Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
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우리는 공초점 이미지 수집을 지원하기 위한 NICHD 현미경 검사법 및 이미징 코어의 빈센트 슈람과 식민지 관리 및 마우스 관리에 귀중한 도움을 준 Tsg-Hui Chang에게 감사드립니다. 이 연구는 NINDS, NIH, 베데스다, MD의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었으며, K.J.S. A.B.는 NINDS, NIH의 교내 연구 프로그램과 교내 연구 프로그램에서 로버트 웬홀드 박사 후 펠로우십에 의해 지원되었습니다. NIDCD의

동물 관리 및 실험 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 지침에 따라 수행되었다, 이는 신경 장애 및 뇌졸중의 국립 연구소의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인된 (동물 프로토콜 은 KJS에 #1336).
1. 생쥐
<ol><li>C57BL/6J 야생형의 번식 쌍을 세워 동물 시설에서 번식하여 새끼의 생년월일을 제어하고 새끼의 나이를 추적합니다.</li>
</ol>2. 달팽이관 해부</p...

이 프로토콜은 3 kDa dextran 텍사스 레드와 코르티 이식의 뮤린 기관에서 섭취 실험을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 방법의 목표는 이전에 시험된 그 외 보다는 더 큰 분자가 또한 특히 청각 머리 세포를 표지하고 MET 채널을 통해 침투할 수 있었다는 것을 시험하는 것입니다. 유사한 실험 프로토콜은 이전에 FM1-43 (0.56 kDa)12,19,20...

