Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Wij danken Vincent Schram van de NICHD microscopie en beeldvorming kern voor het helpen bij de confocale beeld verwerving, en Tsg-Hui Chang voor onschatbare hulp bij kolonie management en muizen zorg. Dit onderzoek werd ondersteund door het Intramural Research Program van de NINDS, NIH, Bethesda, MD, naar K.J.S. A.B. werd ondersteund door het Intramural Research Program van de NINDS, NIH, en door een Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship uit het intramurale onderzoeksprogramma van de NIDCD.

De dierverzorging en experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, die werden goedgekeurd door het Comité voor dierenverzorging en -gebruik van het Nationaal Instituut voor Neurologische Aandoeningen en Beroerte (Dierprotocol #1336 kJS).
1. Muizen
<ol><li>Stel een paar broedparen van C57BL/6J wild-type om te fokken in de dierlijke faciliteit om de geboortedatum van de nesten te controleren en bijhouden van de leeftijd va...

Dit protocol beschrijft hoe opname-experimenten uit te voeren in murine orgaan van Corti explants met 3 kDa dextran Texas Red. Het doel van deze methode is om te testen of moleculen groter dan anderen eerder getest waren ook in staat om specifiek label auditieve haarcellen en doordringen door de MET kanaal. Soortgelijke experimentele protocollen zijn eerder gebruikt om de doorlaatbaarheid van haarcellen te evalueren naar andere fluorescerende kleurstoffen zoals FM1-43 (0,56 kDa)12,<sup ...

De haarcellen van het binnenoor zijn de sensorische cellen die geluid detecteren en de mechanisch stimuli in elektrische signalen bedekken, die uiteindelijk door onze hersenen worden geïnterpreteerd. Deze cellen hebben een trapvormige bundel van drie rijen actine-gebaseerde filamenten, bekend als stereocilia, die uitsteken uit hun apicale gebied1,2. De mechanische stimuli buigen de stereocilia filamenten naar de langste rij en leiden tot de opening van de mechanotransductie (MET) kanalen3. De opening van de MET-kanalen leidt tot een toestroom van kationen die de cel depolariseert en dus het vrijkomen van synapsblaasjes in het basale gebied van de haarcel signaleert.
De biofysische eigenschappen van het MET-kanaal dat essentieel is voor het gehoor zijn uitgebreid gekarakteriseerd. Deze kanalen zijn onder andere selectief en hebben een relatief grote geleiding (150-300 pS in lage Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Opmerkelijk is dat grote fluorescerende moleculen zoals FM1-43 en Texas Red-gelabelde aminoglycosiden permeant blockers van het MET-kanaal zijn, wat resulteert in hun accumulatie in het haarcellichaam dat kan worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiemicroscopie11,12,13,14. Omgekeerd zijn de moleculaire identiteit en de structuur van het MET-kanaal en het permeatietraject ongrijpbaar gebleven. Steeds meer experimenteel bewijs wijst erop dat het transmembraanachtige kanaaleiwit 1 (TMC1) een onderdeel is van het MET-kanaal in volwassen haarcellen15,16,17,18,19. Mutaties in het transmembraanachtige kanaal 1 (TMC1) veranderen de EIGENSCHAPPEN van het MET-kanaal19,20,21,22 en veroorzaken doofheid. Daarnaast lokaliseert TMC1 naar de site van het MET-kanaal18,23 en werkt hij samen met de tip-link die verantwoordelijk is voor het overbrengen van de mechanische kracht naar het MET-kanaal24,25. Bovendien heeft de recente bio-informaticaanalyse de TMC-eiwitten geïdentificeerd als evolutionair gerelateerd aan de mechanogevoelige kanalen TMEM63/OSCA-eiwitten en de TMEM16-eiwitten, een familie van calciumgeactiveerde chloridekanalen en lipidescramblases26,27,28. Een structureel model van TMC1 op basis van de relatie tussen deze eiwitten bleek de aanwezigheid van een grote holte op de eiwit-lipide interface27. Deze holte herbergt de twee TMC1-mutaties die autosomal dominant gehoorverlies veroorzaken (DFNA36)27,29,30,31,32, en selectieve modificatie van cysteïnemutanten voor residuen in de holte veranderen MET-kanaaleigenschappen28, wat aangeeft dat het zou kunnen functioneren als het permeatietraject van het MET-kanaal. De grote omvang van deze voorspelde holte in TMC-eiwitten kan het vermogen van grote moleculen om het MET-kanaal door te dringen verklaren. Om de voorspelling te testen dat het MET-kanaal een ongewoon groot permeatietraject bevat en om de grenzen van de grootte van de holte in TMC1 te verleggen, ontwikkelden we een protocol om opname-experimenten uit te voeren in het orgaan van Corti-explants met een groter molecuul, 3 kDa dextran fluorescerend gelabeld met Texas Red.
Dextran is een complexe vertakte polysaccharide bestaande uit vele D-glucose moleculen gebonden door alfa-1,6 glycosidische koppelingen. De hoge oplosbaarheid in water, lage celtoxiciteit en bioinertiteit maken het een veelzijdig hulpmiddel om verschillende cellulaire processen te bestuderen. Daarnaast is dextran verkrijgbaar in een breed scala van maten en fluorescerend gelabeld met fluorophores van verschillende kleuren. Fluorescerend gelabeldde dextrans worden vaak gebruikt in cel- en weefseldoorlaatbaarheidsonderzoek33,34, om endocytose te bestuderen in meerdere cellulaire systemen35,36, en voor neurale tracering37,38. In het auditieve veld zijn ook dextran moleculen gebruikt om de verstoring van de celcelverbinding en het verlies van de auditieve sensorische epitheelintegriteit te beoordelen na blootstelling aan intens geluid in het chinchilla-orgaan van Corti39,40.
In dit werk, we benut de eigenschappen van enkele van de kleinste (3 en 10 kDa) fluorescerende dextrans om opname-experimenten uit te voeren in murine binnenoor haarcellen en verken de grootte van de permeatie pad van het binnenste oor haarcel MET kanaal. Daarnaast gebruikten we een laser-scanning confocale microscoop (LSM) 880 uitgerust met een Airyscan detector te visualiseren en lokaliseren fluorescerende dextran op de stereocilia en de cel lichaam van auditieve haarcellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

