Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
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Wir danken Vincent Schram vom NICHD-Mikroskopie- und Bildgebungskern für die Unterstützung bei der konfokalen Bildaufnahme und Tsg-Hui Chang für die unschätzbare Hilfe bei der Verwaltung von Kolonien und der Mäusepflege. Diese Forschung wurde unterstützt durch das Intramural Research Program des NINDS, NIH, Bethesda, MD, an K.J.S. A.B. wurde durch das Intramural Research Program des NINDS, NIH, und durch ein Robert Wenthold Postdoktorandenstipendium aus dem intramurarischen Forschungsprogramm unterstützt. der NIDCD.

Die Tierpflege und die experimentellen Verfahren wurden gemäß den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt, die vom Animal Care and Use Committee des National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Animal Protocol #1336 to KJS) genehmigt wurden.
1. Mäuse
<ol><li>Legen Sie ein paar Brutpaare von C57BL/6J Wildtyp in der Tieranlage zu brüten, um das Geburtsdatum der Würfe zu kontrollieren und das Alter der Welpen zu verfolgen.</li>
</ol><p class="jo...

Dieses Protokoll beschreibt, wie Aufnahmeexperimente in murinen Organ von Corti-Explants mit 3 kDa dextran Texas Red durchzuführen. Ziel dieser Methode ist es zu testen, ob Moleküle, die größer als andere zuvor getestetwurden, auch in der Lage waren, auditive Haarzellen gezielt zu kennzeichnen und durch den MET-Kanal zu durchdringen. Ähnliche experimentelle Protokolle wurden bisher verwendet, um die Durchlässigkeit von Haarzellen zu anderen fluoreszierenden Farbstoffen wie FM1-43 (0,56 kDa)12</sup...

