Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Vi takker Vincent Schram fra NICHD mikroskopi og billeddannelse kerne for at bistå i konfokale billede erhvervelse, og Tsg-Hui Chang for uvurderlig hjælp med koloniforvaltning og mus pleje. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program af NINDS, NIH, Bethesda, MD, til KJA A.B. blev støttet af Intramural Research Program af NINDS, NIH, og af en Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship fra intramural forskningsprogram af NIDCD.

Dyrepleje- og forsøgsprocedurerne blev udført i følger retningslinjerne for pleje og anvendelse af laboratoriedyr, som blev godkendt af Animal Care and Use Committee fra National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Animal protocol #1336 til KJS).
1. Mus
<ol><li>Indstil et par ynglende par C57BL/6J vildtype til at yngle i dyreanlægget for at kontrollere datoen for nedløbets fødsel og holde styr på hvalpenes alder.</li>
</ol>2. Cochleae Dissektion
<...

Denne protokol beskriver, hvordan man udfører optagelse eksperimenter i murine organ Corti explants med 3 kDa dextran Texas Red. Formålet med denne metode er at teste, om molekyler større end andre tidligere testede var også i stand til specifikt at mærke auditive hårceller og gennemsyre gennem MET kanal. Lignende eksperimentelle protokoller er tidligere blevet brugt til at vurdere gennemtrængeligheden af hårceller til andre fluorescerende farvestoffer såsom FM1-43 (0,56 kDa)12,</sup...

Hårcellerne i det indre øre er de sensoriske celler, der registrerer lyd og skjulte de mekanisk stimuli i elektriske signaler, som i sidste ende fortolkes af vores hjerne. Disse celler har en trappe-formet bundt af tre rækker af actin-baserede filamenter, kendt som stereocilia, som stikker ud fra deres apical region1,2. De mekaniske stimuli afleder stereocilia-glødetrådene mod den længste række og udløser åbningen af mechanotransduction (MET)kanaler3. Åbningen af MET-kanalerne fører til en tilstrømning af kationer, der depolariserer cellen og dermed signalerer frigivelsen af synapse vesikler på de basale region af hårcelle.
De biofysiske egenskaber af MET kanal afgørende for hørelse naster. Disse kanaler er bl.a. Bemærkelsesværdigt, store fluorescerende molekyler såsom FM1-43 og Texas Rød-mærket aminoglycosides er permeant blokkere af MET kanal, hvilket resulterer i deres ophobning i hårcellekroppen, der kan visualiseres ved hjælp af fluorescens mikroskopi11,12,13,14. Omvendt er den molekylære identitet og strukturen af MET-kanalen og dens gennemtrængelsesvej forblevet undvigende. Stigende eksperimentelle beviser viser , at transmembrane-lignende kanal protein 1 (TMC1) er en del af MET kanal i modne hårceller15,16,17,18,19. Mutationer i transmembrane-lignende kanal 1 (TMC1) ændre MET kanal egenskaber19,20,21,22 og forårsage døvhed. Desuden lokaliserer TMC1 til det sted, hvor MET kanal18,23 og interagerer med tip-link ansvarlig for at overføre den mekaniske kraft til MET kanal24,25. Desuden har de seneste bioinformatik analyse identificeret TMC proteiner som evolutionære relateret til mechanosensitive kanaler TMEM63/OSCA proteiner og TMEM16 proteiner, en familie af calcium-aktiverede chlorid kanaler og lipid scramblases26,27,28. En strukturel model af TMC1 baseret på forholdet mellem disse proteiner afslørede tilstedeværelsen af et stort hulrum på protein-lipid interface27. Dette hulrum huser de to TMC1 mutationer, der forårsager autosomal dominerende høretab (DFNA36)27,29,30,31,32, og selektiv ændring af cystein mutanter for rester i hulrummet ændre MET kanal egenskaber28, hvilket indikerer, at det kunne fungere som gennemfarvning vej met kanal. Den store størrelse af denne forudsagte hulrum i TMC proteiner kunne forklare evnen af store molekyler til at gennemsyre MET kanal. For at teste forudsigelsen om, at MET-kanalen indeholder en usædvanlig stor gennemtrængelsesvej og for at skubbe grænserne for størrelsen af hulrummet observeret i TMC1, udviklede vi en protokol til at udføre optagelseeksperimenter i Corti-explants organ med et større molekyle, 3 kDa dextran fluorescerende mærket med Texas Red.
Dextran er en kompleks forgrenet polysaccharid består af mange D-glukose molekyler bundet af alfa-1,6 glycosidiske forbindelser. Dens høje opløselighed i vand, lav celle toksicitet, og bioinertity gør det til et alsidigt værktøj til at studere flere cellulære processer. Desuden er dextran fås i en bred vifte af størrelser og fluorescerende mærket med fluorophores i flere farver. Fluorescerende mærket dextrans er almindeligt anvendt i celle og væv permeabilitet forskning33,34, at studere endocytose i flere cellulære systemer35,36, og for neurale sporing37,38. På det auditive område er dextranmolekyler også blevet brugt til at vurdere afbrydelsen af cellecellekrydset og tabet af den auditive sensoriske epitelintegritet efter udsættelse for intens støj i chinchillaorgelet i Corti39,40.
I dette arbejde udnyttede vi egenskaberne for nogle af de mindste (3 og 10 kDa) fluorescerende dextrans til at udføre optagelsesforsøg i murine indre ørehårceller og udforske størrelsen af permeationsvejen for den indre ørehårscelle MET-kanal. Derudover brugte vi en laser-scanning konfokale mikroskop (LSM) 880 udstyret med en Airyscan detektor til at visualisere og lokalisere fluorescerende dextran på stereocilia og cellekroppen af auditive hårceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