Het haarcel mechanotransduct (MET) kanaal speelt een belangrijke rol bij het horen. De moleculaire identiteit en structurele informatie van de met a.r.v. Elektrofysiologische studies van haarcellen bleek dat de MET kanaal heeft een grote geleiding en is doorlaatbaar om relatief grote fluorescerende kationische moleculen, waaronder sommige styryl kleurstoffen en Texas Red-gelabeldaminoglycoside antibiotica. In dit protocol beschrijven we een methode om de opname van fluorescerende dextrans in haarcellen van het orgaan van Corti-explants te visualiseren en te evalueren, die kunnen worden gebruikt om te zien voor functionele MET-kanalen. We vonden dat 3 kDa Texas Red-gelabeldd dextran specifiek labels functionele auditieve haarcellen na 1-2 uur incubatie. In het bijzonder labelt 3 kDa dextran de twee kortere stereociliarijen en hoopt zich op in het cellichaam in een diffuus patroon wanneer functionele MET-kanalen aanwezig zijn. Een extra blaasachtig patroon van etikettering werd waargenomen in het cellichaam van haarcellen en omringende ondersteunende cellen. Onze gegevens suggereren dat 3 kDa Texas-Red dextran kan worden gebruikt om te visualiseren en te bestuderen twee trajecten voor cellulaire kleurstof opname; een haarcelspecifieke toegangsroute via functionele MET-kanalen en endocytose, een patroon dat ook beschikbaar is voor grotere dextran.

We zagen robuuste en specifieke etikettering van haarcellen na 2 uur incubatie van orgaan van Corti explants van wilde postnatale-dag-6 (P6) muizen met 3 kDa dextran fluorescerend gelabeld met Texas Red (dextran-TR) (Figuur 2A-B). Dextran labeling werd waargenomen in zowel binnen- als buitenhaarcellen (IHC en OHC) in de basale, middelste en apicale gebieden van het orgaan van Corti(figuur 2B).
Fluores...

Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Hier presenteren we een methode voor het visualiseren van de opname van 3 kDa Texas Red-gelabelde dextran in auditieve haarcellen met functionele mechanotransductiekanalen. Daarnaast kan dextrans van 3-10 kDa worden gebruikt om endocytose in haar en ondersteunende cellen van het orgaan van Corti te bestuderen.

