Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Vi tackar Vincent Schram från NICHD mikroskopi och bildbehandling kärna för att bistå i confocal bild förvärv, och Tsg-Hui Chang för ovärderlig hjälp med koloni förvaltning och möss vård. Denna forskning stöddes av Intramural Research Program of the NINDS, NIH, Bethesda, MD, till K.J.S. A.B. stöddes av Intramural Research Program of the NINDS, NIH, och av en Robert Wenthold Postdoctoral Fellowship från intramural forskningsprogram av NIDCD.

Djurskötseloch experimentella förfaranden utfördes enligt riktlinjerna för vård och användning av laboratoriedjur, som godkändes av Animal Care and Use Committee vid National Institute of Neurological Disorders and Stroke (Animal protocol #1336 till KJS).
1. Möss
<ol><li>Ställ in ett par avelpar av C57BL/6J vildtyp för att häcka i djuranläggningen för att kontrollera datum för födelse av kullarna och hålla reda på åldern på valparna.</li>
</ol>2. Coch...

Detta protokoll beskriver hur man utför upptag experiment i murine organ Corti explants med 3 kDa dextran Texas Red. Målet med denna metod är att testa om molekyler större än andra tidigare testats också kunde specifikt märka hörselhårceller och genomsyra genom MET-kanalen. Liknande experimentella protokoll har tidigare använts för att utvärdera permeabiliteten hos hårceller till andra fluorescerande färgämnen som FM1-43 (0,56 kDa)12,19,...

Innerörats hårceller är de sensoriska celler som detekterar ljud och döljer mekaniskt stimuli i elektriska signaler, som i slutändan tolkas av vår hjärna. Dessa celler har en trappa-formad bunt av tre rader av aktin-baserade glödtrådar, känd som stereocilia, som sticker ut från deras apical region1,2. Den mekaniska stimuli avleda stereocilia filament mot den längsta raden och utlösa öppnandet av mechanotransduction (MET) kanaler3. Öppnandet av MET kanaler leder till en tillströmning av katjoner som depolariserar cellen och följaktligen signalerar utsläpp av synaps blåsor i den basala regionen i hårcellen.
De biofysiska egenskaperna hos MET-kanalen som är nödvändig för hörseln har i stor utsträckning karakteriserats. Dessa kanaler är bland annat katjoniskt selektiva och har en relativt stor kontring (150–300 pS i låg Ca2+)4,5,6,7,8,9,10. Anmärkningsvärt, stora fluorescerande molekyler som FM1-43 och Texas Rödmärkta aminoglykosider är permeant blockerare av MET kanalen, vilket resulterar i deras ackumulering i hårcellen kroppen som kan visualiseras med fluorescensmikroskopi11,12,13,14. Omvänt har den molekylära identiteten och strukturen hos MET-kanalen och dess genommektväg förblivit svårfångad. Ökande experimentella bevis tyder på att transmembrane-liknande kanal protein 1 (TMC1) är en komponent i MET kanalen i mogna hårceller15,16,17,18,19. Mutationer i transmembrane-liknande kanal 1 (TMC1) ändra MET kanal egenskaper19,20,21,22 och orsaka dövhet. Dessutom lokaliserar TMC1 till platsen för MET-kanalen18,23 och interagerar med den spets-länk som ansvarar för att överföra den mekaniska kraften till MET-kanalen24,25. Dessutom har den senaste bioinformatikanalysen identifierat TMC-proteinerna som evolutionära relaterade till de mechanokänsliga kanalerna TMEM63/OSCA-proteiner och TMEM16-proteinerna, en familj av kalciumaktiverade kloridkanaler och lipidförvrängningar26,27,28. En strukturell modell av TMC1 baserat på förhållandet mellan dessa proteiner visade förekomsten av en stor hålighet vid protein-lipid gränssnitt27. Detta hålighet hyser de två TMC1 mutationer som orsakar autosomal atypiska dominerande hörselnedsättning (DFNA36)27,29,30,31,32, och selektiv modifiering av cystein mutanter för rester i hålrummet ändra MET kanal egenskaper28, vilket tyder på att det kan fungera som permeation väg MET kanalen. Den stora storleken på denna förutspådde hålighet i TMC proteiner kan förklara förmågan hos stora molekyler att genomsyra MET kanalen. För att testa förutsägelsen att MET-kanalen innehåller en ovanligt stor permeationsväg och för att tänja på gränserna för storleken på håligheten som observerats i TMC1, utvecklade vi ett protokoll för att utföra upptag experiment i organet i Korti explants med en större molekyl, 3 kDa dextran fluorescerande märkt med Texas Red.
Dextran är en komplex grenade polysackarider bestående av många D-glukosmolekyler bundna av alfa-1,6 glykosidiska kopplingar. Dess höga löslighet i vatten, låg celltoxicitet och bioinertitet gör det till ett mångsidigt verktyg för att studera flera cellulära processer. Dessutom finns dextran i ett brett spektrum av storlekar och fluorescerande märkta med fluorofforer av flera färger. Fluorescerande märkta dextrans används ofta i cell och vävnad permeabilitet forskning33,34, att studera endocytos i flera cellulära system35,36, och för neural spårning37,38. Inom hörselfältet har dextranmolekyler också använts för att bedöma störningarna i cellcellkorsningen och förlusten av hörselsensorisksensorisk tjusateletintegritet efter exponering för intensivt buller i chinchillaorganet i Corti39,40.
I detta arbete utnyttjade vi egenskaperna hos några av de minsta (3 och 10 kDa) fluorescerande dextrans att utföra upptag experiment i murine innerörat hårceller och utforska storleken på permeation vägen för innerörat hårcell MET kanal. Dessutom använde vi en laser-scanning confocal mikroskop (LSM) 880 utrustad med en Airyscan detektor för att visualisera och lokalisera fluorescerande dextran på stereocilien och cellkroppen av auditiva hårceller.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

