Name: dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells
Uploaded: 2020-02-08T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Biz confocal görüntü edinimi yardımcı olmak için NICHD mikroskobu ve görüntüleme çekirdek Vincent Schram teşekkür, ve Tsg-Hui Chang koloni yönetimi ve fare bakımı ile paha biçilmez yardım için. Bu araştırma NINDS, NIH, Bethesda, MD Intramural Araştırma Programı tarafından K.J.S. A.B. tarafından NINDS, NIH Intramural Araştırma Programı ve intramural araştırma programından Robert Wenthold Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmiştir. NIDCD'nin.

Hayvan bakımı ve deneysel prosedürler, Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (KJS'ye #1336 Hayvan protokolü) tarafından onaylanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı ile ilgili yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Fareler
<ol><li>Yavruların doğum tarihini kontrol etmek ve yavruların yaşını takip etmek için hayvan tesisinde üremek için C57BL/6J yabani tip üreme çiftleri bir çift ayarlayın.</li>...

Bu protokol, 3 kDa dextran Texas Red ile Corti ekstremitelerinin murine organında alım deneylerinin nasıl yapılacağını açıklar. Bu yöntemin amacı, daha önce test edilmiş diğerlerinden daha büyük moleküllerin aynı zamanda işitsel saç hücrelerini özel olarak etiketleyip MET kanalına nüfuz edip edemediğini test etmektir. Benzer deneysel protokoller daha önce FM1-43 (0,56 kDa)12,19,20 ve Texas Kırmızı et...

