Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Vi takker Vincent Schram fra NICHD mikroskopi og bildekjerne for å bistå i confocal bildeoppkjøpet, og Tsg-Hui Chang for uvurderlig hjelp med kolonihåndtering og musomsorg. Denne forskningen ble støttet av Intramural Research Program of the NINDS, NIH, Bethesda, MD, til K.J.S. A.B. ble støttet av Intramural Research Program of the NINDS, NIH, og av en Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship fra intramural forskningsprogram av NIDCD.

Dyrepleie og eksperimentelle prosedyrer ble utført etter retningslinjene for pleie og bruk av laboratoriedyr, som ble godkjent av Animal Care and Use Committee ved National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Animal protocol #1336 til KJS).
1. Mus
<ol><li>Sett et par avl par Avl par Avl par C57BL/6J villtype å avle i dyreanlegget for å kontrollere fødselsdatoen til kullene og holde styr på alderen på valpene.</li>
</ol>2. Cochleae disseksjon
<ol><l...

Denne protokollen beskriver hvordan man utfører opptakseksperimenter i murine organ av Corti explants med 3 kDa dextran Texas Red. Målet med denne metoden er å teste om molekyler større enn andre tidligere testet også var i stand til å spesifikt merke auditive hårceller og gjennomsyre gjennom MET-kanalen. Lignende eksperimentelle protokoller har tidligere blitt brukt til å evaluere permeabiliteten av hårceller til andre fluorescerende fargestoffer som FM1-43 (0,56 kDa)12,<sup c...

Hårcellene i det indre øret er sensoriske celler som oppdager lyd og skjulte de mekanisk stimuli i elektriske signaler, som til slutt tolkes av hjernen vår. Disse cellene har en trappformet bunt av tre rader med actin-baserte filamenter, kjent som stereocilia, som stikker ut fra deres apikale region1,2. De mekaniske stimuli avlede stereocilia filamenter mot den lengste raden og utløse åpningen av mechanotransduction (MET) kanaler3. Åpningen av MET-kanalene fører til en tilstrømning av kationer som depolariserer cellen og signaliserer dermed frigjøring av synapsevesikler i hårcellens basalområde.
De biofysiske egenskapene til MET-kanalen som er avgjørende for hørselen, har blitt mye preget. Blant andre egenskaper er disse kanalene kationiske selektive og har en relativt stor ledning (150–300 pS i lav Ca2 +)4,5,6,7,8,9,10. Bemerkelsesverdig, store fluorescerende molekyler som FM1-43 og Texas Red-merket aminoglykosider er permente blokkere av MET-kanalen, noe som resulterer i akkumulering i håret cellekroppen som kan visualiseres ved hjelp av fluorescens mikroskopi11,12,13,14. Omvendt har den molekylære identiteten og strukturen til MET-kanalen og dens permeasjonsvei vært unnvikende. Økende eksperimentelle bevis indikerer at transmembrane-lignende kanal protein 1 (TMC1) er en del av MET-kanalen i modne hårceller15,16,17,18,19. Mutasjoner i transmembrane-lignende kanal 1 (TMC1) endre MET kanal egenskaper19,20,21,22 og forårsake døvhet. I tillegg lokaliserer TMC1 til stedet for MET-kanalen18,23 og samhandler med tips-linken som er ansvarlig for å overføre den mekaniske kraften til MET-kanalen24,25. Videre har nyere bioinformatikkanalyse identifisert TMC-proteinene som evolusjonære relatert til mechanosensitive kanaler TMEM63/OSCA proteiner og TMEM16 proteiner, en familie av kalsiumaktiverte klorid kanaler og lipid scramblases26,27,28. En strukturell modell av TMC1 basert på forholdet mellom disse proteinene avslørte tilstedeværelsen av et stort hulrom ved protein-lipid-grensesnittet27. Dette hulrommet har de to TMC1 mutasjoner som forårsaker autosomal dominerende hørselstap (DFNA36)27,29,30,31,32, og selektiv modifisering av cysteinmutanter for rester i hulrommet endre MET kanalegenskaper28, noe som indikerer at det kan fungere som permeation banen til MET-kanalen. Den store størrelsen på dette spådde hulrommet i TMC-proteiner kan forklare evnen til store molekyler til å gjennomsyre MET-kanalen. For å teste spådommen om at MET-kanalen inneholder en uvanlig stor permeasjonsvei og for å presse grensene for størrelsen på hulrommet observert i TMC1, utviklet vi en protokoll for å utføre opptakseksperimenter i orgelet corti explants med et større molekyl, 3 kDa dextran fluorescerende merket med Texas Red.
Dextran er et komplekst forgrenet polysakkarid bestående av mange D-glukosemolekyler bundet av alfa-1,6 glykosidiske koblinger. Denhøye løseligheten i vann, lav celletoksisitet og bioinertitet gjør det til et allsidig verktøy for å studere flere cellulære prosesser. I tillegg er dextran tilgjengelig i et bredt spekter av størrelser og fluorescerende merket med fluoropforer av flere farger. Fluorescerende merket dextrans brukes vanligvis i celle- og vevpermeabilitetsforskning33,34, for å studere endocytose i flere cellulære systemer35,36, og for neural sporing37,38. I hørselsfeltet har dextran molekyler også blitt brukt til å vurdere forstyrrelsen av cellecellekrysset og tap av auditiv sensorisk epitelintegritet etter eksponering for intens støy i chinchillaorganet Corti39,40.
I dette arbeidet utnyttet vi egenskapene til noen av de minste (3 og 10 kDa) fluorescerende dextrans for å utføre opptakseksperimenter i murine indre øre hårceller og utforske størrelsen på permeasjonsbanen til den indre ørehårcellen MET kanal. I tillegg brukte vi et laserskannings konfokalmikroskop (LSM) 880 utstyrt med en Airyscan-detektor for å visualisere og lokalisere fluorescerende dextran ved stereocilia og cellekroppen av auditive hårceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

