Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
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Agradecemos a Vincent Schram del núcleo de microscopía e imágenes NICHD por ayudar en la adquisición de imágenes confocales, y a Tsg-Hui Chang por obtener una ayuda inestimable en la gestión de colonias y el cuidado de ratones. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de la NINDS, NIH, Bethesda, MD, a K.J.S.A.B. fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de la NINDS, NIH, y por una beca postdoctoral Robert Wenthold del programa de investigación intramuros del NIDCD.

El cuidado de los animales y los procedimientos experimentales se realizaron siguiendo las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio, que fueron aprobadas por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (Protocolo Animal #1336 a KJS).
1. Ratones
<ol><li>Establecer un par de parejas reproductoras de tipo salvaje C57BL/6J para reproduciren en las instalaciones de animales para controlar la fecha de...

Este protocolo describe cómo realizar experimentos de admisión en órgano murino de los explantes de Corti con 3 kDa dextran Texas Red. El objetivo de este método es probar si las moléculas más grandes que otras previamente probadas también fueron capaces de etiquetar específicamente las células vellosas auditivas y permear a través del canal MET. Protocolos experimentales similares se han utilizado previamente para evaluar la permeabilidad de las células pilosas a otros tintes fluorescentes como FM1-43 (0.56 k...

Las células pilosas del oído interno son las células sensoriales que detectan el sonido y encubren los estímulos mecánicos en las señales eléctricas, que en última instancia son interpretadas por nuestro cerebro. Estas células tienen un haz en forma de escalera de tres filas de filamentos a base de actina, conocidos como estereocilia, que sobresalen de su región apical1,2. Los estímulos mecánicos desvían los filamentos estereocilia hacia la fila más larga y activan la apertura de los canales3de mechanotransducción (MET). La apertura de los canales MET conduce a una afluencia de cationes que despolariza la célula y, en consecuencia, señala la liberación de vesículas de sinapsis en la región basal de la célula pilosa.
Las propiedades biofísicas del canal MET esenciales para la audición se han caracterizado ampliamente. Entre otras propiedades, estos canales son selectivos catiónicos y tienen una conductancia relativamente grande (150–300 pS en Ca2+bajo)4,5,6,7,8,9,10. Sorprendentemente, grandes moléculas fluorescentes como FM1-43 y aminoglucósidos etiquetados con Texas Red son bloqueadores permeantes del canal MET, lo que resulta en su acumulación en el cuerpo de la célula pilosa que se puede visualizar mediante microscopía de fluorescencia11,12,13,14. Por el contrario, la identidad molecular y la estructura del canal MET y su vía de permeación han permanecido esquivas. El aumento de la evidencia experimental indica que la proteína canal transmembrana 1 (TMC1) es un componente del canal MET en células pilosas maduras15,16,17,18,19. Las mutaciones en el canal transmembrana 1 (TMC1) alteran las propiedades del canal MET19,20,21,22 y causan sordera. Además, TMC1 localiza el sitio del canal MET18,23 e interactúa con el enlace de punta responsable de transmitir la fuerza mecánica al canal MET24,25. Además, el reciente análisis bioinformático ha identificado las proteínas TMC como evolutivas relacionadas con los canales mecanosensibles TMEM63/OSCA y las proteínas TMEM16, una familia de canales de cloruro activados por calcio y escramblas de lípidos26,27,28. Un modelo estructural de TMC1 basado en la relación entre estas proteínas reveló la presencia de una gran cavidad en la interfaz proteína-lípido27. Esta cavidad alberga las dos mutaciones TMC1 que causan pérdida auditiva autosómica dominante (DFNA36)27,29,30,31,32, y la modificación selectiva de mutantes de cisteína para residuos en la cavidad alteran las propiedades del canal MET28, lo que indica que podría funcionar como la vía de permeación del canal MET. El gran tamaño de esta cavidad pronosticada en proteínas TMC podría explicar la capacidad de las moléculas grandes para impregnar el canal MET. Para probar la predicción de que el canal MET contiene una vía de permeación inusualmente grande y para empujar los límites del tamaño de la cavidad observado en TMC1, desarrollamos un protocolo para realizar experimentos de absorción en el órgano de Corti explantes con una molécula más grande, 3 kDa dextran fluorescente etiquetado con Texas Red.
Dextran es un polisacárido ramificado complejo compuesto por muchas moléculas de D-glucosa unidas por enlaces glucosídicos alfa-1,6. Su alta solubilidad en agua, baja toxicidad celular y bioinertidad lo convierten en una herramienta versátil para estudiar varios procesos celulares. Además, dextran está disponible en una amplia gama de tamaños y etiquetado fluorescentemente con fluoróforos de varios colores. El dextrans etiquetado fluorescentemente se utiliza comúnmente en la investigación de permeabilidad celular y tisular33,34, para estudiar la endoctitosis en múltiples sistemas celulares35,36, y para el rastreo neural37,38. En el campo auditivo, las moléculas de desnción también se han utilizado para evaluar la interrupción de la unión celular-célula y la pérdida de la integridad del epitelio sensorial auditivo después de la exposición al ruido intenso en el órgano chinchilla de Corti39,40.
En este trabajo, aprovechamos las propiedades de algunos de los dextrans fluorescentes más pequeños (3 y 10 kDa) para realizar experimentos de absorción en células pilosas del oído interno murina y explorar el tamaño de la vía de permeación del canal MET de la célula del cabello del oído interno. Además, utilizamos un microscopio confocal de escaneo láser (LSM) 880 equipado con un detector Airyscan para visualizar y localizar el deextrano fluorescente en la estereocilia y el cuerpo celular de las células vellosas auditivas.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