Hårcellemechanotransduction (MET) kanal spiller en vigtig rolle i hørelsen. Den molekylære identitet og de strukturelle oplysninger om markedsøkonomisk behandling er dog fortsat ukendt. Elektrofysiologiske undersøgelser af hårceller viste, at MET-kanalen har en stor ledningsevne og er gennemtrængelig for relativt store fluorescerende kationiske molekyler, herunder nogle styrylfarvestoffer og Texas Rød-mærket aminoglycoside antibiotika. I denne protokol beskriver vi en metode til at visualisere og evaluere udbredelsen af fluorescerende dextrans i hårceller i orglet i Corti explants, der kan bruges til at assay for funktionelle MET kanaler. Vi fandt, at 3 kDa Texas Rød-mærket dextran specifikt etiketter funktionelle auditive hårceller efter 1-2 h inkubation. Især 3 kDa dextran etiketter de to kortere stereocilia rækker og ophobes i cellekroppen i et diffust mønster, når funktionelle MET kanaler er til stede. En yderligere vesicle-lignende mønster af mærkning blev observeret i cellekroppen af hårceller og omkringliggende støtteceller. Vores data tyder på, at 3 kDa Texas-Red dextran kan bruges til at visualisere og studere to veje til cellulære farvestof optagelse; en hårcellespecifik indgangsrute gennem funktionelle MET-kanaler og endocytose, et mønster, der også er tilgængeligt for større dextran.

Vi observerede robust og specifik mærkning af hårceller efter 2 h inkubation af orglet af Corti explants fra vilde-type postnatal-dag-6 (P6) mus med 3 kDa dextran fluorescerende mærket med Texas Red (dextran-TR)(Figur 2A-B). Dextran mærkning blev observeret i både indre og ydre hårceller (IHC og OHC) på basale, midterste og apiske regioner af orglet Corti(Figur 2B).
Fluorescerende mærket phall...

Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Her præsenterer vi en metode til visualisering af udbredelsen af 3 kDa Texas Rød-mærket dextran i auditive hårceller med funktionelle mechanotransduction kanaler. Desuden kan dextrans af 3-10 kDa bruges til at studere endocytose i hår og støtte celler i orglet corti.

Dextran Mærkning og optagelse i levende og funktionelle Murine Cochlear hårceller

