Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

אנו מודים לוינסנט Schram מתוך המיקרוסקופיה וליבת ההדמיה לסיוע ברכישת תמונה מרכזית, ו-Tsg-Hui Chang לעזרה לא יסולא בפז בניהול המושבה ובטיפול בעכברים. מחקר זה נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של NINDS, NIH, בת, MD, כדי K.J.S. א יהושע נתמך על ידי תוכנית מחקר הפנים של NINDS, NIH, ועל ידי רוברט Wenthold מלגת השתלמות מתוכנית המחקר התוך-קיר של ה-נדבך.

הטיפול בבעלי חיים והליכים ניסיוניים נערכו בעקבות ההנחיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, אשר אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים השימוש של המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות שבץ (פרוטוקול בעלי חיים #1336 KJS).
1. עכברים
<ol><li>הגדר כמה זוגות הרבייה של C57BL/6J פראי סוג להתרבות במתקן החי ל?...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לבצע ניסויים ספיגה באיבר murine של האקסוצמחים corti עם 3 kda תוספי טקסס אדום. המטרה של שיטה זו היא לבדוק אם מולקולות גדולות יותר מאשר אחרים שנבדקו בעבר היו גם מסוגלים לתייג במפורש תאים שיער שמיעתי והחדיר דרך ערוץ MET. פרוטוקולים ניסיוניים דומים שימשו בעבר כדי להעריך את החדירות...

תאי השיער של האוזן הפנימית הם תאי החישה המזהים קול וסמויה את הגירוי המוכני באותות חשמליים, אשר מפורשים בסופו של דבר על ידי המוח שלנו. תאים אלה יש צרור בצורת גרם מדרגות של שלוש שורות של filaments מבוססי חוטים, המכונה stereocilia, אשר בולטות מאזור פסגה שלהם1,2. הגירוי המכני מהסיט את החוטים הסטריאוציאניים לעבר השורה הארוכה ביותר ומפעיל את פתיחת ערוצי המכונה3. פתיחת ערוצי ה-MET מובילה לזרם של הקטיונים המפתלים את התא וכתוצאה מכך מאותת על שחרורו של סינפסה באזור הבסיס של תא השיער.
המאפיינים הביופיזיים של ערוץ MET חיוני לשמיעה התאפיין בהרחבה. בין היתר, הערוצים הללו הם בררניים ובעלי מוליכות גדולה יחסית (150 – 300 pS ב-Ca+ 2 +)4,5,6,7,8,9,10. באופן מדהים, מולקולות פלורסנט גדול כגון FM1-43 ו-טקסס בעלת תווית של האדום מתויג של הערוץ ה, הנובע הצטברות שלהם בגוף תא השיער שניתן לדמיין באמצעות המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית11,12,13,14. לעומת זאת, הזהות המולקולרית ומבנה ערוץ ה-MET ומסלול החדירות שלו נותרו חמקמקים. הגדלת הראיות הנסיוניות מצביעה על כך שחלבון הערוץ ה-transרפידה (TMC1) הוא רכיב של ערוץ ה-MET בתאי שיער בוגרים15,16,17,18,19. מוטציות בערוץ מדומה (TMC1) לשנות את מאפייני ערוץ MET19,20,21,22 ולגרום חירשות. בנוסף, TMC1 לאתר את ערוץ met18,23 ואינטראקציה עם הקישור טיפ אחראי על שידור הכוח המכני לערוץ MET24,25. יתר על כן, ניתוח ביואינפורמטיקה האחרונים זיהה את החלבונים tmc כמו האבולוציה הקשורים לערוצים מכנימתי TMEM63/osca חלבונים וחלבונים TMEM16, משפחה של ערוצי כלוריד סידן מופעל ו ליפידים26,27,28. מודל מבנית של TMC1 מבוסס על הקשר בין חלבונים אלה חשף נוכחות של חלל גדול בממשק חלבון-שומנים ממשק27. זה חלל הנמלים שתי מוטציות TMC1 שגורמות לאובדן שמיעה אוטוזומלית דומיננטי (DFNA36)27,29,30,31,32, ושינוי סלקטיבי של מוטציות ציסטאין עבור שאריות בחלל לשנות את המאפיינים של הערוץ28, המציין כי זה יכול לתפקד כנתיב חדירות של ערוץ MET. הגודל הגדול של חלל זה ניבא בחלבונים TMC יכול להסביר את היכולת של מולקולות גדולות לחלחל ערוץ MET. כדי לבדוק את החיזוי כי הערוץ MET מכיל מסלול חדירות גדול במיוחד כדי לדחוף את המגבלות של גודל החלל נצפתה ב TMC1, פיתחנו פרוטוקול לבצע ניסויים ספיגה באיבר של האקסון corti עם מולקולה גדולה יותר, 3 הודה תוספי באופן שכותרתו עם טקסס אדום.
Dextran הוא רב-סוכר מורכב בענף מורכב של מולקולות D-גלוקוז רבות כרוך על ידי alpha-1, 6 הקשרים הגליצידית. שלה מסיסות גבוהה במים, רעילות תא נמוכה, ו bioinertity להפוך אותו כלי רב-תכליתי ללמוד מספר תהליכים סלולריים. בנוסף, תוספי זמין במגוון רחב של גדלים ובעלי תווית fluorophores של מספר צבעים. בדרך כלל, משתמשים ב-dextrans באמצעות מחקר של תאים וחדירות רקמות33,34, כדי ללמוד אנדוקציטוזה במערכות סלולריות מרובות35,36, ועבור מעקב עצבי37,38. בשדה השמיעה, מולקולות תוספי גם נעשה שימוש כדי להעריך את ההפרעה של הצומת תא תא ואובדן של שלמות האפיתל חושי השמיעה לאחר החשיפה לרעש אינטנסיבי בעוגב צ'ינצ'ילה של corti39,40.
בעבודה זו, אנו לנצל את המאפיינים של חלק קטן (3 ו-10 kDa) הפלורסנט כדי לבצע ניסויים ספיגה בתאי שיער פנימי murine ולחקור את הגודל של הנתיב חדירות של תא האוזן הפנימית שיער פוגש ערוץ. בנוסף, השתמשנו מיקרוסקופ קונפוקלית וקד בדיקת לייזר (lsm) 880 מצויד בגלאי airyscan כדי להמחיש ולהתאים את תוספי פלורסנט ב stereocilia ואת גוף התא של תאים שיער שמיעתי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

