Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
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NICHD顕微鏡・イメージングコアのヴィンセント・シュラム氏が共焦点画像取得を支援してくれたことに感謝し、Tsg-Hui Chang氏はコロニー管理とマウスケアに非常に役立ててくれたことに感謝します。この研究は、NINDS、NIH、ベシスダ、MD、K.J.S.A.B.の壁内研究プログラムによって支援されました NINDSの壁内研究プログラム、およびロバート・ウェントホールド博士フェローシップによって支えられたの。

動物のケアと実験手順は、国立神経障害・脳卒中研究所(KJSに#1336動物プロトコル)の動物ケアおよび使用委員会によって承認された実験動物のケアと使用のガイドラインに従って行われました。
1. マウス
<ol><li>ごみの生年月日を制御し、子犬の年齢を追跡するために動物施設で繁殖するC57BL / 6J野生型の繁殖ペアのカップルを設定します。</li>
</ol>2. コク?...

このプロトコルは、3 kDa デキストランテキサスレッドとコルチ外植物のマウスの器官で取り込み実験を行う方法について説明します。この方法の目的は、以前にテストされた他の分子よりも大きい分子が、METチャネルを通して聴覚毛細胞を特異的に標識し、浸透させることができたかどうかをテストすることです。同様の実験プロトコルは、FM1-43(0.56 kDa)12、19、20および<...

内耳の毛細胞は、音を検出し、最終的に私たちの脳によって解釈される電気信号の機械的刺激を隠す感覚細胞です。これらの細胞は、立体領域1、2から突き出た立体基のフィラメントの3列の階段状の束を有する。機械的刺激は、ステレオシリアフィラメントを最長の列に向かって偏向させ、メカノトランスダクション(MET)チャネル3の開口部を引き起こす。METチャネルの開口部は、細胞を脱分極し、その結果、毛細胞の基底領域でシナプス小胞の放出を知らせるカチベーションの流入につながります。
聴覚に不可欠なMETチャネルの生物物理学的特性は広範囲に特徴付けられている。他の特性の中でも、これらのチャネルはカチオン選択的であり、比較的大きなコンダクタンス(低Ca2+で150〜300 pS)4、5、6、7、8、9、10を有する。驚くべきことに、FM1-43およびテキサス赤標識アミノグリコシドのような大きな蛍光分子は、METチャネルの過透過遮断薬であり、蛍光顕微鏡11、12、13、14を用いて可視化することができる毛髪体内での蓄積をもたらす。逆に、METチャネルの分子同一性と構造とその透過経路は、依然として不可解なままである。実験証拠の増加は、膜貫通様チャネルタンパク質1(TMC1)が成熟した毛細胞15、16、17、18、19におけるMETチャネルの成分であることを示す。膜貫通チャネル1(TMC1)の突然変異は、METチャネル特性19、20、21、22を変化させ、難聴を引き起こす。また、TMC1はMETチャネル18,23の部位に局地化し、METチャネル24,25に機械的力を伝達するチップリンクと相互作用する。さらに、最近のバイオインフォマティクス解析では、TMCタンパク質がメカ感受性チャネルTMEM63/OSCAタンパク質およびTMEM16タンパク質、カルシウム活性塩化物チャネルおよび脂質スクランブラース26、27、28に関連する進化的なものであると同定されている。これらのタンパク質の関係に基づくTMC1の構造モデルは、タンパク質-脂質界面27における大きな空洞の存在を明らかにした。この空洞は、常染色体優性難聴(DFNA36)27、29、30、31、32を引き起こす2つのTMC1変異を収容し、また、空洞内の残基に対するシステイン突然変異体の選択的改変はMETチャネル特性28を変化させ、METチャネルの透過経路として機能し得る可能性があることを示す。TMCタンパク質におけるこの予測空洞の大きなサイズは、METチャネルに浸透する大きな分子の能力を説明することができる。METチャネルに異常に大きな浸透経路が含まれているという予測をテストし、TMC1で観察された空洞の大きさの限界を押し広げるために、テキサスレッドで蛍光標識された3kDaデキストランを大きな分子を有するコルチ外植体の器官で取り込み実験を行うプロトコルを開発した。
デキストランは、α-1,6グリコシド結合によって結合された多くのD-グルコース分子から構成される複雑な分岐多糖である。水、低細胞毒性、およびバイオインナーティの高い溶解性は、いくつかの細胞プロセスを研究するための汎用性の高いツールになります。さらに、デキストランは、サイズの広い範囲で利用可能であり、蛍光色に複数の色の蛍光体で標識されています。蛍光標識デックストランスは、細胞および組織透過性研究33、34において一般的に使用され、複数の細胞系システム35、36、および神経追跡37、38におけるエンドサイトーシスを研究する。聴覚分野では、デキストラン分子はまた、コルチ39、40のチンチラ器官の強烈な騒音にさらされた後の細胞接合の破壊および聴覚上皮完全性の喪失を評価するためにも使用されている。
本研究では、最小(3~10kDa)の蛍光デクトランスの特性を利用して、マウス内耳毛髪細胞の取り込み実験を行い、内耳毛細胞METチャネルの透過経路の大きさを調べた。また、エアリスキャン検出器を搭載したレーザー走査共焦点顕微鏡(LSM)880を用いて、立体性と聴覚毛細胞の細胞体で蛍光デキストランを可視化し、局在化しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