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Det overordnede mål med denne protokol er at studere optagelsen af regelmæssige dextran fluorescerende mærket med Texas Red i levende hårceller med funktionelle mechanotransduction kanaler. Den største fordel ved denne teknik er, at de tre kilodalton Texas Red dextran kan bruges til at vurdere mechanotransduction kanal funktion i levende hårceller. At høste cochlea, placere kraniet af en postnatal dag seks mus i en 60 millimeter kultur parabol, der indeholder Leibovitz's L-15 medium og bruge kirurgisk saks til at gøre en overfladisk snit fra den forreste ende til den bageste ende af kraniet og på tværs af de eksterne auditive kanaler.Fold huden mod næsen for at udsætte kraniet og lave et snit fra bagsiden til forsiden af kraniet og på tværs af øjet linje. Adskå kraniet i to halvdele og bruge en lille spatel til at fjerne hjernen. Når de tidsmæssige knogler kan observeres, bruge små saks til at skære omkring disse knogler til punktafgifter vævet.Nedsænk de tidsmæssige knogler i 35 millimeter skålen indeholder frisk L-15 medium og placere skålen under et stereomikroskop udstyret med et bredt felt okular og en ekstern vekselstrøm halogen lyskilde. Brug snævle til at fjerne de omkringliggende cochlear væv, halvcirkelformede kanaler og vestibulære organer. Når cochlea er blevet dissekeret og placeret i en ny skål med friske L-15 medier, skal du bruge kirurgiske kraftbånd til at gøre en punktering sår på det runde vindue og en punktering på apical cochlear regionen.Når alle cochleae er blevet høstet, placere vævet i en brønd af en ni-godt glas fordybning plade indeholdende 200 mikroliter af frisk L-15 medium. For dextran mærkning af de isolerede væv, erstatte medium fra hver prøve godt med 200 mikroliter af friske L-15 medium suppleret med to milligram per milliliter af fluorescens konjugeret dextran af interesse. Prøverne inkuberes i to timer ved stuetemperatur og 25 omdrejninger i minuttet i en tredimensionel shaker i en vippet vinkel på 25 grader beskyttet mod lys.Ved inkubationens afslutning vaskes vævene én gang med medium og én gang med HBSS i to minutter pr. vask. Efter den anden vask fastgør prøverne i 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af to hurtige og blide vaske i HBSS. Efter den anden vask, bruge fine spids kraftaffekt til at fjerne cochlear knoglen, spiral ledbånd, og tectorial membran og vask det isolerede organ Corti i HBSS.Vær ekstra forsigtig, når du fjerner den gennemsigtige tectorial membran, da vævet på hårcellerne let kan beskadiges under dette trin. For at mærke F-actin, permeabilize prøverne i 0,5%Triton X-100 i PBS suppleret med 100 til 200 fortynding af fluorescerende mærket falloidin i 30 minutter ved stuetemperatur beskyttet mod lys. Ved inkubationens afslutning vaskes vævene to til tre gange i frisk HBSS pr. vask, som det fremgår af en enkelt vask i PBS.Brug et passende monteringsmedium til at montere orglet af Corti-væv på glasmikroskopet glider hårstereumciliasiderne op og afbilder prøverne på et fluorescerende konfokal mikroskop ved hjælp af målet om 63X olienedsænkning. Efter en to-timers inkubation med tre kilodalton dextran fluorescerende konjugeret med Texas Red, orgel Corti explant fra vilde type postnatal dag seks mus demonstrere en robust og specifik mærkning af både indre og ydre hårceller. Billeddannelse af hårcelle stereocilia og celle organer afslører, at kun de celler, der har indarbejdet tre kilodalton dextran Texas Red i deres celle krop viste også fluorescerende mærkning af deres stereocilia.Det er vigtigt, at der observeres et ensartet fluorescerende signal langs stereociliaet med berigelse ved spidsen af de kortere stereociliarækker, hvor mechanotransductionkanalen er placeret. Vesicle-lignende strukturer i cellekroppen af hårceller og de tilstødende understøttende celler er også observeret tyder på, at dextran Texas Red også kan tages op af endocytose. Større 10 kilodalton dextrans også produceret en vesicle-lignende mønster i cellen kroppen af hårceller og støtte celler.Især tilstedeværelsen af en calcium chelator eller mechanotransduction kanal blokkere forhindrer stereocilia mærkning og optagelse af tre kilodalton dextran Texas Red i hårceller. Det vesicle-lignende mønster observeres stadig i nærværelse af blokade af mechanotransduktionskanaler, hvilket indikerer, at dette optagelsesmønster er uafhængigt af funktionelle MET-kanaler. Det er meget vigtigt at dissekere orglet af Corti væv omhyggeligt og for at bekræfte den korrekte orientering af hårcellerne, før montering af væv til billeddannelse.Efter dextran mærkning af levende og funktionelle hårceller, immunstaining af det faste væv kan udføres for at identificere specifikke celletyper af proteiner af interesse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation af induceret pluripotente stamcelle-afledt Mesoangioblast-lignende Myogenic Stamfadere i Mouse Modeller af muskel regenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Celle Mærkning og målretning med Superparamagnetisk jernoxid Nanopartikler

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In vitro</em&gt; Orgel Kultur Model af muse diskusprolaps

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging rod hår morfologi af Arabidopsis stiklinger i en to-lags mikrofluid Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelte Electrospinning skrivning af tre-dimensionelle Poly(ε-caprolactone) stilladser med kontrollerbare morfologier for Tissue Engineering applikationer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Organoid rekonstitution Assay (ORA) for den funktionelle analyse af Intestinal stilk og Niche celler

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Optagelsen af nye Lipid-belagt nanopartikler som indeholder Falcarindiol af humane mesenkymale stamceller

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

High-Resolution Imaging af nuklear dynamik i levende celler under Uniaxial træk stamme

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

I nærheden af samtidig laserscanning konfokale og atomic force mikroskopi (Conpokal) på levende celler

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Forberedelse, administration og vurdering af in vivo vævsspecifik cellulær optagelse af fluorescerende farvestofmærkede liposomer

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...