El canal de mecanotransducción de células pilosas (MET) desempeña un papel importante en la audición. Sin embargo, la identidad molecular y la información estructural del Met siguen siendo desconocidas. Los estudios electrofisiológicos de las células pilosas revelaron que el canal MET tiene una gran conductividad y es permeable a moléculas catiónicas fluorescentes relativamente grandes, incluyendo algunos tintes de estilo y antibióticos aminoglucósidos etiquetados en rojo de Texas. En este protocolo, describimos un método para visualizar y evaluar la absorción de dextrans fluorescente en células pilosas del órgano de explantas Corti que se puede utilizar para realizar ensayos para canales MET funcionales. Encontramos que 3 kDa Texas Red-labeled dextran específicamente etiqueta células capilares auditivos funcionales después de 1–2 h de incubación. En particular, 3 kDa dextran etiqueta las dos filas de estereocilia más cortas y se acumula en el cuerpo celular en un patrón difuso cuando los canales MET funcionales están presentes. Se observó un patrón adicional similar a la vesícula de etiquetado en el cuerpo celular de las células pilosas y las células de soporte circundantes. Nuestros datos sugieren que 3 kDa Texas-Red dextran se puede utilizar para visualizar y estudiar dos vías para la aceptación del tinte celular; una ruta de entrada específica de células capilares a través de canales MET funcionales y endocitosis, un patrón también disponible para mayor demás.

Observamos etiquetado robusto y específico de las células pilosas después de 2h incubación de órgano de explantes de Corti de tipo salvaje postnatal-día-6 (P6) con 3 kDa dextran fluorescentemente etiquetado con Texas Red (dextran-TR) (Figura 2A-B). Se observó etiquetado Deextran tanto en células capilares internas como externas (IHC y OHC) en las regiones basal, media y apical del órgano de Corti(Figura 2B).
<p clas...

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Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Aquí, presentamos un método para visualizar la toma de 3 kDa Texas Red-labeled dextran en células vellosas auditivas con canales funcionales de mechanotransducción. Además, dextrans de 3-10 kDa se puede utilizar para estudiar la endococitosis en el cabello y las células de soporte del órgano de Corti.

Etiquetado y toma de Dextran en células de cabello cocleares de murine en vivo y funcionales