Die Haarzellen des Innenohrs sind die Sinneszellen, die Schall erkennen und die mechanischen Reize in elektrischen Signalen verdeckt, die letztlich von unserem Gehirn interpretiert werden. Diese Zellen haben ein treppenförmiges Bündel von drei Reihen von actinbasierten Filamenten, bekannt als Stereocilia, die aus ihrer apikalen Region1,2hervorragen. Die mechanischen Reize lenken die Stereocilia-Filamente in Richtung der längsten Reihe ab und lösen die Öffnung der Mechanotransduktionskanäle (MET)3aus. Die Öffnung der MET-Kanäle führt zu einem Zustrom von Kationen, die die Zelle depolarisieren und folglich die Freisetzung von Synapsenbläschen im Basalbereich der Haarzelle signalisieren.
Die biophysikalischen Eigenschaften des für das Hören wesentlichen MET-Kanals wurden extensiv charakterisiert. Unter anderen Eigenschaften sind diese Kanäle kationisch selektiv und haben eine relativ große Leitfähigkeit (150–300 pS in niedrigen Ca2+) 4,5,6,7,8,9,10. Bemerkenswert ist, dass große fluoreszierende Moleküle wie FM1-43 und Texas Rotmarkierte Aminoglykoside permeant Blocker des MET-Kanals sind, was zu ihrer Ansammlung im Haarzellkörper führt, die mit Fluoreszenzmikroskopie11,12,13,14visualisiert werden kann. Umgekehrt sind die molekulare Identität und die Struktur des MET-Kanals und sein Permeationsweg schwer fassbar geblieben. Zunehmende experimentelle Belege deuten darauf hin, dass das transmembranartige Kanalprotein 1 (TMC1) ein Bestandteil des MET-Kanals in reifen Haarzellen15,16,17,18,19ist. Mutationen im transmembranartigen Kanal 1 (TMC1) verändern die MET-Kanaleigenschaften19,20,21,22 und verursachen Taubheit. Darüber hinaus lokalisiert TMC1 auf die Stelle des MET-Kanals18,23 und interagiert mit dem Tip-Link, der für die Übertragung der mechanischen Kraft an den MET-Kanal24,25verantwortlich ist. Darüber hinaus hat eine kürzlich durchgeführte Bioinformatik-Analyse die TMC-Proteine als evolutionär identifiziert, die mit den mechanosensitiven Kanälen TMEM63/OSCA-Proteinen und den TMEM16-Proteinen zusammenhängen, einer Familie von Calcium-aktivierten Chloridkanälen und Lipid-Scramblases26,27,28. Ein Strukturmodell von TMC1, das auf der Beziehung zwischen diesen Proteinen basiert, zeigte das Vorhandensein eines großen Hohlraums an der Protein-Lipid-Schnittstelle27. Dieser Hohlraum enthält die beiden TMC1-Mutationen, die autosomal dominanten Hörverlust (DFNA36)27,29,30,31,32, und selektive Modifikation von Cysteinmutanten für Rückstände in der Kavität verändern MET-Kanaleigenschaften28, was darauf hindeutet, dass es als Permeationsweg des MET-Kanals funktionieren könnte. Die große Größe dieser vorhergesagten Kavität in TMC-Proteinen könnte die Fähigkeit großer Moleküle erklären, den MET-Kanal zu durchdringen. Um die Vorhersage zu testen, dass der MET-Kanal einen ungewöhnlich großen Permeationsweg enthält, und um die Grenzen der Größe der in TMC1 beobachteten Kavität zu überschreiten, haben wir ein Protokoll entwickelt, um Aufnahmeexperimente im Organ von Corti-Explants mit einem größeren Molekül durchzuführen, 3 kDa Dextran fluoreszierend mit Texas Red beschriftet.
Dextran ist ein komplexes verzweigtes Polysaccharid, das aus vielen D-Glucose-Molekülen besteht, die durch alpha-1,6 glykodidische Verbindungen gebunden sind. Seine hohe Löslichkeit in Wasser, geringe Zelltoxizität und Bioinertity machen es zu einem vielseitigen Werkzeug, um mehrere zelluläre Prozesse zu studieren. Darüber hinaus ist dextran in einer Vielzahl von Größen erhältlich und fluoreszierend mit Fluorophoren in verschiedenen Farben gekennzeichnet. Fluoreszierend beschriftet dextrans werden häufig in der Zell- und Gewebedurchlässigkeitsforschung33,34, zur Untersuchung der Endozytose in mehreren zellulären Systemen35,36, und für die neuronale Tracing37,38. Im hörbaren Bereich wurden dextran Moleküle auch verwendet, um die Störung der Zell-Zell-Kreuzung und den Verlust der auditiven sensorischen Epithelintegrität nach Exposition gegenüber intensivem Rauschen im Chinchilla-Organ von Corti39,40zu bewerten.
In dieser Arbeit nutzten wir die Eigenschaften einiger der kleinsten (3 und 10 kDa) fluoreszierenden Dextrans, um Aufnahmeexperimente in murinen Innenohrhaarzellen durchzuführen und die Größe des Permeationswegs des Met-Kanals der Inneren Ohrhaarzelle zu untersuchen. Darüber hinaus verwendeten wir ein Laserscanning Konfokalmikroskop (LSM) 880 mit einem Airyscan-Detektor, um fluoreszierende Dextran an der Stereocilia und dem Zellkörper von auditiven Haarzellen zu visualisieren und zu lokalisieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

Der Haarzell-Mechanotransduktionskanal (MET) spielt beim Hören eine wichtige Rolle. Die molekulare Identität und die strukturellen Informationen der ME bleiben jedoch unbekannt. Elektrophysiologische Untersuchungen von Haarzellen ergaben, dass der MET-Kanal eine große Leitfähigkeit hat und für relativ große fluoreszierende kationische Moleküle durchlässig ist, darunter einige Styrylfarbstoffe und Texas Rot-markierte Aminoglykosid-Antibiotika. In diesem Protokoll beschreiben wir eine Methode zur Visualisierung und Bewertung der Aufnahme von fluoreszierender Dextrans in Haarzellen des Organs der Corti-Explants, die verwendet werden können, um funktionelle MET-Kanäle zu untersuchen. Wir fanden heraus, dass 3 kDa Texas Red-labeled dextran speziell funktionelle auditive Haarzellen nach 1-2 h Inkubation kennzeichnet. Insbesondere beschriftet 3 kDa dextran die beiden kürzeren Stereocilia-Reihen und sammelt sich im Zellkörper in einem diffusen Muster an, wenn funktionelle MET-Kanäle vorhanden sind. Ein zusätzliches vesikelartiges Etikettierungsmuster wurde im Zellkörper von Haarzellen und umgebenden stützenden Zellen beobachtet. Unsere Daten deuten darauf hin, dass 3 kDa Texas-Red Dextran verwendet werden kann, um zwei Wege für die Aufnahme von zellulären Farbstoffen zu visualisieren und zu untersuchen; eine haarzellspezifische Einstiegsroute durch funktionelle MET-Kanäle und Endozytose, ein Muster, das auch für größere Dextran verfügbar ist.

