Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Agradecemos a Vincent Schram, do núcleo de microscopia e imagem nichd, por ajudar na aquisição de imagens confocais, e tsg-Hui Chang por ajuda inestimável com a gestão de colônias e cuidados com ratos. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do NINDS, NIH, Bethesda, MD, para K.J.S. A.B. foi apoiado pelo Programa de Pesquisa Intramural do NINDS, NIH, e por uma Bolsa de Pós-Doutorado Robert Wenthold do programa de pesquisa intramural do NIDCD.

Os cuidados com animais e procedimentos experimentais foram realizados seguindo as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais, que foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Acidente Vascular Cerebral (Protocolo Animal #1336 ao KJS).
1. Ratos
<ol><li>Coloque um par de pares de c57BL/6J do tipo selvagem para procriar na instalação animal para controlar a data de nascimento das ninhadas e acompanhar a idade dos...

Este protocolo descreve como realizar experimentos de captação em órgão surina de explants corti com 3 kDa dextran Texas Red. O objetivo deste método é testar se moléculas maiores do que outras testadas anteriormente também foram capazes de rotular especificamente células ciliadas auditivas e permear através do canal MET. Protocolos experimentais semelhantes foram usados anteriormente para avaliar a permeabilidade das células ciliadas para outros corantes fluorescentes, como FM1-43 (0,56 kDa)...

As células ciliadas do ouvido interno são as células sensoriais que detectam som e encobrem os estímulos mecanicamente em sinais elétricos, que são finalmente interpretados pelo nosso cérebro. Essas células têm um feixe em forma de escadaria de três fileiras de filamentos à base de actin, conhecidos como estereoilia, que se projetam de sua região apical1,2. Os estímulos mecânicos desviam os filamentos estereoilia em direção à linha mais longa e desencadeiam a abertura dos canais de mecanotransdução (MET)3. A abertura dos canais MET leva a um fluxo de cárinos que despolariza a célula e, consequentemente, sinaliza a liberação de vesículas de sinapse na região basal da célula cilia.
As propriedades biofísicas do canal MET essenciais para a audição foram extensivamente caracterizadas. Entre outras propriedades, esses canais são seletivos cationic e possuem uma realização relativamente grande (150-300 pS em baixa Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Notavelmente, grandes moléculas fluorescentes como aminoglicoglicolados de marca vermelha do Texas são bloqueadores perversos do canal MET, resultando em seu acúmulo no corpo de células ciliadas que podem ser visualizados usando microscopia de fluorescência11,12,13,14. Por outro lado, a identidade molecular e a estrutura do canal MET e seu caminho de permeação permaneceram evasivos. Evidências experimentais crescentes indicam que a proteína do canal transmembrana 1 (TMC1) é um componente do canal MET em células ciliadas maduras15,16,17,18,19. Mutações no canal 1 (TMC1) alteram as propriedades do canal MET19,20,21,22 e causam surdez. Além disso, o TMC1 localiza o site do canal MET18,23 e interage com o tip-link responsável por transmitir a força mecânica para o canal MET24,25. Além disso, a recente análise bioinformática identificou as proteínas TMC como evolutivas relacionadas aos canais mecanosensíveis TMEM63/OSCA e as proteínas TMEM16, uma família de canais de cloreto ativados com cálcio e mexidas lipídicas26,27,28. Um modelo estrutural do TMC1 baseado na relação entre essas proteínas revelou a presença de uma grande cavidade na interface protein-lipídica27. Esta cavidade abriga as duas mutações TMC1 que causam perda auditiva autossômica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, e modificação seletiva de mutantes de cisteína para resíduos nas propriedades do canal met da cavidade alter28,indicando que poderia funcionar como o caminho de permeação do canal MET. O grande tamanho dessa cavidade prevista em proteínas TMC poderia explicar a capacidade de grandes moléculas de permear o canal MET. Para testar a previsão de que o canal MET contém um caminho de permeação extraordinariamente grande e para empurrar os limites do tamanho da cavidade observada no TMC1, desenvolvemos um protocolo para realizar experimentos de captação no órgão de explantas corti com uma molécula maior, 3 kDa dextran fluorescente rotulado com Texas Red.
Dextran é um complexo polissacarídeo ramificado composto por muitas moléculas de glicose D amarradas por ligações glicosídicas alfa-1,6. Sua alta solubilidade em água, baixa toxicidade celular e bioinertidade fazem dela uma ferramenta versátil para estudar vários processos celulares. Além disso, o dextran está disponível em uma ampla gama de tamanhos e fluorescentemente rotulado com fluoroforres de várias cores. Dextrans rotulado fluorescente são comumente utilizados na pesquisa de permeabilidade celular e tecidual33,34, para estudar endocitose em múltiplos sistemas celulares35,36, e para rastreamento neural37,38. No campo auditivo, moléculas dextran também têm sido usadas para avaliar a interrupção da junção celular-célula e perda da integridade auditiva sensorial de epitélio após exposição ao ruído intenso no órgão chinchilla de Corti39,40.
Neste trabalho, exploramos as propriedades de algumas das menores (3 e 10 kDa) fluorescentes dextrans para realizar experimentos de captação em células de ouvido internos de murina e explorar o tamanho da via de permeação do canal MET da célula capilar interna do ouvido. Além disso, usamos um microscópio confocal de varredura a laser (LSM) 880 equipado com um detector de airyscan para visualizar e localizar dextran fluorescente na estereoilia e no corpo celular de células cilias auditivas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