בערוץ המכונה (MET) מפעיל השער ממלא תפקיד חשוב בשמיעה. עם זאת, הזהות המולקולרית והמידע המבני של MET אינם ידועים. המחקרים האלקטרופיסיולוגיים של תאי השיער גילו שלערוץ MET יש היקף מוליכות גדול והוא חדיר למולקולות פלורסנט גדולות יחסית, כולל מספר צבעים בצבעי styryl ואנטיביוטיקה בצבע אדום עם התווית. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה להמחיש ולהעריך את ספיגת דטרנס פלורסנט בתאי השיער של האיבר של האקריות Corti שניתן להשתמש בו כדי לטפל עבור הערוצים הפונקציונליים MET. מצאנו כי 3 kda טקסס אדום תווית תוספי במיוחד תוויות שיער שמיעתי פונקציונלי לאחר 1 – 2 h הדגירה. בפרט, 3 kda תוספי תוויות שתי שורות stereocilia קצר מצטבר בגוף התא בתבנית מפוזר כאשר ערוצי MET פונקציונלי נוכחים. דפוס נוסף שלפוחית העין של תיוג נצפתה בגוף התא של תאי השיער והתאים התומכים המקיפים. הנתונים שלנו מראים כי 3 kda טקסס-אדום תוספי ניתן להשתמש כדי להמחיש וללמוד שני מסלולים עבור ספיגת צבע הסלולר; מסלול כניסה ספציפי לתא שיער באמצעות ערוצי MET פונקציונלי והאנדוציטוזה, דפוס זמין גם dextran גדול.