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

El objetivo general de este protocolo es estudiar la absorción de dextrán regularmente etiquetados fluorescentemente con Texas Red en células pilosas vivas con canales funcionales de mecanotransducción. La principal ventaja de esta técnica es que el dextrán de tres kilodalton Texas Red se puede utilizar para evaluar la función del canal de mecanotransducción en células pilosas vivas. Para cosechar la cóclea, coloque el cráneo de un ratón de seis días postnatales en un plato de cultivo de 60 milímetros que contenga el medio L-15 de Leibovitz y use tijeras quirúrgicas para hacer un corte superficial desde el extremo anterior hasta el extremo posterior del cráneo y a través de los canales auditivos externos.Dobla la piel hacia la nariz para exponer el cráneo y haz una incisión desde la parte posterior hasta la parte delantera del cráneo y a través de la línea del ojo. Separe el cráneo en dos mitades y use una pequeña espátula para extirpar el cerebro. Cuando se puedan observar los huesos temporales, utilice tijeras pequeñas para cortar alrededor de estos huesos para extirpar el tejido.Sumerja los huesos temporales en el plato de 35 milímetros que contiene el medio L-15 fresco y coloque el plato bajo un microscopio estéreo equipado con un ocular de campo ancho y una fuente de luz halógena de corriente alterna externa. Utilice fórceps para extraer el tejido coclear circundante, los canales semicirculares y los órganos vestibulares. Una vez que la cóclea ha sido diseccionada y colocada en un nuevo plato con medios frescos L-15, utilice fórceps quirúrgicos para hacer una herida punzante en la ventana redonda y una punción en la región coclear apical.Cuando se hayan cosechado todas las cócleas, coloque el tejido en un pozo de una placa de depresión de vidrio de nueve pozos que contenga 200 microlitros de medio L-15 fresco. Para el etiquetado de dextrán de los tejidos aislados, reemplace el medio de cada pozo de muestra por 200 microlitros de medio L-15 fresco complementado con dos miligramos por mililitro del dextrano conjugado de fluorescencia de interés. Incubar las muestras durante dos horas a temperatura ambiente y 25 rotaciones por minuto en un agitador tridimensional en un ángulo inclinado de 25 grados protegido de la luz.Al final de la incubación, lave los tejidos una vez con medio y una vez con HBSS durante dos minutos por lavado. Después del segundo lavado, fijar las muestras en 4%paraformaldehído durante 30 minutos a temperatura ambiente seguido de dos lavados rápidos y suaves en HBSS. Después del segundo lavado, utilice fórceps de punta fina para extraer el hueso coclear, el ligamento espiral y la membrana tectorial y lavar el órgano aislado de Corti en HBSS.Tenga especial cuidado al extraer la membrana tectorial transparente ya que el tejido de las células pilosas puede dañarse fácilmente durante este paso. Para etiquetar la F-actina, permeabilizar las muestras en 0.5%Triton X-100 en PBS complementado con 100 a 200 dilución de faloide con etiqueta fluorescente durante 30 minutos a temperatura ambiente protegida de la luz. Al final de la incubación, lave los tejidos de dos a tres veces en HBSS fresco por lavado, como se demuestra seguido de un solo lavado en PBS.Utilice un medio de montaje adecuado para montar el órgano de los tejidos Corti en un microscopio de vidrio, deslice los lados de la estereocía del cabello e imagine las muestras en un microscopio confocal fluorescente utilizando el objetivo de inmersión de aceite 63X. Después de una incubación de dos horas con tres kilodalton dextran conjugados fluorescentemente con Texas Red, órgano de Corti explant de tipo salvaje postnatal día seis ratones demuestran un etiquetado robusto y específico de las células del cabello interior y exterior. Las imágenes de la estereocilia de las células pilosas y los cuerpos celulares revelan que sólo aquellas células que han incorporado tres kilodalton dextran Texas Red en su cuerpo celular también demostraron el etiquetado fluorescente de su estereocilia.Es importante destacar que se observa una señal fluorescente uniforme a lo largo de la estereocilia con enriquecimiento en las puntas de las filas estereocilias más cortas donde se encuentra el canal de mecanotransducción. También se observan estructuras similares a las vesículas en el cuerpo celular de las células pilosas y las células auxiliares vecinas, lo que sugiere que dextran Texas Red también puede ser tomado por endocitosis. Más grande 10 kilodalton dextrans también produjo un patrón similar a la vesícula en el cuerpo celular de las células pilosas y las células de apoyo.En particular, la presencia de un quelante de calcio o bloqueadores de canales de mecanotransducción previene el etiquetado de estereocilias y la absorción de tres kilodalton dextran Texas Red en las células pilosas. El patrón similar a la vesícula todavía se observa en presencia de bloqueo del canal de mecanotransducción, sin embargo, lo que indica que este patrón de absorción es independiente de los canales funcionales del MET. Es muy importante diseccionar cuidadosamente el órgano del tejido Corti y confirmar la orientación adecuada de las células pilosas antes de montar el tejido para la toma de imágenes.Después del etiquetado de dextrán de las células pilosas vivas y funcionales, se puede realizar una inmunosumanidad del tejido fijo para identificar tipos celulares específicos de proteínas de interés.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

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Investigación

Bioingeniería

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Etiquetado Celular y Orientación con superparamagnético nanopartículas de óxido de hierro

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Escritura de Electrospinning de andamios Poly(ε-caprolactone) tridimensional con morfologías controlables para aplicaciones de ingeniería de tejidos del derretimiento

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