Hårcellen mechanotransduction (MET) kanal spiller en viktig rolle i hørselen. Imidlertid forblir den molekylære identiteten og strukturelle informasjonen til MET ukjent. Elektrofysiologiske studier av hårceller viste at MET-kanalen har en stor ledning og er gjennomtrengelig for relativt store fluorescerende kationiske molekyler, inkludert noen styrylfargestoffer og Texas Red-merket aminoglykosid antibiotika. I denne protokollen beskriver vi en metode for å visualisere og evaluere opptaket av fluorescerende dekstrans i hårceller i organet corti planter som kan brukes til å analyse for funksjonelle MET-kanaler. Vi fant ut at 3 kDa Texas Red-merket dextran spesifikt merker funksjonelle auditive hårceller etter 1-2 h inkubasjon. Spesielt 3 kDa dextran etiketter de to kortere stereocilia rader og akkumuleres i cellekroppen i et diffust mønster når funksjonelle MET kanaler er til stede. Et ekstra vesicle-lignende mønster for merking ble observert i cellekroppen av hårceller og omkringliggende støtteceller. Våre data tyder på at 3 kDa Texas-Red dextran kan brukes til å visualisere og studere to veier for cellulær hellopptak; en hårcellespesifikk inngangsrute gjennom funksjonelle MET-kanaler og endocytose, et mønster som også er tilgjengelig for større dextran.

Vi observerte robust og spesifikk merking av hårceller etter 2h inkubasjon av organ av Corti explants fra vill-type postnatal-dag-6 (P6) mus med 3 kDa dextran fluorescerende merket med Texas Red (dextran-TR) (Figur 2A-B). Dextran merking ble observert i både indre og ytre hårceller (IHC og OHC) på basal, midten og apikale regioner i orgelet Corti (Figur 2B).
Fluorescerende merket phalloidin ble br...

Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Her presenterer vi en metode for å visualisere opptaket av 3 kDa Texas Red-merket dextran i auditive hårceller med funksjonelle mechanotransduction kanaler. I tillegg kan dextrans på 3-10 kDa brukes til å studere endocytose i håret og støtte celler i orgelet Corti.