Wir beobachteten eine robuste und spezifische Kennzeichnung von Haarzellen nach 2h Inkubation von Organen von Corti-Explants von wildtypen postnatalen Tagesmäusen (P6) mit 3 kDa Dextran fluoreszierend mit Texas Red (dextran-TR)(Abbildung 2A-B). Die Dextran-Etikettierung wurde sowohl in inneren als auch äußeren Haarzellen (IHC und OHC) an den basalen, mittleren und apikalen Bereichen des Corti-Organs beobachtet (Abbildung 2B)....

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Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Hier präsentieren wir eine Methode zur Visualisierung der Aufnahme von 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditiven Haarzellen mit funktionellen Mechanotransduktionskanälen. Darüber hinaus kann Dextrans von 3–10 kDa verwendet werden, um Endozytose im Haar und unterstützenden Zellen des Organs von Corti zu studieren.

Dextran Etikettierung und Aufnahme in lebenden und funktionellen Murine Cochlear Haarzellen

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, die Aufnahme von regulären Dextran fluoreszierend mit Texas Red in lebenden Haarzellen mit funktionellen Mechanotransduktionskanälen zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die drei Kilodalton Texas Red Dextran verwendet werden können, um die Mechanotransduktionskanalfunktion in lebenden Haarzellen zu bewerten. Um die Cochlea zu ernten, legen Sie den Schädel einer postnatalen Sechsermaus in eine 60-Millimeter-Kulturschale mit Leibovitz' L-15-Medium und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen oberflächlichen Schnitt vom vorderen Ende bis zum hinteren Ende des Schädels und über die äußeren Gehörskanäle zu machen.Falten Sie die Haut in Richtung der Nase, um den Schädel freizulegen und einen Schnitt von hinten nach vorne des Schädels und über die Augenlinie zu machen. Trennen Sie den Schädel in zwei Hälften und verwenden Sie einen kleinen Spachtel, um das Gehirn zu entfernen. Wenn die zeitlichen Knochen beobachtet werden können, verwenden Sie eine kleine Schere, um diese Knochen zu schneiden, um das Gewebe zu verbrauchen.Untertauchen Sie die zeitlichen Knochen in die 35-Millimeter-Schale mit frischem L-15-Medium und legen Sie die Schale unter ein Stereomikroskop, das mit einem Weitfeld-Okular und einer externen Wechselstrom-Halogenlichtquelle ausgestattet ist. Verwenden Sie Zangen, um das umgebende Cochlea-Gewebe, halbkreisförmige Kanäle und vestibuläre Organe zu entfernen. Sobald die Cochlea seziert und in eine neue Schüssel mit frischen L-15-Medien gelegt wurde, verwenden Sie chirurgische Zangen, um eine Stichwunde am runden Fenster und eine Punktion im apikalen Cochlea-Bereich zu machen.Wenn alle Cochleae geerntet sind, legen Sie das Gewebe in einen Brunnen einer neun Well-Glas-Depressionsplatte mit 200 Mikroliter frisches L-15 Medium. Für die Dextran-Kennzeichnung der isolierten Gewebe, ersetzen Sie das Medium aus jeder Probe gut mit 200 Mikroliter frisches L-15-Medium, ergänzt durch zwei Milligramm pro Milliliter der fluoreszenz konjugierten Dextran von Interesse. Inkubieren Sie die Proben für zwei Stunden bei Raumtemperatur und 25 Umdrehungen pro Minute in einem dreidimensionalen Shaker in einem geneigten Winkel von 25 Grad, der vor Licht geschützt ist.Am Ende der Inkubation die Gewebe einmal mit Medium und einmal mit HBSS für zwei Minuten pro Wäsche waschen. Nach der zweiten Wäsche die Proben in 4% Paraformaldehyd für 30 Minuten bei Raumtemperatur fixieren, gefolgt von zwei schnellen und