Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Мы благодарим Винсента Шрама (Vincent Schram) из nicHD микроскопии и ядра изображений за помощь в приобретении конфокальных изображений, а Tsg-Hui Chang за неоценимую помощь в управлении колониями и по уходу за мышами. Это исследование было поддержано Intramural исследовательской программы NINDS, NIH, Bethesda, MD, к K.J.S. A.B. была поддержана Программа интрамуральных исследований NINDS, NIH, и Роберт Wenthold Postdoctoral стипендию от программы интрамуральных исследований NIDCD.

Уход за животными и экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных, которые были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Национального института неврологических расстройств и инсульта...

Этот протокол описывает, как выполнять эксперименты поглощения в мурин органа Корти explants с 3 kDa dextran Texas Red. Цель этого метода состоит в том, чтобы проверить, были ли молекулы больше, чем другие ранее протестированные, также способными специально маркировать слуховые волосковые клетки и п?...

Волосковые клетки внутреннего уха являются сенсорными клетками, которые обнаруживают звук и скрытые механически стимулы в электрических сигналах, которые в конечном счете интерпретируются нашим мозгом. Эти клетки имеют лестницу формы пучок из трех рядов actin основе нити, известный как стереосциты, которые выступают из их apical области1,2. Механические стимулы отклонять стереоцильные нити к длинному ряду и вызвать открытие механотрансдукции (MET) каналов3. Открытие каналов MET приводит к притоку катионов, которые деполяризуют клетку и, следовательно, сигнализирует о высвобождении синепсных пузырьков в базальной области волосяной клетки.
Биофизические свойства канала MET, необходимые для слуха, были широко охарактеризованы. Среди других свойств, эти каналы катионные селективного и имеют относительно большую проводимость (150-300 рС в низких Ca2 "4,5,6,7,8,9,10. Примечательно, что большие флуоресцентные молекулы, такие как FM1-43 и Техас Красной маркировкой аминогликозиды являются permeant блокаторы канала MET, в результате чего их накопление в теле волосяных клеток, которые могут быть визуализированы с помощью флуоресценции микроскопии11,12,13,14. И наоборот, молекулярная идентичность и структура канала МЕТ и его проницаемый путь остаются неуловимыми. Все больше экспериментальных данных указывает на то, что трансмембранно-подобный канал белка 1 (TMC1) является компонентом канала MET в зрелых волосковых клетках15,16,17,18,19. Мутации в трансмемембранном канале 1 (TMC1) изменяют свойства канала MET19,20,21,22 и вызывают глухоту. Кроме того, TMC1 локализуется на сайте канала MET18,23 и взаимодействует с наконечником-ссылкой, ответственной за передачу механической силы на канал MET24,25. Кроме того, недавний анализ биоинформатики определил белки TMC как эволюционные, связанные с механочувствительными каналами TMEM63/OSCA белков и TMEM16 белков, семейство кальциевых каналов хлорида и липидных скремблазов26,27,28. Структурная модель TMC1, основанная на взаимосвязи между этими белками, выявила наличие большой полости при белково-липидном интерфейсе27. Эта полость гавани две мутации TMC1, которые вызывают аутосомно-доминантной потери слуха (DFNA36)27,29,30,31,32, и селективной модификации цистеина мутантов для остатков в полости изменить СВОЙСТВА канала МЕТ28, указывая, что он может функционировать как пермяцкий путь канала MET. Большой размер этой предсказанной полости в белках TMC может объяснить способность больших молекул проникать в канал MET. Чтобы проверить предсказание о том, что канал MET содержит необычайно большой проницательный путь и раздвинуть пределы размера полости, наблюдаемые в TMC1, мы разработали протокол для проведения экспериментов по поглощению в органе Эксплансов Корти с более крупной молекулой, 3 kDa dextran флуоресцентно помечены Техас Красный.
Dextran представляет собой сложный разветвленный полисахарид, состоящий из многих молекул D-глюкозы, связанных альфа-1,6 гликозидными связями. Его высокая растворимость в воде, низкая токсичность клеток и биоинертность делают его универсальным инструментом для изучения нескольких клеточных процессов. Кроме того, dextran доступен в широком диапазоне размеров и флуоресцентно помечены флюорофорами нескольких цветов. Флуоресцентно помечены dextrans обычно используются в клетках и ткани проницаемости исследований33,34, для изучения эндоцитоза в нескольких клеточных систем35,36, и для нервной трассировки37,38. В слуховой области, dextran молекулы также были использованы для оценки нарушения клеточного соединения и потери слуховой сенсорной целостности эпителия после воздействия интенсивного шума в органе шиншиллы Корти39,40.
В этой работе мы использовали свойства некоторых из самых маленьких (3 и 10 kDa) флуоресцентных dextrans для выполнения экспериментов поглощения в мурин внутренних волосковых клеток уха и изучить размер проницательного пути внутреннего уха волос ячеек MET канала. Кроме того, мы использовали лазерный сканирование конфокального микроскопа (LSM) 880, оснащенного детектором Airyscan для визуализации и локализации флуоресцентного декесцентного декесцентного на стереосилиях и клеточном теле слуховых волосковых клеток.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