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Het algemene doel van dit protocol is het bestuderen van de opname van regelmatige dextran fluorescently gelabeld met Texas Red in levende haarcellen met functionele mechanotransductiekanalen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat de drie kilodalton Texas Red dextran kan worden gebruikt om mechanotransducductiekanaalfunctie in levende haarcellen te beoordelen. Om het slakkenhuis te oogsten, plaatst u de schedel van een postnatale dag zes muis in een 60 millimeter kweekschotel met Leibovitz's L-15-medium en gebruik een chirurgische schaar om een oppervlakkige snede te maken van het voorste uiteinde van het achterste uiteinde van de schedel en over de externe gehoorkanalen.Vouw de huid naar de neus om de schedel bloot te stellen en maak een incisie van de achterkant naar de voorkant van de schedel en over de ooglijn. Scheid de schedel in twee helften en gebruik een kleine spatel om de hersenen te verwijderen. Wanneer de temporele botten kunnen worden waargenomen, gebruik kleine schaar te snijden rond deze botten om het weefsel accijns.Dompel de tijdelijke botten onder in de 35 millimeter schotel met verse L-15 medium en plaats de schotel onder een stereo microscoop uitgerust met een breed veld oculair en een externe wisselstroom halogeen lichtbron. Gebruik tangen om het omringende cochleair weefsel, halfronde kanalen en vestibulaire organen te verwijderen. Zodra het slakkena is ontleed en geplaatst in een nieuwe schotel met verse L-15 media, gebruik chirurgische tangen om een steekwond op het ronde raam en een punctie op de apicale cochleair regio te maken.Wanneer alle slakkenplaat zijn geoogst, plaatst u het weefsel in een put van een negen-goed glasdepressieplaat met 200 microliters van vers L-15-medium. Voor dextran etikettering van de geïsoleerde weefsels, vervang het medium van elk monster goed met 200 microliters van verse L-15 medium aangevuld met twee milligram per milliliter van de fluorescentie geconjugeerde dextran van belang. Broed de monsters twee uur lang bij kamertemperatuur en 25 rotaties per minuut in een driedimensionale shaker in een gekantelde hoek van 25 graden beschermd tegen licht.Aan het einde van de incubatie, was de weefsels een keer met medium en een keer met HBSS gedurende twee minuten per wasbeurt. Na de tweede wasbeurt, bevestig de exemplaren in 4%paraformaldehyde gedurende 30 minuten op kamertemperatuur, gevolgd door twee snelle en zachte wasbeurten in HBSS. Gebruik na de tweede wasbeurt fijne tipkrachten om het cochleair bot, het spiraalvormige ligament en het tectorial membraan te verwijderen en het geïsoleerde orgaan van Corti in HBSS te wassen.Wees extra voorzichtig bij het verwijderen van het transparante tectorial membraan, omdat het weefsel op de haarcellen gemakkelijk kan worden beschadigd tijdens deze stap. Om de F-actine te labelen, permeabiliseren de monsters in 0,5%Triton X-100 in PBS aangevuld met 100 tot 200 verdunning van fluorescerend gelabeld phalloidine gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur beschermd tegen licht. Aan het einde van de incubatie, was de weefsels twee tot drie keer in verse HBSS per wasbeurt, zoals aangetoond, gevolgd door een enkele wasbeurt in PBS.Gebruik een geschikte montage-medium om het orgaan van Corti weefsels monteren op glazen microscoop dia's haar stereocilia zijden omhoog en beeld van de monsters op een fluorescerende confocale microscoop met behulp van de 63X olie onderdompeling doelstelling. Na een twee uur durende incubatie met drie kilodalton dextran fluorescerend geconjugeerd met Texas Red, orgel van Corti explant van wilde type postnatale dag zes muizen tonen een robuuste en specifieke etikettering van zowel binnen-en buitenste haarcellen. Beeldvorming van de haarcelstereciën en cellichamen blijkt dat alleen die cellen die drie kilodalton dextran Texas Red in hun cellichaam hebben opgenomen, ook fluorescerende etikettering van hun stereocilia hebben aangetoond.Belangrijk is dat een uniform tl-signaal wordt waargenomen langs de stereocilia met verrijking aan de uiteinden van de kortere stereocilia rijen waar het mechanotransductiekanaal zich bevindt. Vesicle-achtige structuren in het cellichaam van de haarcellen en de naburige ondersteunende cellen worden ook waargenomen suggereert dat dextran Texas Red kan ook worden opgenomen door endocytose. Grotere 10 kilodalton dextrans produceerde ook een blaas-achtig patroon in het cellichaam van haarcellen en ondersteunende cellen.Met name de aanwezigheid van een calciumchelator of mechanotransducductie kanaal blokkers voorkomt stereocilia etikettering en de opname van drie kilodalton dextran Texas Red in haarcellen. Het vesicle-achtige patroon wordt echter nog steeds waargenomen in aanwezigheid van mechanotransducductiekanaalblokkade, wat aangeeft dat dit patroon van opname onafhankelijk is van functionele MET-kanalen. Het is zeer belangrijk om het orgaan van Corti-weefsel zorgvuldig te ontleden en de juiste oriëntatie van de haarcellen te bevestigen voordat het weefsel wordt gemonteerd voor beeldvorming.Na dextran etikettering van levende en functionele haarcellen, immunostaining van het vaste weefsel kan worden uitgevoerd om specifieke celsoorten van het belang te identificeren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Cel Labeling en Targeting met superparamagnetische ijzeroxide Nanodeeltjes

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Een<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Model van het Muizen tussenwervelschijf

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Beeldvorming van de morfologie van het haar van de wortel van Arabidopsis zaailingen in een twee-laag Microfluidic Platform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Electrospinning schrijven van driedimensionale Poly(ε-caprolactone) steigers met controleerbare Morphologies voor Tissue Engineering toepassingen smelten

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

De Organoid reconstitutie Assay (ORA) voor de functionele analyse van intestinale stam en Niche cellen

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Opname van nieuwe lipide-gecoate nanodeeltjes met Falcarindiol door menselijke mesenchymale stamcellen

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Hoge-resolutie beeldvorming van kern dynamiek in levende cellen onder Éénassige trekspanning

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) op Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Voorbereiding, toediening en beoordeling van in vivo weefselspecifieke cellulaire opname van fluorescerende kleurstof-gelabelde liposomen

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...