İç kulağın saç hücreleri, sesi algılayan ve elektrik sinyallerindeki mekanik uyaranları getkileyen duyu hücreleridir ve bu hücreler sonuçta beynimiz tarafından yorumlanır. Bu hücreler, stereosilya olarak bilinen ve apikal bölge1,2'dençıkıntı yapan üç sıra aktin bazlı filamentten oluşan merdiven şeklinde bir demet vardır. Mekanik uyaranlar stereositif filamentleri en uzun sıraya doğru saptırır ve meçakontransdüksiyon (MET) kanallarının açılmasını tetikler3. MET kanallarının açılması hücrede polarize ve dolayısıyla saç hücresibazal bölgede sinaps veziküllerin serbest sinyalleri katyon akını yol açar.
MET kanalının işitme için gerekli olan biyofiziksel özellikleri kapsamlı bir şekilde karakterize edilmiştir. Diğer özellikleri arasında, bu kanallar katyonik seçici ve nispeten büyük iletkenlik var (150-300 düşük Ca2 +pS )4,5,6,7,8,9,10. Dikkat çekici, FM1-43 ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozitler gibi büyük floresan moleküller MET kanalının perkast blokerler, floresan mikroskopi11,12,13,14kullanılarak görselleştirilebilir saç hücre gövdesinde bunların birikimi ile sonuçlanan . Tam tersine, MET kanalının moleküler kimliği ve yapısı ve geçirim yolu zor kalmıştır. Deneysel kanıt artan transmembran benzeri kanal protein 1 (TMC1) olgun saç hücrelerinde MET kanalının bir bileşeni olduğunu gösterir15,16,17,18,19. Transmembran benzeri kanal 1 'deki (TMC1) mutasyonlar MET kanal özelliklerini19,20,21,22 olarak değiştirir ve sağırlık lara neden olur. Buna ek olarak, TMC1 MET kanal18,23 sitesine lokalize ve MET kanal24,25mekanik kuvvet iletimi sorumlu ucu bağlantı ile etkileşime . Ayrıca, son biyoinformatik analizi mechanosensitive kanalları TMEM63/OSCA proteinleri ve TMEM16 proteinleri, kalsiyum aktive klorür kanalları ve lipid scramblases bir aile ile ilgili evrimsel olarak TMC proteinleri tespit etmiştir26,27,28. Bu proteinler arasındaki ilişkiye dayanan TMC1 yapısal bir model protein-lipid arayüzü nde büyük bir kavite varlığını ortaya27. Bu kavite otozomal dominant işitme kaybına neden iki TMC1 mutasyonu barındıran (DFNA36)27,29,30,31,32, ve kavite kalıntıları için sistein mutantların seçici modifikasyonMET kanal özellikleri değiştirmek28, MET kanalının permeasyon yolu olarak işlev olabileceğini belirten. TMC proteinlerinde öngörülen bu kavitenin büyük boyutu, büyük moleküllerin MET kanalına nüfuz etme yeteneğini açıklayabilir. MET kanalının alışılmadık derecede büyük bir permeasyon yolu içerdiği öngörüsünü test etmek ve TMC1'de gözlenen boşluğun büyüklüğünün sınırlarını zorlamak için Corti ekspertizlerinin organında daha büyük bir moleküle sahip 3 kDa dextran floresan ile alım deneyleri yapmak için bir protokol geliştirdik.
Dextran alfa-1,6 glikozidik bağlantılarla bağlanmış birçok D-glukoz molekülünden oluşan karmaşık dallı bir polisakkarittir. Su, düşük hücre toksisitesi ve biyoinertite yüksek çözünürlük çeşitli hücresel süreçleri incelemek için çok yönlü bir araç yapmak. Buna ek olarak, dextran boyutları geniş bir yelpazede mevcuttur ve floresan çeşitli renk floroforlar ile etiketlenmiş. Floresan etiketli dekstrans yaygın hücre ve doku geçirgenlik araştırma33,34, birden fazla hücresel sistemlerde endositon çalışması için kullanılır35,36, ve nöral izleme için37,38. İşitsel alanda, dextran molekülleri de hücre-hücre kavşak bozulması ve Corti chinchilla organında yoğun gürültüye maruz kaldıktan sonra işitsel duyusal epitel bütünlüğünün kaybı nı değerlendirmek için kullanılmıştır39,40.
Bu çalışmada, bazı küçük özellikleri istismar (3 ve 10 kDa) floresan deksan dextrans minten iç kulak saç hücrelerinde alım deneyleri gerçekleştirmek ve iç kulak saç hücresi MET kanalının permeasyon yolunun boyutunu keşfetmek için. Buna ek olarak, stereositya ve işitsel saç hücrelerinin hücre gövdesinde floresan dekstran görselleştirmek ve lokalize etmek için airyscan dedektörü ile donatılmış bir lazer tarama konfokal mikroskop (LSM) 880 kullandık.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#1.5 glass coverslips 18mm</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-0714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A12381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alpha Plan-Apochromat 63X/1.4 Oil Corr M27 objective</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>420780-9970-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amiloride hydrochloride</td>
			<td>EMD MILLIPORE</td>
			<td>129876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchwaver 3-dimensional Rocker</td>
			<td>Benchmarks scientific</td>
			<td>B3D5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J wild-type mice</td>
			<td>strain 000664</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell impermeant BAPTA tetrapotassium salt</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>B1204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Fluorescein, 10,000 MW, Anionic, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 10,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1863</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran, Texas Red, 3000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3328</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde Aqueous Solution EM Grade</td>
			<td>Electron microscopy science</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J or FIJI</td>
			<td>NIH</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersol 518F oil immersion media</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td>444970-9000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#39;s L-15 Medium, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>31415029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>neomycin trisulfate salt hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N6386</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10X), pH 7.4</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>70011069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phalloidin-CF405M</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>00034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Diamond antifade mounting media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>P36970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slide</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22-037-246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Black 2.3 SP1 software</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td><a href="https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html" target="_blank">https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</a></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dextran labeling and uptake in live and functional murine cochlear hair cells