Канал механотрансдукции волосковых клеток (MET) играет важную роль в слухе. Тем не менее, молекулярная идентичность и структурная информация MET остаются неизвестными. Электрофизиологические исследования волосковых клеток показали, что канал MET имеет большую проводимость и проницаем к относительно большим флуоресцентным катионным молекулам, включая некоторые красители из стирила и техасские антибиотики аминогликозид. В этом протоколе мы описываем метод визуализации и оценки поглощения флуоресцентного декстранта в волосяных клетках органа корти-эксрастенив, которые могут быть использованы для оценки функциональных каналов MET. Мы обнаружили, что 3 kDa Техас Красная маркировка dextran специально этикетки функциональных слуховых волосяных клеток после 1-2 ч инкубации. В частности, 3 kDa dextran маркирует два коротких стереоционных ряда и накапливается в клеточном теле в диффузном рисунке при появке функциональных каналов MET. Дополнительная везикум-подобная картина маркировки наблюдалась в клеточном теле волосковых клеток и окружающих поддерживающих клеток. Наши данные показывают, что 3 kDa Техас-Красный dextran может быть использован для визуализации и изучения двух путей для клеточного поглощения красителя; волосяных клеток конкретных входных маршрутов через функциональные каналы MET и эндоцитоза, шаблон также доступны для больших dextran.

Мы наблюдали надежную и специфическую маркировку волосковых клеток после 2h инкубации органа Корто высаженных растений из диких типа послеродового дня-6 (P6) мышей с 3 kDa dextran флуоресцентно помечены Техас Красный (dextran-TR) (Рисунок 2A-B). Dextran маркировки наблюдалась как...

Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Здесь мы представляем метод визуализации поглощения 3 kDa Техас Красная маркировка dextran в слуховых волосяных клеток с функциональными каналами механотрансдукции. Кроме того, декстран т 3-10 кДа может быть использован для изучения эндоцитоза волос и поддерживающих клеток органа Корти.

Dextran маркировки и поглощения в живых и функциональных Murine кохлеарных волосяных клеток