내이의 모발 세포는 소리를 감지하고 궁극적으로 우리의 뇌에 의해 해석되는 전기 신호의 기계적 자극을 은폐하는 감각 세포입니다. 이 세포는 그들의 정점 지역1,2에서돌출하는 스테레오실리아로 알려져 있는 actin 기지를 둔 필라멘트의 3개의 행의 계단 모양 의 묶음을 가지고 있습니다. 기계적 자극은 스테레오실리아 필라멘트를 가장 긴 행쪽으로 편향시키고 메카노트랜스덕션(MET) 채널3의개구부를 트리거합니다. MET 채널의 개통은 세포를 탈분극화하고 결과적으로 모발 세포의 기저 부위에 시냅스 소포의 방출을 신호하는 양이온의 유입으로 이어집니다.
청력에 필수적인 MET 채널의 생물물리학적 특성은 광범위하게 특징지어졌습니다. 다른 특성 들 중, 이들 채널은 양이온 선택적이며 상대적으로 큰 전도도 (낮은Ca2 +에서 150-300 pS)4,5,6,7,8,9,10을갖는다. 놀랍게도, FM1-43 및 텍사스 적색 표지된 아미노글리코시드와 같은 큰 형광 분자는 MET 채널의 퍼시블 차단제이며, 형광 현미경 검사법을 사용하여 가시화될 수 있는 모발 세포체에 축적되는 결과를11,12,13,14. 반대로, 분자 정체성 및 MET 채널및 그 투과 통로의 구조는 애매하게 남아 있습니다. 증가하는 실험적 증거는 막막유사 채널 단백질 1(TMC1)이 성숙한 모발 세포15,16,17,18,19에서MET 채널의 성분임을 나타낸다. 막형 채널 1(TMC1)의 돌연변이는 MET 채널 속성19,20,21,22를 변경하고 청각 장애를 일으킨다. 또한, TMC1은 MET채널(18,23)의 부위에 국소화하고, 기계적 힘을 MET채널(24,25)으로전송하는 것을 담당하는 팁 링크와 상호작용한다. 더욱이, 최근 생물정보학 분석은 TMC 단백질을 메카노민성 채널 TMEM63/OSCA 단백질 및 TMEM16 단백질, 칼슘 활성 염화물 채널 및 지질 스크램블라제 26,27,28와관련된 진화로 확인하였으며,28. 이들 단백질 간의 관계에 기초한 TMC1의 구조적 모델은 단백질-지질계면(27)에서큰 공동의 존재를 밝혀낸다. 이 공동은 상염색체 지배적 난청(DFNA36)을 유발하는 2개의 TMC1 돌연변이(DFNA36)27,29,30,31,32,및 캐비티 내의 잔류물을 위한 시스테인 돌연변이체의 선택적 변형MET 채널특성(28)을수용하며, 이는 MET 채널의 투과 경로로서 기능할 수 있음을 나타낸다. TMC 단백질에 있는 이 예측한 구멍의 큰 규모는 MET 채널을 침투하는 큰 분자의 기능을 설명할 수 있었습니다. MET 채널이 비정상적으로 큰 투과 경로를 포함하고 TMC1에서 관찰된 공동의 크기의 한계를 밀어내기 위해, 우리는 더 큰 분자를 가진 코르티 이식의 기관에서 섭취 실험을 수행하는 프로토콜을 개발, 3 kDa dextran 형광으로 텍사스 레드로 표지.
Dextran은 알파 1,6 글리코시딕 결합에 의해 결합된 많은 D-포도당 분자로 구성된 복잡한 분지 다당류입니다. 물의 높은 용해도, 낮은 세포 독성 및 생체 불활성은 여러 세포 과정을 연구할 수있는 다목적 도구입니다. 또한, 덱스렌은 다양한 크기와 형광으로 여러 가지 색상의 형광로 표지로 제공됩니다. 형광표지덱스트랜스는 세포 및 조직 투과성 연구33,34,다중 세포 시스템35,36,및 신경 추적37,38에서내분비증을 연구하는 데 일반적으로 사용된다. 청각 분야에서, 덱스렌 분자는 또한 코르티39,40의친칠라 기관에서 강렬한 소음에 노출 된 후 세포 세포 접합의 중단 및 청각 감각 상피 무결성의 손실을 평가하는 데 사용되었습니다.
이 작품에서, 우리는 뮤린 내이 모발 세포에서 의 한 부분의 관세포 실험을 수행하고 내이 모발 세포 MET 채널의 투과 경로의 크기를 탐구하기 위해 가장 작은 (3 및 10 kDa) 형광 덱스 트랜스의 일부의 특성을 이용했다. 또한, 우리는 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (LSM) 880을 사용하여 에어리스캔 검출기가 장착되어 입체 및 청각 모발 세포의 세포체에서 형광 덱젠을 시각화하고 국소화했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

모발 세포 메카노트랜스덕션(MET) 채널은 청력에 중요한 역할을 합니다. 그러나, MET의 분자 정체성 및 구조 정보는 알려지지 않은 남아 있습니다. 모발 세포의 전기 생리학적 연구는 MET 채널이 큰 전도도를 가지며 일부 스타일 염료 및 텍사스 적색 표지 된 아미노 글리코 시드 항생제를 포함하여 상대적으로 큰 형광 양이온 분자에 투과성임을 밝혔다. 이 프로토콜에서, 우리는 기능적 MET 채널을 위한 분석하기 위하여 이용될 수 있는 Corti 이식의 기관의 머리 세포에 있는 형광 덱스트랜스의 픽업을 구상하고 평가하는 방법을 기술합니다. 우리는 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱스른이 1-2 시간 배양 후 기능성 청각 모발 세포를 구체적으로 라벨로 표시한다는 것을 발견했습니다. 특히, 3 kDa dextran은 기능성 MET 채널이 존재할 때 두 개의 짧은 스테레오실리아 행을 라벨하고 확산 패턴으로 세포체에 축적한다. 라벨링의 추가 소포 같은 패턴은 모발 세포와 주변 지지 세포의 세포체에서 관찰되었다. 우리의 데이터는 3 kDa 텍사스-레드 dextran가 세포 염료 관전자를 위한 2개의 통로를 구상하고 공부하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 건의합니다; 기능성 MET 채널 및 내분비증을 통한 모발 세포 특이적 진입 경로, 더 큰 덱스렌에 사용할 수 있는 패턴.