sanften Wäbungen in HBSS. Nach der zweiten Wäsche verwenden Sie feine Spitzenzange, um den Cochlea-Knochen, das Spiralband und die tektoriale Membran zu entfernen und das isolierte Organ von Corti in HBSS zu waschen.Achten Sie beim Entfernen der transparenten tektorialen Membran besonders darauf, da das Gewebe an den Haarzellen während dieses Schritts leicht beschädigt werden kann. Um das F-Actin zu kennzeichnen, permeabilisieren Sie die Proben in 0,5%Triton X-100 in PBS, ergänzt durch 100 bis 200 Verdünnung von fluoreszierend markiertem Phalloidin für 30 Minuten bei Lichtschutz im Raum. Am Ende der Inkubation das Gewebe zwei- bis dreimal in frischem HBSS pro Waschgang waschen, wie gezeigt, gefolgt von einer einzigen Wäsche in PBS.Verwenden Sie ein geeignetes Montagemedium, um das Organ von Corti-Geweben auf Glasmikroskop zu montieren, das Haarstereocilia Seiten nach oben schiebt und die Proben auf einem fluoreszierenden konfokalen Mikroskop mit dem 63X Öl-Immersion-Objektiv abbilden. Nach einer zweistündigen Inkubation mit drei Kilodalton-Dextran fluoreszierend konjugiert mit Texas Red, Organ von Corti Explant aus wilden Typ postnatalen Tag sechs Mäuse zeigen eine robuste und spezifische Kennzeichnung von inneren und äußeren Haarzellen. Die Bildgebung der Haarzellstereocilia und der Zellkörper zeigt, dass nur die Zellen, die drei Kilodalton Dextran Texas Red in ihren Zellkörper integriert haben, auch eine fluoreszierende Etikettierung ihrer Stereocilia demonstrierten.Wichtig ist, dass entlang der Stereocilia ein gleichmäßiges fluoreszierendes Signal mit Anreicherung an den Spitzen der kürzeren Stereocilia-Reihen beobachtet wird, in denen sich der Mechanotransduktionskanal befindet. Vesikelartige Strukturen im Zellkörper der Haarzellen und der benachbarten Stützzellen werden ebenfalls beobachtet, was darauf hindeutet, dass Dextran Texas Red auch durch Endozytose aufgenommen werden kann. Größere 10 Kilodalton Dextrans produziert auch ein vesikelartiges Muster im Zellkörper von Haarzellen und unterstützenden Zellen.Insbesondere verhindert das Vorhandensein eines Kalziumchelators oder mechanotransduktionskanalblockers die Stereocilia-Etikettierung und die Aufnahme von drei Kilodalton-Dextran Texas Red in Haarzellen. Das vesikelartige Muster wird jedoch immer noch in Gegenwart einer Mechanotransduktionskanalblockade beobachtet, was darauf hindeutet, dass dieses Aufnahmemuster unabhängig von funktionellen MET-Kanälen ist. Es ist sehr wichtig, das Organ des Corti-Gewebes sorgfältig zu sezieren und die richtige Ausrichtung der Haarzellen zu bestätigen, bevor das Gewebe für die Bildgebung montiert wird.Nach der Dextran-Kennzeichnung von lebenden und funktionellen Haarzellen kann eine Immunfärbung des festen Gewebes durchgeführt werden, um bestimmte Zelltypen von Proteinen von Interesse zu identifizieren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

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Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Forschung

Biotechnik

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Zellmarkierung und Targeting mit superparamagnetische Eisenoxid-Nanopartikel

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

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Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

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Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

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