הבחנו חזק וספציפי תיוג של תאי שיער לאחר הדגירה של 2h של האיבר של corti explants מסוג פראי לנטאל-יום 6 (P6) עכברים עם 3התווית של שלושהכאשר מסומן בדגל עם טקסס אדום (תוספי-TR) (איור 2א-ב). תיוג dextran נצפתה הן בתאי השיער הפנימיים והחיצוניים (IHC ו-OHC) באזורים הבזליים, האמצעיים והאפותיים ש...

Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

כאן, אנו מציגים שיטה להמחיש את ספיגת 3 kda טקסס אדום התווית תוספי בתאי שיער שמיעתי עם ערוצי מכניזציה תפקודית. בנוסף, דקסטר של 3 – 10 kDa ניתן להשתמש כדי ללמוד endocyציטוזה בתוך השיער והתאים התומכים של האיבר של Corti.

תיוג דקטרן וספיגת בתאי שיער מורורין בשידור חי ופונקציונלי

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא ללמוד את ספיגת רגיל dextran פלואורסצנטי שכותרתו עם טקסס אדום בתאי שיער חיים עם ערוצי mechanotransduction פונקציונלי. היתרון העיקרי של טכניקה זו היא כי שלושה קילודלטון טקסס רד dextran יכול לשמש כדי להעריך את תפקוד ערוץ mechanotransduction בתאי שיער חיים. כדי לקצור את השבריריים, מניחים את גולגולתו של עכבר יום שישי לאחר הלידה בצלחת תרבות של 60 מילימטר המכילה את מדיום L-15 של ליבוביץ' ולהשתמש במספריים כירורגיים כדי לבצע חתך שטחי מהקצה האחורי לקצה האחורי של הגולגולת ולאורך תעלות השמיעה החיצוניות.מקפלים את העור לכיוון האף כדי לחשוף את הגולגולת ולעשות חתך מאחור לחזית הגולגולת ולאורך קו העין. מפרידים את הגולגולת לשני חצאים ולהשתמש מרית קטנה כדי להסיר את המוח. כאשר ניתן לראות את עצמות הזמן, השתמש במספריים קטנים כדי לחתוך סביב עצמות אלה כדי למלמל את הרקמה.להטביע את עצמות הזמן בצלחת 35 מילימטר המכילה טרי L-15 בינוני ומ מניחים את המנה תחת מיקרוסקופ סטריאו מצויד עין שדה רחב מקור אור הלוגן זרם לסירוגין חיצוני. השתמש במקלפים כדי להסיר את רקמת הכילאר שמסביב, תעלות מעגליות למחצה ואיברים שיוויוני. לאחר שה שבלול הדם נותח והונח בצלחת חדשה עם מדיה L-15 טרייה, השתמש במלקחיים כירורגיים כדי לגרום לפצע דקירה אחד בחלון העגול ולנקב אחד באזור שבלול האפייה.כאשר כל cochleae נקצרו, למקם את הרקמה לתוך באר של צלחת דיכאון זכוכית תשע באר המכיל 200 microliters של מדיום L-15 טרי. לתיוג דקסטרן של הרקמות המבודדות, החלף את המדיום מכל מדגם היטב עם 200 מיקרוליטרים של מדיום L-15 טרי בתוספת שני מיליגרם למיליליטר של הפלואורסצנטיות נדנוד דקסטרן של עניין. דגירה הדגימות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ו 25 סיבובים לדקה בשייקר תלת מימדי בזווית מוטה של 25 מעלות מוגן מפני אור.בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמות פעם אחת עם בינוני ופעם אחת עם HBSS במשך שתי דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, לתקן את הדגימות ב 4% paraformaldehyde במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו שתי שטיפות מהירות ועדינות HBSS. לאחר הכביסה השנייה, השתמש במטליות קצה עדין כדי להסיר את עצם העצם הקדמית, את הרצועה הספירלית ואת קרום tectorial ולשטוף את האיבר המבודד של קורטי ב HBSS.