Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Nous remercions Vincent Schram du noyau de microscopie et d’imagerie NICHD pour son aide à l’acquisition d’images confocales, et Tsg-Hui Chang pour son aide inestimable dans la gestion des colonies et les soins aux souris. Cette recherche a été appuyée par le Programme de recherche intra-muros du NINDS, NIH, Bethesda, MD, à K.J.S. A.B. a été soutenue par le Programme de recherche intra-muros du NINDS, NIH, et par une bourse postdoctorale Robert Wenthold du programme de recherche intra-muros du NIDCD.

Les soins aux animaux et les procédures expérimentales ont été effectués conformément aux lignes directrices pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, qui ont été approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux (protocole animal #1336 à KJS).
1. Souris
<ol><li>Établiz un couple de couples reproducteurs de type sauvage C57BL/6J pour qu’ils se reprod...

Ce protocole décrit comment effectuer des expériences d’adoption dans l’organe murine des explants de Corti avec 3 kDa dextran Texas Red. L’objectif de cette méthode est de tester si les molécules plus grandes que d’autres précédemment testées ont également été en mesure d’étiqueter spécifiquement les cellules ciliées auditives et imprégner par le canal MET. Des protocoles expérimentaux similaires ont déjà été utilisés pour évaluer la perméabilité des cellules ciliées à d’autres color...

Les cellules ciliées de l’oreille interne sont les cellules sensorielles qui détectent le son et les stimuli mécaniquement dans les signaux électriques, qui sont finalement interprétés par notre cerveau. Ces cellules ont un faisceau en forme d’escalier de trois rangées de filaments à base d’actine, connus sous le nom de stéréocilia, qui dépassent de leur région apaïque1,2. Les stimuli mécaniques détournent les filaments stéréociliens vers la plus longue rangée et déclenchent l’ouverture des canaux de mécanotransduction (MET)3. L’ouverture des canaux MET conduit à un afflux de cations qui dépolarise la cellule et signale par conséquent la libération de vésicules synapses à la région basale de la cellule capillaire.
Les propriétés biophysiques du canal MET essentielles à l’audition ont été largement caractérisées. Entre autres propriétés, ces canaux sont cationic sélective et ont une conductance relativement grande (150-300 pS en basse Ca2)4,5,6,7,8,9,10. Remarquablement, de grandes molécules fluorescentes telles que FM1-43 et les aminoglycosides à étiquette rouge du Texas sont des bloqueurs perméats du canal MET, ce qui entraîne leur accumulation dans le corps des cellules capillaires qui peuvent être visualisées à l’aide de la microscopie de fluorescence11,12,13,14. Inversement, l’identité moléculaire et la structure du canal MET et sa voie de perméation sont restées insaisissables. De plus en plus de preuves expérimentales indiquent que la protéine de canal transmembrane-like 1 (TMC1) est un composant du canal MET dans les cellules ciliées matures15,16,17,18,19. Les mutations dans le canal transmembrane-comme 1 (TMC1) modifient les propriétés de canal DE MET19,20,21,22 et causent la surdité. En outre, TMC1 localise le site du canal MET18,23 et interagit avec le lien de pointe responsable de la transmission de la force mécanique au canal MET24,25. En outre, l’analyse bioinformatique récente a identifié les protéines TMC comme évolutives liées aux canaux mécanosensibles TMEM63/OSCA protéines et les protéines TMEM16, une famille de canaux de chlorure activés par le calcium et brouillages lipidiques26,27,28. Un modèle structurel de TMC1 basé sur la relation entre ces protéines a révélé la présence d’une grande cavité à l’interface protéine-lipide27. Cette cavité abrite les deux mutations TMC1 qui causent la perte auditive dominante autosomique (DFNA36)27,29,30,31,32, et la modification sélective des mutants de cystéine pour les résidus dans la cavité modifient les propriétés du canal MET28, indiquant qu’il pourrait fonctionner comme la voie de perméation du canal MET. La grande taille de cette cavité prévue dans les protéines TMC pourrait expliquer la capacité des grosses molécules à imprégner le canal MET. Pour tester la prédiction que le canal MET contient une voie de perméation exceptionnellement grande et pour repousser les limites de la taille de la cavité observée dans TMC1, nous avons développé un protocole pour effectuer des expériences d’adoption dans l’organe des explants de Corti avec une molécule plus grande, 3 kDa dextran fluorescente étiquetée avec Texas Red.
Dextran est un polysaccharide ramifié complexe composé de nombreuses molécules de D-glucose liées par des liaisons alpha-1,6 glycosidiques. Sa solubilité élevée dans l’eau, sa faible toxicité cellulaire et sa bioinerité en font un outil polyvalent pour étudier plusieurs processus cellulaires. En outre, dextran est disponible dans un large éventail de tailles et fluorescente étiqueté avec des fluorophores de plusieurs couleurs. Les dextrans étiquetés fluorescents sont couramment utilisés dans la recherche sur la perméabilité des cellules et des tissus33,34, pour étudier l’endocytose dans plusieurs systèmes cellulaires35,36, et pour le traçage neuronal37,38. Dans le domaine auditif, des molécules de dextran ont également été utilisées pour évaluer la perturbation de la jonction cellule-cellule et la perte de l’intégrité auditive de l’épithélium sensoriel après l’exposition à un bruit intense dans l’organe chinchilla de Corti39,40.
Dans ce travail, nous avons exploité les propriétés de certains des plus petits (3 et 10 kDa) dextrans fluorescents pour effectuer des expériences d’uptake dans les cellules ciliées de l’oreille interne murine et d’explorer la taille de la voie de perméation de la cellule capillaire de l’oreille interne MET canal. En outre, nous avons utilisé un microscope confocal à balayage laser (LSM) 880 équipé d’un détecteur Airyscan pour visualiser et localiser le dextran fluorescent à la stéréocilie et au corps cellulaire des cellules ciliées auditives.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