우리는 텍사스 레드 (dextran-TR)로 표지 된 3 kDa dextran 형광으로 야생 형 산후 - 6 (P6) 마우스에서 코르티 방종의 장기를 2 시간 배양 한 후 모발 세포의 강력하고 구체적인 라벨링을 관찰했습니다(그림 2A-B). Dextran 라벨링은 코르티 의 기관의 기저, 중간 및 정점 영역에서 내부 및 외부 모발 세포(IHC 및 OHC)에서 관찰되었다(도2B).
<p...

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Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

여기서, 우리는 기능성 메카노트랜스덕션 채널을 가진 청각 모발 세포에서 3 kDa 텍사스 레드 라벨 덱젠의 섭취를 시각화하는 방법을 제시한다. 또한, 3-10 kDa의 덱스 트랜스는 모발의 내분비증과 코르티 장기의 지지 세포를 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

라이브 및 기능성 뮤린 달팽이관 모발 세포의 덱젠 라벨링 및 섭취량

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

이 프로토콜의 전반적인 목표는 기능성 메카노 트랜스유도 채널을 가진 살아있는 머리 세포에 있는 텍사스 Red로 표기된 정규 dextran 형광의 uptake를 공부하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 3킬로달톤 텍사스 레드 엑스트라른이 살아있는 모발 세포에서 메카노트랜스유도채널 기능을 평가하는 데 사용될 수 있다는 것이다. 달팽이관을 수확하려면, 산후 6마우스의 두개골을 Leibovitz의 L-15 배지가 들어 있는 60mm 배양 접시에 넣고 외과 가위를 사용하여 앞쪽 끝에서 두개골의 후불 끝까지 그리고 외부 청각 운하를 가로질러 피상적 인 절단을합니다.코를 향해 피부를 접어 두개골을 노출하고 두개골의 전면과 눈선을 가로 질러 뒤에서 절개를합니다. 두개골을 두 반으로 분리하고 작은 주걱을 사용하여 뇌를 제거하십시오. 측두골뼈를 관찰할 수 있을 때, 작은 가위를 사용하여 이 뼈 주위를 절단하여 조직을 소비합니다.신선한 L-15 배지를 함유한 35mm 접시에 현세적인 뼈를 담그고 넓은 필드 접안렌즈와 외부 교대 전류 할로겐 광원이 장착된 스테레오 현미경 아래에 접시를 놓습니다. 집게를 사용하여 주변 달팽이관 조직, 반 원형 운하 및 전정 기관을 제거하십시오. 달팽이관이 해부되고 신선한 L-15 미디어가있는 새로운 접시에 놓이면 외과 용 집게를 사용하여 둥근 창에 펑크 상처 1 개와 정색 달팽이관 부위의 천자 1 개를 만듭니다.모든 달팽이관이 수확되면, 신선한 L-15 배지의 200 마이크로 리터를 포함하는 9 웰 유리 우울증 플레이트의 우물에 조직을 배치합니다. 격리된 조직의 dextran 라벨링의 경우 각 샘플의 배지를 200 마이크로리터의 신선한 L-15 배지로 잘 교체하여 형광컨의 밀리리터당 2밀리그램으로 보충됩니다. 실온에서 2시간, 분당 25회 회전을 빛으로부터 보호하는 25도의 기울어진 각도로 3차원 셰이커로 배양합니다.인큐베이션이 끝나면 HBSS로 1회, 세척당 2분간 중형으로 1회 세척합니다. 두 번째 세척 후 실온에서 30분 동안 4%의 파라포름알데히드로 표본을 수정한 다음 HBSS에서 빠르고 부드러운 세척 2개를 넣습니다. 두 번째 세척 후, 미세 팁 집게를 사용하여 달팽이관 뼈, 나선형 인대 및 지각 막을 제거하고 HBSS에서 코르티의 고립 된 장기를 세척하십시오.모발 세포의 조직이 이 단계에서 쉽게 손상될 수 있기 때문에 투명한 지각막을 제거할 때 각별한 주의를 기울이십시오. F-actin에 라벨을 붙이려면 PBS에서 0.5%트리톤 X-100으로 샘플을 투과화하여 빛으로부터 보호되는 실온에서 30분 동안 형광라벨이 부착된 팔로이드를 100~200희석으로 보충한다. 인큐베이션이 끝나면 PBS에서 단일 세척을 시연한 대로 세척당 신선한 HBSS로 2~3회 세척합니다.