O canal de mecanotransção de células para cabelo (MET) desempenha um papel importante na audição. No entanto, a identidade molecular e as informações estruturais do MET permanecem desconhecidas. Estudos eletrofisiológicos de células ciliadas revelaram que o canal MET tem uma grande condução e é permeável a moléculas cationic fluorescentes relativamente grandes, incluindo alguns corantes isofiis e antibióticos de aminoglicolado com rótulo vermelho do Texas. Neste protocolo, descrevemos um método para visualizar e avaliar a captação de dextrans fluorescente em células ciliadas do órgão de corti explantas que podem ser usadas para ensaio para canais MET funcionais. Descobrimos que 3 kDa Texas Red-labeled dextran especificamente rotula células ciliadas auditivas funcionais após 1-2 h de incubação. Em particular, 3 kDa dextran rotula as duas linhas de estereoilia mais curtas e se acumula no corpo celular em um padrão difuso quando os canais MET funcionais estão presentes. Um padrão adicional de rotulagem semelhante a vesícula foi observado no corpo celular das células ciliadas e nas células de suporte circundantes. Nossos dados sugerem que 3 kDa Texas-Red dextran pode ser usado para visualizar e estudar duas vias para a captação de tinta celular; uma rota de entrada específica para células para celular através de canais MET funcionais e endocitose, um padrão também disponível para dextran maior.

Observamos rotulagem robusta e específica de células ciliadas após 2h de incubação de órgão séti de camundongos pós-parto-6 (P6) do tipo selvagem com 3 kDa dextran fluorescente rotulados com Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). A rotulagem Dextran foi observada em células capilares internas e externas (IHC e OHC) nas regiões basal, média e apical do órgão de Corti (Figura 2B).
A phalloi...

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Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Aqui, apresentamos um método para visualizar a captação de 3 kDa Texas Red-labeled dextran em células ciliadas auditivas com canais funcionais de mecanotransdução. Além disso, a dextrans de 3 a 10 kDa pode ser usada para estudar endocitose em cabelos e células de apoio do órgão de Corti.