Le canal de mécanotransduction de cellules capillaires (MET) joue un rôle important dans l’audition. Cependant, l’identité moléculaire et les informations structurelles du MET restent inconnues. Les études électrophysiologiques des cellules ciliées ont indiqué que le canal de MET a une grande conductance et est perméable aux molécules cationic fluorescentes relativement grandes, y compris quelques colorants de styryl et antibiotiques d’aminoglycoside Red-étiquetés du Texas. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode pour visualiser et évaluer l’utilisation du dextrans fluorescent dans les cellules ciliées de l’organe des explants de Corti qui peuvent être utilisés pour évaluer les canaux MET fonctionnels. Nous avons constaté que 3 kDa Texas Red-labeled dextran étiquette spécifiquement les cellules ciliées auditives fonctionnelles après l’incubation de 1/2 h. En particulier, 3 kDa dextran étiquette les deux lignes stéréocilia plus courtes et s’accumule dans le corps cellulaire dans un modèle diffus lorsque les canaux MET fonctionnels sont présents. Un modèle supplémentaire de vésicule-comme de l’étiquetage a été observé dans le corps cellulaire des cellules ciliées et des cellules de soutien environnantes. Nos données suggèrent que le dextran Texas-Rouge de 3 kDa puisse être employé pour visualiser et étudier deux voies pour l’utilisation cellulaire de colorant ; une voie d’entrée spécifique aux cellules capillaires à travers les canaux MET fonctionnels et l’endocytose, un modèle également disponible pour les plus grands dextran.

Nous avons observé un étiquetage robuste et spécifique des cellules ciliées après l’incubation de 2h d’organes d’explants de Corti provenant de souris de type sauvage postnatal-jour-6 (P6) avec 3 kDa dextran fluorescents étiquetés avec Texas Red (dextran-TR) (Figure 2A-B). L’étiquetage de Dextran a été observé dans les cellules ciliées intérieures et externes (IHC et OHC) aux régions basales, moyennes et apatiques de l’organe de Corti (<strong class="...

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Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Ici, nous présentons une méthode pour visualiser l’apaisement de 3 kDa Texas Red-labeled dextran dans les cellules ciliées auditives avec des canaux fonctionnels de mécannotransduction. En outre, dextrans de 3 à 10 kDa peuvent être utilisés pour étudier l’endocytose dans les cheveux et les cellules de soutien de l’organe de Corti.