Hårcellmechanotransduktion (MET) kanal spelar en viktig roll i hörseln. Den molekylära identiteten och den strukturella informationen i marknadsekonomisk status är dock fortfarande okänd. Elektrofysiologiska studier av hårceller visade att MET kanalen har en stor ledning och är genomsläpplig för relativt stora fluorescerande katjoniska molekyler, inklusive vissa styrylfärgämnen och Texas Röd-märkta aminoglykosid antibiotika. I detta protokoll beskriver vi en metod för att visualisera och utvärdera upptaget av fluorescerande dextrans i hårceller i organet i Kortti-utväxter som kan användas för att analysera funktionella MET-kanaler. Vi fann att 3 kDa Texas Rödmärkta dextran specifikt etiketter funktionella auditiva hårceller efter 1-2 h inkubation. I synnerhet etiketter 3 kDa dextran de två kortare stereociliaraderna och ackumuleras i cellkroppen i ett diffust mönster när funktionella MET-kanaler finns. Ytterligare vesicle-liknande mönster av märkning observerades i cellkroppen av hårceller och omgivande stödjande celler. Våra data tyder på att 3 kDa Texas-Red dextran kan användas för att visualisera och studera två vägar för cellulära färgning upptag; en hårcellspecifik ingångsväg genom funktionella MET-kanaler och endocytos, ett mönster som också finns tillgängligt för större dextran.

Vi observerade robust och specifik märkning av hårceller efter 2h inkubation av organ av Korti utväxter från vild-typ postnatal-day-6 (P6) möss med 3 kDa dextran lysrör märkt med Texas Red (dextran-TR)(Figur 2A-B). Dextran märkning observerades i både inre och yttre hårceller (IHC och OHC) på basala, mellersta och apical regioner av organet i Corti(figur 2B).
Fluorescerande märkt phalloidi...

Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Här presenterar vi en metod för att visualisera upptaget av 3 kDa Texas Rödmärkt dextran i auditiva hårceller med funktionella mechanotransduction kanaler. Dessutom kan dextrans av 3-10 kDa användas för att studera endocytos i hår och stödjande celler i organet i Corti.