Etiquetagem Dextran e Captação em Células Capilares Murina Coclear

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

O objetivo geral deste protocolo é estudar a absorção de dextran regular fluorescentemente rotulado com Texas Red em células ciliadas vivas com canais funcionais de mecanotransdução. A principal vantagem dessa técnica é que o dextran vermelho de três kilodalton texas pode ser usado para avaliar a função do canal de mecanotransdução em células ciliar vivas. Para colher a cóclea, coloque o crânio de um rato de seis dias pós-natal em um prato de cultura de 60 milímetros contendo o meio L-15 de Leibovitz e use uma tesoura cirúrgica para fazer um corte superficial da extremidade anterior até a extremidade posterior do crânio e através dos canais auditivos externos.Dobre a pele em direção ao nariz para expor o crânio e faça uma incisão da parte de trás para a frente do crânio e através da linha dos olhos. Separe o crânio em duas metades e use uma pequena espátula para remover o cérebro. Quando os ossos temporais podem ser observados, use pequenas tesouras para cortar em torno desses ossos para extirpara o tecido.Submergir os ossos temporais na antena de 35 milímetros contendo meio L-15 fresco e coloque o prato sob um microscópio estéreo equipado com uma ocular de campo largo e uma fonte externa de luz halógena de corrente alternada. Use fórceps para remover o tecido coclear circundante, canais semi-circulares e órgãos vestibulares. Uma vez que a cóclea tenha sido dissecada e colocada em um novo prato com mídia L-15 fresca, use fórceps cirúrgicos para fazer uma perfuração na janela redonda e uma punção na região coclear apical.Quando toda a cóclea tiver sido colhida, coloque o tecido em um poço de uma placa de depressão de vidro de nove poços contendo 200 microliters de meio L-15 fresco. Para rotulagem dextran dos tecidos isolados, substitua o meio de cada amostra bem por 200 microliters de meio L-15 fresco suplementado com dois miligramas por mililitro da fluorescência conjugada dextran de interesse. Incubar as amostras por duas horas à temperatura ambiente e 25 rotações por minuto em um agitador tridimensional em um ângulo inclinado de 25 graus protegido da luz.No final da incubação, lave os tecidos uma vez com média e uma vez com HBSS por dois minutos por lavagem. Após a segunda lavagem, fixar os espécimes em 4% de paraformaldeído por 30 minutos em temperatura ambiente, seguido por duas lavagens rápidas e suaves no HBSS. Após a segunda lavagem, use fórceps finos para remover o osso coclear, o ligamento espiral e a membrana tectorial e lavar o órgão isolado de Corti no HBSS.Tome cuidado extra ao remover a membrana tectorial transparente, uma vez que o tecido nas células ciliares pode ser facilmente danificado durante esta etapa. Para rotular a F-actina, permeabilize as amostras em 0,5% Triton X-100 em PBS complementado com diluição de 100 a 200 de fhalloidina fluorescente por 30 minutos à temperatura ambiente protegida da luz. No final da incubação, lave os tecidos duas a três vezes em HBSS fresco por lavagem, como demonstrado seguido de uma única lavagem em PBS.Use um meio de montagem apropriado para montar o órgão de tecidos Corti em microscópio de vidro desliza estereócilia capilar para cima e imagem as amostras em um microscópio confocal fluorescente usando o objetivo de imersão de óleo 63X. Após uma incubação de duas horas com três kilodalton dextran fluorescentemente conjugados com Texas Red, órgão de Corti explante do tipo selvagem pós-natal dia seis camundongos demonstram uma rotulagem robusta e específica de células ciliadas internas e externas. Imagens da estereócilia das células ciliadas e corpos celulares revelam que apenas as células que incorporaram três kilodalton dextran Texas Red em seu corpo celular também demonstraram rotulagem fluorescente de suas estereócilias.É importante ressaltar que um sinal fluorescente uniforme é observado ao longo da estereócilia com enriquecimento nas pontas das linhas estereócilias mais curtas onde o canal de mecanotransdução está localizado. Estruturas semelhantes a vesículas no corpo celular das células ciliadas e nas células de apoio vizinhas também são observadas sugerindo que o Dextran Texas Red também pode ser tomado por endocitose. Dextrans maiores de 10 quilodaltons também produziu um padrão semelhante à vesícula no corpo celular das células ciliárias e células de suporte.Notavelmente, a presença de um cortador de canais de chelador de cálcio ou mecanotransdução impede a rotulagem de estereócilia e a absorção de três kilodalton dextran Texas Red em células ciliadas. O padrão semelhante à vesícula ainda é observado na presença de bloqueio de canais de mecanotransdução, no entanto, indicando que esse padrão de absorção é independente dos canais MET funcionais. É muito importante dissecar o órgão do tecido Corti cuidadosamente e confirmar a orientação adequada das células ciliares antes de montar o tecido para a imagem.Após a rotulagem dextran de células ciliar vivas e funcionais, a imunostenção do tecido fixo pode ser realizada para identificar tipos celulares específicos de proteínas de interesse.

Research

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Bioengenharia

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