Étiquetage Dextran et prise en vie et fonctionnelle cellules courines Murine

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

L’objectif global de ce protocole est d’étudier l’absorption de dextran régulier étiqueté fluorescent avec Texas Red dans les cellules cils vivantes avec des canaux de mécanotransduction fonctionnelle. Le principal avantage de cette technique est que les trois kilodalton Texas Red dextran peuvent être utilisés pour évaluer la fonction du canal de mécanotransduction dans les cellules cils vivantes. Pour récolter la cochlée, placez le crâne d’une souris postnatale de six jours dans un plat de culture de 60 millimètres contenant le milieu L-15 de Leibovitz et utilisez des ciseaux chirurgicaux pour faire une coupe superficielle de l’extrémité antérieure à l’extrémité postérieure du crâne et à travers les canaux auditifs externes.Pliez la peau vers le nez pour exposer le crâne et faire une incision de l’arrière à l’avant du crâne et à travers la ligne des yeux. Séparez le crâne en deux moitiés et utilisez une petite spatule pour enlever le cerveau. Lorsque les os temporels peuvent être observés, utilisez de petits ciseaux pour couper autour de ces os pour exciser le tissu.Submergez les os temporels dans le plat de 35 millimètres contenant du L-15 frais moyen et placez le plat sous un microscope stéréo équipé d’un oculaire large champ et d’une source de lumière halogène alternée externe. Utilisez des forceps pour enlever le tissu cochléaire environnant, les canaux semi-circulaires et les organes vestibulaires. Une fois que la cochlée a été disséquée et placée dans un nouveau plat avec les médias frais de L-15, utilisez des forceps chirurgicaux pour faire une blessure de perforation sur la fenêtre ronde et une ponction à la région cochléaire apical.Lorsque toutes les cochlées ont été récoltées, placez le tissu dans un puits d’une plaque de dépression en verre de neuf puits contenant 200 microlitres de L-15 frais moyen. Pour l’étiquetage dextran des tissus isolés, remplacez le milieu de chaque puits d’échantillon par 200 microlitres de L-15 frais moyen complété par deux milligrammes par millilitre de la fluorescence conjuguée dextran d’intérêt. Incuber les échantillons pendant deux heures à température ambiante et 25 rotations par minute dans un shaker tridimensionnel à un angle incliné de 25 degrés protégé de la lumière.À la fin de l’incubation, laver les tissus une fois à l’heure moyenne et une fois avec le HBSS pendant deux minutes par lavage. Après le deuxième lavage, fixer les spécimens en paraformaldéhyde à 4 % pendant 30 minutes à température ambiante, suivi de deux lavages rapides et doux dans le HBSS. Après le deuxième lavage, utilisez des forceps à pointe fine pour enlever l’os cochléaire, le ligament spirale et la membrane tectoriale et laver l’organe isolé de Corti dans HBSS.Prenez un soin supplémentaire lors de l’enlèvement de la membrane tectorial transparente puisque le tissu sur les cellules cils peuvent être facilement endommagés au cours de cette étape. Pour étiqueter la F-actine, perméabilizez les échantillons dans 0,5%Triton X-100 en PBS complété par 100 à 200 dilution de phalloidin étiqueté fluorescent pendant 30 minutes à température ambiante protégée de la lumière. À la fin de l’incubation, lavez les tissus deux à trois fois dans le HBSS frais par lavage tel que démontré suivi d’un seul lavage dans PBS.Utilisez un support de montage approprié pour monter l’organe des tissus Corti sur le microscope en verre glisse stéréocilia cheveux vers le haut et l’image des échantillons sur un microscope confocal fluorescent en utilisant l’objectif d’immersion d’huile 63X. Après une incubation de deux heures avec trois kilodalton dextran conjugués fluorescentement avec Texas Red, organe de Corti explant de type sauvage postnatal jour six souris démontrent un étiquetage robuste et spécifique des cellules capillaires intérieures et externes. L’imagerie des cellules capillaires stéréocilia et des corps cellulaires révèle que seules les cellules qui ont incorporé trois kilodaltons dextran Texas Red dans leur corps cellulaire ont également démontré l’étiquetage fluorescent de leur stéréocilia.Fait important, un signal fluorescent uniforme est observé le long de la stéréocilia avec enrichissement à l’extrémité des rangées stéréocilia plus courtes où se trouve le canal de mécanotransduction. Des structures vésicules dans le corps cellulaire des cellules cils et les cellules voisines de soutien sont également observées suggérant que dextran Texas Red peut également être pris par endocytose. Plus grand dextrans de 10 kilodalton a également produit un modèle vesicle-like dans le corps cellulaire des cellules de cheveux et des cellules de soutien.Notamment, la présence d’un chélateur de calcium ou de inhibiteurs de la mécanotransduction empêche l’étiquetage stéréocilia et l’absorption de trois kilodaltons dextran Texas Red dans les cellules cils. Le modèle vesicle-like est toujours observé en présence du blocus de canal de méchanotransduction, cependant, indiquant que ce modèle d’absorption est indépendant des canaux fonctionnels de MET. Il est très important de disséquer soigneusement l’organe du tissu corti et de confirmer l’orientation correcte des cellules cils avant de monter le tissu pour l’imagerie.Après l’étiquetage dextran des cellules cils vivantes et fonctionnelles, l’immunostaining du tissu fixe peut être exécuté pour identifier des types spécifiques de cellules de protéines d’intérêt.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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