Dextran Märkning och upptag i levande och funktionella murine cochlear hårceller

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Det övergripande målet med detta protokoll är att studera upptaget av regelbundna dextran fluorescerande märkt med Texas Red i levande hårceller med funktionella mechanotransduction kanaler. Den största fördelen med denna teknik är att de tre kilodalton Texas Red dextran kan användas för att bedöma mechanotransduction kanal funktion i levande hårceller. För att skörda hörselsnäckan, placera skallen av en postnatal dag sex mus i en 60 millimeter kultur maträtt som innehåller Leibovitz's L-15 medium och använda kirurgiska saxar för att göra en ytlig snitt från den främre änden till den bakre änden av skallen och över de externa hörselkanalerna.Vik huden mot näsan för att exponera kraniet och göra ett snitt från baksidan till framsidan av skallen och över ögonlinjen. Separera skallen i två halvor och använd en liten spatel för att ta bort hjärnan. När de temporala ben kan observeras, använd små saxar för att skära runt dessa ben till punktskatt vävnaden.Dränk ned de temporala benen i 35 millimeters skålen som innehåller färskt L-15 medium och placera skålen under ett stereomikroskop utrustat med ett brett fält okular och en extern växelström halogen ljuskälla. Använd tärna för att avlägsna den omgivande cochlearvävnaden, halvcirkulära kanaler och vestibulära organ. När snäckan har dissekeras och placeras i en ny maträtt med färska L-15 media, använd kirurgiska tlyktor för att göra en punktering sår på det runda fönstret och en punktering på den apikala cochlear regionen.När alla snäckor har skördats, placera vävnaden i en brunn av en nio-brunn glas depression tallrik som innehåller 200 mikroliter av färska L-15 medium. För dextranmärkning av de isolerade vävnaderna, ersätt mediet från varje prov väl med 200 mikroliter av färska L-15 medium kompletteras med två milligram per milliliter av fluorescens konjugerade dextran av intresse. Inkubera proven i två timmar i rumstemperatur och 25 rotationer per minut i en tredimensionell skakmaskin i en lutande vinkel på 25 grader som skyddas från ljus.Vid slutet av inkubationen tvättar du vävnaderna en gång med medium och en gång med HBSS i två minuter per tvätt. Efter den andra tvätten, fixera exemplaren i 4%paraformaldehyd i 30 minuter vid rumstemperatur följt av två snabba och skonsamma tvättar i HBSS. Efter den andra tvätten, använd fina spetstips för att ta bort cochlearbenet, spiralledbandet, och tectorialmembranet och tvätta det isolerade organet av Corti i HBSS.Var extra försiktig när du tar bort det transparenta tectorialmembranet eftersom vävnaden på hårcellerna lätt kan skadas under detta steg. För att märka F-aktin, permeabilisera proverna i 0,5%Triton X-100 i PBS kompletteras med 100 till 200 utspädning av fluorescerande märkt phalloidin i 30 minuter vid rumstemperatur skyddad från ljus. Vid slutet av inkubationen tvättar du vävnaderna två till tre gånger i färskt HBSS per tvätt som visats följt av en enda tvätt i PBS.Använd ett lämpligt monteringsmedium för att montera orgeln av Corti-vävnader på glasmikroskop glider hårstereocilia sidor upp och avbilda proverna på ett fluorescerande konfokalmikroskop med hjälp av 63X oljesänkningsmålet. Efter en två timmars inkubation med tre kilodalton dextran fluorescently konjugerat med Texas Red, organ av Corti explant från vilda typ postnatala dag sex möss visar en robust och specifik märkning av både inre och yttre hårceller. Imaging av hårcellen stereocilia och cell organ visar att endast de celler som har införlivat tre kilodalton dextran Texas Red i sin cell kropp också visat fluorescerande märkning av deras stereocilia.Viktigt är att en enhetlig fluorescerande signal observeras längs stereocilia med anrikning vid spetsarna på de kortare stereociliaraderna där mekanotransduction kanalen är belägen. Vesikelliknande strukturer i hårcellernas cellkropp och de angränsande stödcellerna observeras också som tyder på att dextran Texas Red också kan tas upp av endocytos. Större 10 kilodalton dextrans producerade också en vesicle-liknande mönster i cellkroppen av hårceller och stödjande celler.Noterbart är att förekomsten av en kalciumkelator eller mekanotransduktion kanalblockerare förhindrar stereocilia märkning och upptag av tre kilodalton dextran Texas Red i hårceller. Vesikelliknande mönstret fortfarande observeras i närvaro av mechanotransduction kanalblockad, dock, vilket indikerar att detta mönster av upptag är oberoende av funktionella MET-kanaler. Det är mycket viktigt att dissekera organet av Corti vävnad noggrant och att bekräfta korrekt orientering av hårcellerna innan montering av vävnaden för bildbehandling.Efter dextran märkning av levande och funktionella hårceller, kan immunfärgning av den fasta vävnaden utföras för att identifiera specifika celltyper av proteiner av intresse.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Cell Märkning och inriktning med superparamagnetiska nanopartiklar av järnoxid

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

En<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Kultur Modell av murina mellankotskivan

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging rotahåret morfologi av Arabidopsis plantor i en två-lagers mikroflödessystem plattform

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smälta Electrospinning handstil av tredimensionella Poly(ε-caprolactone) ställningar med kontrollerbar morfologier för Tissue Engineering program

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Organoid beredning analysen (ORA) för den funktionella analysen av Intestinal Stem och nisch celler

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Upptag av nya Lipid-belagd nanopartiklar som innehåller Falcarindiol av humana mesenkymala stamceller

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Hög upplöst avbildning av Kärndynamik i levande celler under Enaxiell drag belastning

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Nära Samtidig Laserscanning Confocal och Atomic Force Mikroskopi (Conpokal) på levande celler

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Beredning, administrering och bedömning av vävnadsspecifikt cellulärt upptag in vivo av fluorescerande färgämnesmärkta liposomer

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...