毛細胞メカノトランスダクション(MET)チャネルは、聴覚において重要な役割を果たしている。しかしながら、METの分子同一性と構造情報は不明のままである。毛髪細胞の電気生理学的研究により、METチャネルはコンダクタンスが大きく、スタイリル色素やテキサス赤色のアミノグリコシド系抗生物質を含む比較的大きな蛍光カチオン分子に透過性であることが明らかになった。本プロトコルでは、機能的METチャネルのアッセイに使用できるコルチ外植物の器官の毛細胞における蛍光デックストランスの取り込みを可視化し評価する方法について述べた。3 kDa テキサスレッドラベルデキストランは、1~2時間のインキュベーション後に機能性聴覚毛髪細胞に特異的にラベルを付けることがわかりました。特に、3 kDa dextranは2つの短い立体列にラベルを付け、機能的なMETチャネルが存在する場合に拡散パターンで細胞体に蓄積する。毛髪細胞および周囲の支持細胞の細胞体内で、さらなる小胞様の標識パターンが認められた。我々のデータは、3 kDaテキサスレッドデキストランを使用して、細胞染料取り込みのための2つの経路を視覚化し、研究することができることを示唆している。機能的なMETチャネルおよびエンドサイトーシスを通る毛髪細胞特異的なエントリルート、より大きなデキストランにも利用できるパターン。

我々は、テキサスレッド(dextran-TR)で蛍光標識された3kDaデキストランを有する野生型出生後6日目(P6)マウスからのコルチ外植物の器官の2hインキュベーション後の毛細胞の堅牢かつ特異的な標識を観察した(図2A-B)。デキストランの標識は、コルチの器官の基底、中、および尖部領域での内側および外側の毛細胞(IHCおよびOHC)の両方で観察された(...

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Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

ここでは、機能性メカノトランスダクションチャネルを有する聴覚毛髪細胞における3kDaテキサス赤ラベルデキストランの取り込みを視覚化する方法を提示する。さらに、3〜10kDaのデキトランスは、コルチの器官の毛髪および支持細胞におけるエンドサイトーシスを研究するために使用することができる。