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Общая цель этого протокола заключается в изучении поглощения регулярных декстран флуоресцентно помечены Техас Красный в живых волосковых клеток с функциональными каналами механотрансдукции. Основным преимуществом этой техники является то, что три килодалтона Texas Red dextran могут быть использованы для оценки функции механотрансдукционных каналов в живых волосяных клетках. Чтобы собрать улитку, поместите череп послеродовой день шесть мыши в 60 миллиметров культуры блюдо, содержащее L-15 среды Лейбовица и использовать хирургические ножницы, чтобы сделать поверхностный разрез от переднего конца до заднего конца черепа и через внешние слуховые каналы.Сложите кожу к носу, чтобы разоблачить череп и сделать разрез от задней части до передней части черепа и через линию глаза. Разделить череп на две половины и использовать небольшой шпатель, чтобы удалить мозг. Когда височные кости можно наблюдать, используйте небольшие ножницы, чтобы разрезать вокруг этих костей, чтобы акциз ткани.Погрузите височные кости в 35-миллиметровую тарелку, содержащую свежую среду L-15, и поместите блюдо под стерео микроскоп, оснащенный широким полевым окуляром и внешним чередующимся источником галогенного света. Используйте типсы для удаления окружающих кохлеарных тканей, полукруглых каналов и вестибулярных органов. После того, как улитка была вскрыта и помещена в новое блюдо со свежими L-15 сми, использовать хирургические типсы, чтобы сделать один прокол раны на круглое окно и один прокол в апической кохлеарный регион.Когда все улитки были собраны, поместите ткань в колодец из девяти хорошо стеклянной пластины депрессии, содержащей 200 микролитров свежей L-15 среды. Для декстранной маркировки изолированных тканей замените среду из каждого образца хорошо с 200 микролитров свежей L-15 среды дополнены двумя миллиграммами на миллилитр флуоресценции конъюгированных декстран интереса. Инкубировать образцы в течение двух часов при комнатной температуре и 25 оборотов в минуту в трехмерном шейкере под наклонным углом 25 градусов, защищенном от света.В конце инкубации, мыть ткани один раз со средним и один раз с HBSS в течение двух минут за стирку. После второй стирки, исправить образцы в 4%paraformaldehyde в течение 30 минут при комнатной температуре следуют два быстрых и нежных моет в HBSS. После второй стирки используйте тонкие миппы кончика, чтобы удалить кохлеарную кость, спиральную связку и текториальную мембрану и промыть изолированный орган Корти в HBSS.Будьте особенно заботы при удалении прозрачной текторной мембраны, так как ткань на волосковых клетках может быть легко повреждена во время этого шага. Чтобы маркировать F-актин, пронизывают образцы в 0.5%Triton X-100 в PBS дополнены от 100 до 200 разбавления флуоресцентно помечены фаллоидин в течение 30 минут при комнатной температуре защищены от света. В конце инкубации, мыть ткани два-три раза в свежем HBSS за стирку, как попродемонстрировано следуют одной стирки в PBS.Используйте соответствующую монтажную среду для установки органа тканей Корти на стеклянный микроскоп слайды волос стереоцилия сторон вверх и изображение образцов на флуоресцентный конфокальный микроскоп с помощью 63X цели погружения масла. После двухчасовой инкубации с трехкилограммовым декстраном флуоресцентно спрягается с Texas Red, орган Corti explant из дикого типа послеродового дня шесть мышей демонстрируют надежную и специфическую маркировку как внутренних, так и внешних волосковых клеток. Изображение стереоцилии волосяных клеток и клеточных тел показывает, что только те клетки, которые включили три килодальтон dextran Texas Red в их клеточном теле, также продемонстрировали флуоресцентную маркировку их стереоцилии.Важно отметить, что единый флуоресцентный сигнал наблюдается вдоль стереоцилии с обогащением на кончиках коротких стереоцилий рядов, где находится канал механотрансдукции. Vesicle-как структуры в клеточном теле волосковых клеток и соседних вспомогательных клеток также наблюдается предполагая, что декстран Техас Красный также может быть принято эндоцитоз. Большие 10 килодальтон dextrans также производится пузырьков, как картина в клеточном теле волосковых клеток и вспомогательных клеток.Примечательно, что наличие хелатора кальция или блокаторов механотрансдукционного канала предотвращает маркировку стереоцилий и поглощение трех килодальтонного декстрана Texas Red в волосяных клетках. Однако везикулярная модель по-прежнему наблюдается при наличии блокады канала механотрансдукции, что указывает на то, что эта модель поглощения не зависит от функциональных каналов MET. Очень важно тщательно вскрыть орган ткани Корти и подтвердить правильную ориентацию волосковых клеток перед монтажом ткани для визуализации.После декстранной маркировки живых и функциональных волосковых клеток, иммуностеть фиксированной ткани может быть выполнена для выявления конкретных типов клеток белков, представляющих интерес.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Маркировка клеток и ориентации с Суперпарамагнитные наночастиц оксида железа

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

<em&gt; In Vitro</em&gt; Орган культуры Модель мышиной межпозвонкового диска

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Изображения корневого волоска морфология Arabidopsis саженцев в два слоя Microfluidic платформа

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Расплава Electrospinning написания трехмерных Poly(ε-caprolactone) леса с контролируемым морфологии тканей инженерных приложений

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Assay органоид растворения (ОРА) для функционального анализа кишечных стволовых и ниша клеток

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Усвоение новых липидов покрытием наночастиц, содержащих Falcarindiol, мезенхимальных стволовых клеток человека

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Сканирование с высоким разрешением ядерной динамики в живых клетках под напряжением Uniаксиального натяжения

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Рядом с одновременным лазерным сканированием конфокаловой и атомной микроскопии силы (Conpokal) на живых клетках

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Подготовка, введение и оценка тканеспецифического клеточного поглощения in vivo липосом, меченных флуоресцентным красителем

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...