Dextran Merking og opptak i Live og funksjonell Murine Cochlear Hair Cells

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Det overordnede målet med denne protokollen er å studere opptaket av vanlige dextran fluorescerende merket med Texas Red i levende hårceller med funksjonelle mechanotransduction kanaler. Den største fordelen med denne teknikken er at de tre kilodalton Texas Red dextran kan brukes til å vurdere mechanotransduction kanalfunksjon i levende hårceller. For å høste sneglehuset, legg skallen på en postnatal dag seks mus i en 60 millimeter kulturrett som inneholder Leibovitz's L-15 medium og bruk kirurgisk saks for å lage et overfladisk kutt fra den fremre enden til den bakre enden av skallen og over de eksterne hørskanalene.Brett huden mot nesen for å eksponere kraniet og gjøre et snitt fra baksiden til forsiden av skallen og over øyelinjen. Skill skallen i to halvdeler og bruk en liten slikkepott for å fjerne hjernen. Når de timelige beinene kan observeres, bruk liten saks til å kutte rundt disse beinene for å avgiftsdirektoratet vevet.Senk de timelige beinene i den 35 millimeter lange fatet som inneholder ferskT L-15-medium, og plasser fatet under et stereomikroskop utstyrt med et bredt felt okular og en ekstern vekselstrøm halogenlyskilde. Bruk tang for å fjerne det omkringliggende cochleavevet, halvsirkelformede kanaler og vestibulære organer. Når sneglehuset er dissekert og plassert i en ny tallerken med friske L-15-medier, bruk kirurgiske tang for å lage ett punkteringssår på det runde vinduet og en punktering i den aktuelle cochlearegionen.Når alle sneglehuset er høstet, legg vevet i en brønn av en ni-brønns glassdepresjonsplate som inneholder 200 mikroliter friskt L-15 medium. For dextran merking av isolert vev, erstatte mediet fra hver prøve godt med 200 mikroliter av frisk L-15 medium supplert med to milligram per milliliter av fluorescens konjugert dextran av interesse. Inkuber prøvene i to timer ved romtemperatur og 25 rotasjoner per minutt i en tredimensjonal shaker i en skrå vinkel på 25 grader beskyttet mot lys.På slutten av inkubasjonen, vask vevet en gang med middels og en gang med HBSS i to minutter per vask. Etter den andre vasken, fest prøvene i 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved romtemperatur etterfulgt av to raske og milde vasker i HBSS. Etter den andre vasken, bruk fine spisse tang for å fjerne cochleabenet, spiralleddet og den tectoriale membranen og vask det isolerte organet Corti i HBSS.Vær ekstra forsiktig når du fjerner den gjennomsiktige tektoriske membranen, siden vevet på hårcellene lett kan bli skadet i løpet av dette trinnet. For å merke F-actin, permeabilize prøvene i 0,5% Triton X-100 i PBS supplert med 100 til 200 fortynning av fluorescerende merket falloidin i 30 minutter ved romtemperatur beskyttet mot lys. På slutten av inkubasjonen, vask vevet to til tre ganger i frisk HBSS per vask som demonstrert etterfulgt av en enkelt vask i PBS.Bruk et passende monteringsmedium til å montere organet av Corti vev på glassmikroskop glir håret stereocilia sider opp og bilde prøvene på et fluorescerende konfokal mikroskop ved hjelp av 63X olje nedsenking mål. Etter en to-timers inkubasjon med tre kilodalton dextran fluorescerende konjugert med Texas Red, organ av Corti explant fra vill type postnatal dag seks mus demonstrere en robust og spesifikk merking av både indre og ytre hårceller. Avbildning av hårcellestereotroen og cellelegemene avslører at bare de cellene som har innlemmet tre kilodalton dextran Texas Red i cellekroppen, også demonstrerte fluorescerende merking av stereocilia.Viktigere, et jevnt fluorescerende signal observeres langs stereocilia med berikelse på tuppene av de kortere stereocilia-radene der mechanotransduction-kanalen er plassert. Vesicle-lignende strukturer i cellekroppen av hårcellene og de nærliggende støttecellene observeres også som tyder på at dextran Texas Red også kan tas opp av endocytose. Større 10 kilodalton dextrans produserte også et vesikkellignende mønster i cellekroppen av hårceller og støtteceller.Spesielt forhindrer tilstedeværelsen av en kalsiumchelator eller mechanotransduction kanalblokkere stereocilia merking og opptaket av tre kilodalton dextran Texas Red i hårceller. Det vesikkellignende mønsteret observeres fortsatt i nærvær av mechanotransduction kanalblokade, men indikerer at dette mønsteret av opptak er uavhengig av funksjonelle MET-kanaler. Det er svært viktig å dissekere organet av Corti vev nøye og for å bekrefte riktig orientering av hårcellene før du monterer vevet for avbildning.Etter dextran merking av levende og funksjonelle hårceller, kan immunstaining av det faste vevet utføres for å identifisere bestemte celletyper av proteiner av interesse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Cell Merking og målretting med superparamagnetiske Iron Oxide Nanopartikler

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

en<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell av Murine mellomvirvelskive

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging roten håret morfologi av Arabidopsis frøplanter i en to-lags Microfluidic plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelt Electrospinning skriving av tredimensjonale Poly(ε-caprolactone) stillaser med kontrollerbar Morphologies for Tissue Engineering programmer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Organoid rekonstituering analysen (ORA) for funksjonell analyse av Intestinal stammen og nisje celler

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Opptak av nye Lipid-belagt nanopartikler som inneholder Falcarindiol av menneskelige stamceller

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Høyoppløselig bilde av Nuclear Dynamics i levende celler under Uniaxial strekk belastning

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Nær samtidig laserskanning konfokal og atomkraft mikroskopi (Conpokal) på levende celler

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Tilberedning, administrering og vurdering av in vivo vevsspesifikt cellulært opptak av fluorescerende fargestoffmerkede liposomer

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...