יש לדאוג במיוחד בעת הסרת קרום tectorial שקוף מאז הרקמה על תאי השיער יכול להיפגע בקלות במהלך שלב זה. כדי לתייג את ה-F-actin, חלחלו לדגימות ב-0.5% טריטון X-100 ב-PBS בתוספת 100 עד 200 דילול של פאלואין עם תווית פלואורסצנטית למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר המוגנת מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את הרקמות פעמיים עד שלוש פעמים HBSS טרי לכל לשטוף כפי שהוכח ואחריו לשטוף אחד PBS.השתמש באמצעי הרכבה מתאים כדי להרכיב את האיבר של רקמות קורטי על מיקרוסקופ זכוכית מחליק צדדים סטריאוציליה שיער למעלה ותמונה הדגימות על מיקרוסקופ קונפוקל פלואורסצנטי באמצעות המטרה טבילת שמן 63X. לאחר דגירה של שעתיים עם שלושה קילודלטון dextran פלואורסצנטי חידה עם טקסס אדום, איבר של קורטי explant מן יום שלאחר לידה סוג פראי שישה עכברים להפגין תיוג חזק וסגול של תאי שיער פנימיים וחיצוניים. הדמיה של stereocilia תא השיער וגופי התא מגלה כי רק תאים אלה אשר שילבו שלושה קילודאלטון dextran טקסס אדום בגוף התא שלהם גם הפגינו תיוג פלואורסצנטי של stereocilia שלהם.חשוב לציין, אות פלואורסצנטי אחיד נצפה לאורך הסטריאוסיליה עם העשרה בסוף שורות stereocilia קצר שבו ערוץ mechanotransduction ממוקם. מבנים דמויי Vesicle בגוף התא של תאי השיער ואת התאים התומכים השכנים נצפו גם מציע כי דקסטרן טקסס אדום יכול גם להילקח על ידי אנדוציטוזיס. גדול יותר 10 dextrans קילודלטון גם הפיק דפוס דמוי זן בגוף התא של תאי שיער ותאים תומכים.יש לציין, נוכחות של כלטור סידן או חוסמי תעלת mechanotransduction מונע תיוג stereocilia ואת ספיגת של שלושה קילודלטון dextran טקסס אדום בתאי שיער. דפוס דמוי ווסקל עדיין נצפתה בנוכחות מצור ערוץ mechanotransduction, עם זאת, המציין כי דפוס זה של ספיגה אינו תלוי ערוצי MET פונקציונליים. חשוב מאוד לנתח את האיבר של רקמת קורטי בזהירות ולאשר את האוריינטציה הנכונה של תאי השיער לפני הרכבה הרקמה להדמיה.לאחר תיוג דקסטרן של תאי שיער חיים ופונקציונליים, ניתן לבצע כשל חיסוני של הרקמה הקבועה כדי לזהות סוגי תאים ספציפיים של חלבונים מעניינים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

תיוג תא ומיקוד עם פאראמגנטי תחמוצת ברזל חלקיקים

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם תרבות איברים של הדיסק הבין חולייתי Murine

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

הדמיה המורפולוגיה שורש השיער של תודרנית השתילים בשטח פלטפורמה Microfluidic דו שכבתי

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

וזמינותו שיחזור תא צורב (אורה) לניתוח פונקציונלי של מעיים גזע ותאים נישה

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

ספיגת של חלקיקים חדשים מצופים השומנים, המכיל Falcarindiol על ידי גזע אנושי Mesenchymal

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

ברזולוציה גבוהה הדמיה של דינמיקה גרעינית בתאים חיים תחת מתיחה Uniaxial המתח

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

הכנה, מתן והערכה של ספיגה תאית ספציפית לרקמת in vivo של ליפוזומים בעלי תווית צבע פלואורסצנטי

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...