生きた機能性マウス人工内毛細胞におけるデキストランの標識と取り込み

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

このプロトコルの全体的な目標は、機能的メカノトランスダクションチャネルを有する生毛細胞において、テキサスレッドで蛍光標識された規則的なデキストランの取り込みについて研究することです。この技術の主な利点は、3キロダルトンテキサスレッドデキストランが生きた毛細胞のメカノトランスダクションチャネル機能を評価するために使用できることです。内耳を収穫するには、出生後6日目のマウスの頭蓋骨をライボヴィッツのL-15培地を含む60ミリメートルの培養皿に入れ、外科用ハサミを使用して、前端から頭蓋骨の後端まで、そして外耳管を横切って表面的な切断を行う。鼻に向かって皮膚を折り畳んで頭蓋骨を露出させ、後ろから頭蓋骨の前部とアイラインを横切って切開します。頭蓋骨を2つの半分に分け、小さなへらを使って脳を取り除く。側頭骨を観察できる場合は、小さいはさみを使ってこれらの骨の周りを切り取って組織を切除する。新鮮なL-15培地を含む35ミリメートル皿に側頭骨を沈め、広いフィールド接眼眼と外部交流電流ハロゲン光源を備えたステレオ顕微鏡の下に皿を置きます。鉗子を使用して周囲の人工内耳組織、半円形の運河および前庭器官を取り除く。人工内耳が解剖され、新鮮なL-15メディアで新しい皿に入れられたら、外科的鉗子を使用して円形の窓に1つの穿刺傷を作り、尖体人工内耳領域で1つの穿刺を行う。すべてのコクレアが収穫されたら、新鮮なL-15培地の200マイクロリットルを含む9ウェルガラスうつ病プレートの井戸に組織を入れます。単離組織のデキストラン標識の場合、各サンプルからの培地を、対象の蛍光共役デキストランの1ミリリットル当たり2ミリグラムを添加した新鮮なL-15培地の200マイクロリットルに置き換えます。光から保護された25度の傾いた角度で3次元シェーカーで、室温で2時間、毎分25回転のサンプルをインキュベートします。インキュベーションの終了時に、1回、HBSSで1回、洗浄ごとに2分間、組織を洗浄します。2回目の洗浄後、室温で30分間4%パラホルムアルデヒドで試料を固定し、HBSSで2回の迅速かつ穏やかな洗浄を行います。2回目の洗浄後、細かい先端鉗子を使用して、人工内骨、螺旋靭帯、およびテクトリアル膜を除去し、HBSSでコルティの単離された器官を洗浄する。このステップ中に毛髪細胞の組織が損傷しやすいので、透明なテクトリアル膜を除去する際には、細心の注意を払ってください。F-アクチンを標識するには、蛍光標識ファロイジンを100~200希釈してPBS中の0.5%トリトンX-100で透過して、光から保護された室温で30分間透過させます。インキュベーションの終わりに、PBSで1回の洗浄を行い、その後に示すように、洗浄ごとに新鮮なHBSSで組織を2〜3回洗浄します。適切な取り付け媒体を使用して、コルチ組織の器官をガラス顕微鏡に取り付け、毛髪の立体層をスライドさせ、63X油浸出目的を使用して蛍光共焦点顕微鏡でサンプルを画像化します。テキサスレッドと蛍光結合した3キロダルトンデキストランによる2時間のインキュベーションの後、6匹のマウスの野生型からコルチ外植の器官は、内側と外側の両方の毛細胞の堅牢で特異的な標識を示す。毛細胞の立体および細胞体の画像化は、細胞体に3キロダルトンデキストランテキサスレッドを組み込んだ細胞だけが、ステレオシリアの蛍光標識を実証したことを明らかにした。重要なことに、メカノトランスダクションチャネルが位置する短い立体列の先端で、高濃縮を伴うステレオシリアに沿って均一な蛍光信号が観察される。毛髪細胞の細胞体および隣接する支持細胞におけるベシクル様構造も観察され、デキストランテキサスレッドもエンドサイトーシスによって取り上げられることを示唆している。より大きな10キロダルトンデキtransはまた、毛細胞および支持細胞の細胞体に小胞様なパターンを産生した。特に、カルシウムキレートまたはメカノトランスダクションチャネルブロッカーの存在は、毛細胞における立体標識および3キロダルトンデキストランテキサスレッドの取り込みを防ぐ。しかし、小胞様パターンはメカノトランスダクションチャネル遮断の存在下でまだ観察され、しかし、この取り込みのパターンは機能的なMETチャネルとは無関係であることを示している。皮質細胞の臓器を慎重に解剖し、画像処理のために組織を取り付ける前に毛細胞の適切な配向を確認することは非常に重要です。生きた毛髪細胞および機能的な毛髪細胞のデキストラン標識後、固定組織の免疫染色を行い、目的のタンパク質の特定の細胞タイプを同定することができる。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

細胞標識および超常磁性酸化鉄ナノ粒子とターゲティング

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

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アン<em&gt;インビトロ</emマウス椎間板の&gt;器官培養モデル

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

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二層流体プラットフォームシロイヌナズナ実生の根毛の形態のイメージング

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

組織工学的応用の制御可能な形態の三次元 Poly(ε-caprolactone) 足場のエレクトロスピニング記述を溶かす

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

腸幹とニッチ細胞機能解析における再構成アッセイ (ORA)

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

ヒト間葉系幹細胞によって Falcarindiol を含む新しい脂質被覆ナノ粒子の取り込み

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

一軸引張ひずみ下での生細胞における核動態の高分解能イメージング

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

ライブセル上の近くの同時レーザー走査共焦点と原子間力顕微鏡(コンポカル)

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

蛍光色素標識リポソームのin vivo組織特異的細胞取り込みの調製、投与、および評価

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...