的宝贵帮助。这项研究得到了国家研究所、NIH、贝塞斯达、医学博士、K.J.S.A.B.的内学研究计划的支持，并得到了国立国家研究所内学研究计划的罗伯特·温特霍尔德博士后奖学金的支持。NIDCD。

动物护理和实验程序按照《实验室动物护理和使用指南》进行，该准则经国家神经疾病和中风研究所动物护理和使用委员会批准（动物协议#1336到KJS）。
1. 老鼠
<ol><li>设置一对C57BL/6J野生型的繁殖对在动物设施中繁殖，以控制幼崽的出生日期，并跟踪幼崽的年龄。</li>
</ol>2. 耳蜗解剖
<ol><li>设置一个靠近立体显微镜的清洁空间以执行解剖（?...

该协议描述了如何在3 kDa dextran德州红的Corti外植植物的鼠器官中执行接受实验。这种方法的目的是测试之前测试的分子是否也能够专门标记听觉毛细胞，并渗透到MET通道。类似的实验方案以前曾用于评估毛细胞与其他荧光染料的渗透性，如FM1-43（0.56 kDa）12、19、20和得克萨斯州红标记的氨糖苷（1.29~1.43 kDa）13、52。<sup c...

内耳毛细胞是检测声音和隐藏电信号机械刺激的感官细胞，最终由我们的大脑解释。这些细胞有一个楼梯形的捆绑三行基于活性蛋白的细丝，称为立体丝，从它们的锥形区域1，2突出。机械刺激使立体丝向最长的行偏转，并触发机械转导（MET）通道3的打开。MET通道的开放导致阳离子的涌入，使细胞去极化，从而在头发细胞的基础区域发出突触囊泡的释放。
MET通道对听力至关重要的生物物理特性得到了广泛的描述。在其他属性中，这些通道是阳离子选择性的，具有相对较大的电导率（低 Ca2+中为 150±300 pS）4、5、6、7、8、9、10 。值得注意的是，大型荧光分子，如FM1-43和得克萨斯红标记氨胶苷是MET通道的渗透阻滞剂，导致其积累在头发细胞体，可以使用荧光显微镜11，12，13，14。相反，MET通道的分子特性和结构及其渗透途径仍然难以捉摸。越来越多的实验证据表明，跨膜样通道蛋白1（TMC1）是成熟毛细胞15、16、17、18、19中MET通道的组成部分。跨膜状通道1（TMC1）中的突变会改变MET通道特性19、20、21、22，并引起耳聋。此外，TMC1还本地化到MET通道18、23的站点，并与负责将机械力传输到MET通道24、25的尖端链路进行交互。此外，最近的生物信息学分析已经发现TMC蛋白是进化相关的对美甲敏感通道TMEM63/OSCA蛋白质和TMEM16蛋白质，钙活性氯化物通道和脂质scramblass26，27，28。基于这些蛋白质之间关系的TMC1结构模型揭示了在蛋白质-脂质界面27处存在一个大腔。该腔包含两个TMC1突变，导致常染色体显性听力损失（DFNA36）27、29、30、31、32，以及选择性地修饰半胱氨酸突变体，使其在腔内残留物改变MET通道特性28，表明它可以作为MET通道的渗透通路。TMC蛋白质中这种预测腔的较大尺寸可以解释大分子渗透MET通道的能力。为了测试MET通道包含异常大渗透通路的预测，并突破TMC1中观察到的腔体大小的极限，我们开发了一个协议，在Corti外植的器官中用更大的分子进行吸收实验，3 kDa dextran荧光标记为德州红。
Dextran是一种复杂的分枝多糖，由许多D-葡萄糖分子组成，由α-1，6糖碱基结结合。其高溶性在水中，低细胞毒性，和生物不性使其成为研究多种细胞过程的多功能工具。此外，dextran 有多种尺寸可供选择，并带有多种颜色的荧光标记。荧光标记的dextrans通常用于细胞和组织渗透性研究33，34，研究多细胞系统35，36的内分泌，以及神经追踪37，38。在听觉领域，dextran分子也被用来评估细胞-细胞结的中断和听觉感觉上皮完整性的丧失后暴露于Corti39，40的chinchilla器官的强烈噪音。
在这项工作中，我们利用一些最小的（3和10 kDa）荧光除变性器的特性，在鼠内耳毛细胞中进行吸收实验，并探索内耳毛细胞MET通道的渗透通路的大小。此外，我们使用激光扫描共聚焦显微镜（LSM）880配备了Airyscan探测器，以可视化和本地化荧光dextran在立体神经和听觉毛细胞的细胞体。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

发细胞调子（MET）通道在听力中起着重要的作用。然而，MET的分子特性和结构信息仍然未知。对毛细胞的电生理学研究表明，MET通道具有较大的导导率，可渗透到相对较大的荧光阳离子分子，包括一些styryl染料和德州红标氨基糖苷抗生素。在此协议中，我们描述了一种可视化和评估 Corti 外植器官毛细胞中荧光分管的产生情况的方法，该方法可用于功能 MET 通道的测定。我们发现，3 kDa德州红标记dextran特别标记功能听觉毛细胞后1⁄2小时孵育。特别是，3 kDa dextran 标记两个较短的立体细胞行，并在存在功能 MET 通道时以漫反射模式在细胞体中累积。在毛细胞和周围支持细胞的细胞体中观察到了一种类似囊泡的标记模式。我们的数据表明，3 kDa德州红dextran可用于可视化和研究细胞染料摄入的两种途径;通过功能MET通道和内分泌的毛细胞特定进入途径，这种模式也可用于更大的dextran。

我们观察到，在野生型产后6（P6）小鼠的Corti外体器官孵育2小时后，毛细胞的强健和特殊标记，3 kDa dextran荧光标记有德州红（dextran-TR）（图2A-B）。在Corti器官的基底、中、顶区域（图2B）的内侧和外发细胞（IHC和OHC）中观察到了Dextran标记。
荧光标记的phalloidin用于对抗丝状物（F-actin）和可视化基于功能素...

Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

在这里，我们提出了一种方法，用于可视化3 kDa德州红标dextran在听觉毛细胞与功能性干扰诱导通道的吸收。此外，3~10 kDa的分泌器可用于研究毛发和Corti器官支持细胞的内分泌。

活体和功能性鼠耳蜗毛细胞中的德特贴标签和吸收

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

该协议的总体目标是研究使用带功能机械传递通道的活发细胞中标有德州红的常规脱毛光。该技术的主要优点是，三千达克顿德州红德克斯特兰可用于评估活毛细胞中的机械传递通道功能。要收获耳蜗，请将产后六只小鼠的头骨放入含有莱博维茨的L-15培养的60毫米培养皿中，并使用手术剪刀从头骨的前部到头骨后部和外听觉管的表面上切开。将皮肤折叠到鼻子上，露出颅骨，然后从头骨的背面和眼线上切开。将头骨分成两半，用一个小铲子取出大脑。当可以观察到时间骨骼时，用小剪刀在这些骨骼周围切割，以切除组织。将含有新鲜 L-15 介质的 35 毫米培养皿中的时间骨骼淹没，将培养皿置于配备宽领域目镜和外部交流电流卤素光源的立体显微镜下。使用钳子去除周围的耳蜗组织、半圆形管和前庭器官。一旦耳蜗被解剖并放置在一个新的菜与新鲜的L-15介质，使用手术钳，使一个穿刺伤口在圆窗和一个穿刺在青形耳蜗区域。当所有的耳蜗都收获后，将组织放入一个九井玻璃凹陷板的井中，其中含有200微升的新鲜L-15介质。对于分离组织的脱骨标记，用200微升新鲜L-15介质代替每个样品井中的介质，并辅以每毫升两毫克的荧光结合度。在室温下孵育样品两小时，在三维摇床中孵育25次旋转，倾斜角度为25度，不受光线影响。在孵育结束时，用中洗涤组织一次，用HSS洗涤两分钟。第二次洗涤后，将样品在室温下在4%甲醛中固定30分钟，随后在HSSS中快速和温和地清洗两次。第二次洗涤后，使用细尖钳切除耳蜗骨、螺旋韧带和气管膜，并清洗HPSS中分离的科蒂器官。取出透明电膜时要格外小心，因为头发细胞上的组织在这一步骤中很容易受损。要给F-actin贴上标签，在PBS中0.5%Triton X-100中渗透样品，并辅以100至200荧光标记的法洛丁稀释30分钟，在室温下不受光线影响。在孵育结束时，每次洗涤用新鲜HBSS清洗组织2至3次，随后在PBS中洗一次。使用适当的安装介质将Corti组织器官安装到玻璃显微镜上，将头发立体膜面向上，并使用 63X 油浸入目标在荧光共体显微镜上成像样品。经过两个小时的孵育，与三千多克多克斯顿荧光结合得克萨斯红，科蒂器官从野生类型产后第六小鼠证明一个强大和特定的标签内和外毛细胞。对毛细胞立体膜和细胞体进行成像后发现，只有那些在细胞体中加入三千克达顿德xtran德州红的细胞也表现出其立体的荧光标记。重要的是，沿立体灯观察均匀的荧光信号，在机械传输通道位于的较短的立体线尖端进行浓缩。在毛细胞和邻近支持细胞的细胞体中，也观察到囊泡状结构，这表明德xtran德州红也可以被内分泌。较大的10千达吨德克斯特兰也产生了一个囊泡状模式在细胞体的头发细胞和支撑细胞。值得注意的是，钙溷合器或机械转导通道阻滞剂的存在可防止立体贴片标记和三千多克顿德xtran德州红在毛细胞中的吸收。然而，在机械传递通道封锁的情况下，仍然观察到囊泡样模式，表明这种吸收模式与功能性 MET 通道无关。在安装组织进行成像之前，仔细解剖Corti组织的器官并确认毛细胞的正确方向是非常重要的。在活体和功能性毛细胞的脱毛标记后，可以对固定组织进行免疫污染，以确定感兴趣的特定细胞类型的蛋白质。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

在肌肉再生的老鼠模型中移植诱导多能干细胞衍生的中生代细胞样肌原体

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

科研

生物工程

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

细胞标记和超顺磁性氧化铁纳米粒子靶向

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

一个<em&gt;体外</em鼠类的椎间盘&gt;器官培养模型

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

影像学在两层微流控平台拟南芥幼苗的根头发形态

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

用于组织工程应用的三维聚 (ε-内) 支架的熔体静电纺丝

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

化重构法 (的) 对肠道干细胞和小生境细胞功能分析的研究

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

人骨髓间充质干细胞吸收含有法卡林多醇的新型脂质包覆纳米颗粒

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

单轴拉伸应变下活细胞核动力学的高分辨率成像

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

近同步激光扫描在活细胞上的共和和原子力显微镜（康波卡尔）

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

荧光染料标记脂质体体内组织特异性细胞摄取的制备、给药和评估

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...