적절한 장착 매체를 사용하여 코르티 조직의 장기를 유리 현미경에 장착하여 모발 스테레오실리아 측면을 위로 밀어 내고 63X 오일 침지 목표를 사용하여 형광 공초점 현미경에 샘플을 이미지화합니다. 텍사스 레드와 형광3킬로달톤 의 형광과 2 시간 배양 후, 야생 유형 산후 날 6 마우스에서 코르티의 기관은 내부와 외부 머리 세포 모두의 견고하고 특정 라벨을 보여줍니다. 모발 세포 스테레오실리아 및 세포 체의 화상 진찰은 그들의 세포 바디에 있는 3 킬로달톤 dextran 텍사스 Red를 통합한 그 세포만이 또한 그들의 입체의 형광 표시를 보여주었다는 것을 밝힙니다.중요한 것은, 메카노트랜스유도 채널이 있는 짧은 스테레오실리아 행의 끝에서 농축과 함께 입체를 따라 균일한 형광 신호가 관찰된다. 모발 세포의 세포 본체와 인접한 지지 세포의 소포와 같은 구조는 또한 dextran 텍사스 레드도 내분비증에 의해 채택 될 수 있음을 시사 관찰된다. 더 큰 10 킬로달톤 덱스트랜스는 또한 모발 세포의 세포 체및 지지 세포의 세포 체에서 소포와 같은 패턴을 생성했습니다.특히, 칼슘 첼라토르 또는 메카노트랜스덕션 채널 차단제의 존재는 모발 세포에서 3킬로달톤 엑스트라 텍사스 레드의 스테레오실리아 라벨링과 섭취를 방지합니다. 소포와 같은 패턴은 여전히 메카노트랜스덕션 채널 봉쇄가 있는 상황에서 관찰되고 있지만, 이러한 섭취 패턴은 기능적인 MET 채널과무관임을 나타냅니다. 코르티 조직의 장기를 주의 깊게 해부하고 이미징 조직을 장착하기 전에 모발 세포의 적절한 방향을 확인하는 것이 매우 중요합니다.살아있는 및 기능성 모발 세포의 dextran 라벨링 후, 고정 된 조직의 면역 염색은 관심있는 단백질의 특정 세포 유형을 식별하기 위해 수행 될 수있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

연구

생체공학

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

셀 라벨 및 초상 자성 산화철 나노 입자로 타겟팅

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

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<em&gt; 체외</em쥐의 추간판의&gt; 장기 문화 모델

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

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2 층 미세 플랫폼에서 애기 모종의 루트 머리 형태를 이미징

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

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조직 공학 응용 프로그램에 대 한 제어 형태학과 3 차원 Poly(ε-caprolactone) 장비의 전기 글 녹아

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

장 줄기와 틈새 세포의 기능 분석을 위한 Organoid 재구성 분석 결과 (오 라)

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

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Falcarindiol 인간 중간 엽 줄기 세포에 의해 포함 된 새로운 지질 코팅 나노 입자의

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

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라이브 셀에서 동시 레이저 스캐닝 공초점 및 원자력 현미경 검사(Conpokal) 근처

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

형광 염료 표지 리포솜의 In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake의 준비, 투여 및 평가

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...