Saç hücreli meçakondüksiyon (MET) kanalı işitmede önemli bir rol oynar. Ancak MET'nin moleküler kimliği ve yapısal bilgileri bilinmemektedir. Saç hücrelerinin elektrofizyolojik çalışmalar MET kanalı büyük bir iletkenlik olduğunu ve nispeten büyük floresan katyonik moleküllere geçirilebilir olduğunu ortaya koymuştur, bazı stratil boyalar ve Texas Kırmızı etiketli aminoglikozit antibiyotikler de dahil olmak üzere. Bu protokolde, fonksiyonel MET kanalları için analiz etmek için kullanılabilecek Corti eksbitkilerinin organının saç hücrelerindeki floresan dekstrans alımını görselleştirmek ve değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz bulduk 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran özellikle etiketler fonksiyonel işitsel saç hücreleri 1-2 h kuluçka sonra. Özellikle, 3 kDa dextran etiketler iki kısa stereocilia satır ve fonksiyonel MET kanalları mevcut olduğunda bir diffüz desen hücre gövdesinde birikir. Saç hücrelerinin hücre vücudunda ve destekleyici hücrelerde vezür benzeri bir etiketleme deseni gözlendi. Verilerimiz, hücresel boya alımı için iki yolu görselleştirmek ve incelemek için 3 kDa Texas-Red dextran'ın kullanılabileceğini göstermektedir; fonksiyonel MET kanalları ve endositoz yoluyla bir saç hücresi özgü giriş yolu, bir desen de büyük dextran için kullanılabilir.

Biz 3 kDa dextran floresan Texas Red (dextran-TR)(Şekil 2A-B)ile etiketli yabani tip postnatal-day-6 (P6) farelerden Corti ekstrenlerin organ 2h kuluçka sonra saç hücrelerinin sağlam ve spesifik etiketleme gözlendi. Dekstran etiketleme, Corti organının bazal, orta ve apikal bölgelerinde hem iç hem de dış saç hücrelerinde (IHC ve OHC) gözlendi(Şekil 2B).
Floresan etiketli phalloidin fil...

Watch this Scientific Journal Video about Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells at JoVE.com

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

Burada, fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile işitsel saç hücrelerinde 3 kDa Texas Kırmızı etiketli dextran alımını görselleştirmek için bir yöntem salıyoruz. Buna ek olarak, 3-10 kDa dekstrans saç endositoz ve Corti organının destekleyici hücreleri çalışmak için kullanılabilir.

Canlı ve Fonksiyonel Murine Koklear Saç Hücrelerinde Dekstran Etiketleme ve Alımı

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Bu protokolün genel amacı fonksiyonel mekanotransdüksiyon kanalları ile canlı saç hücrelerinde Texas Red ile etiketlenmiş düzenli dekstran floresan alımı incelemektir. Bu tekniğin en büyük avantajı üç kilodalton Texas Red dextran canlı saç hücrelerinde mechanotransdüksiyon kanal fonksiyonu değerlendirmek için kullanılabilir olmasıdır. Kokleayı hasat etmek için, doğum sonrası altı farenin kafatasını Leibovitz'in L-15 ortamını içeren 60 milimetrelik bir kültür yemeğine yerleştirin ve kafatasının arka ucuna ve dış işitsel kanallarboyunca ön uçtan yüzeysel bir kesim yapmak için cerrahi makas kullanın.Kafatası ortaya çıkarmak için burun doğru deri katlayın ve kafatasının ön ve göz hattı boyunca arka dan bir kesi yapmak. Kafatasını iki yarıya ayırın ve beyni çıkarmak için küçük bir spatula kullanın. Zamansal kemikler gözlemlenebilir zaman, doku çıkarmak için bu kemiklerin etrafında kesmek için küçük makas kullanın.Taze L-15 orta içeren 35 milimetrelik çanak temporal kemikleri batırın ve geniş bir alan gözlük ve harici alternatif akım halojen ışık kaynağı ile donatılmış bir stereo mikroskop altında çanak yerleştirin. Çevredeki koklear doku, yarım dairesel kanallar ve vestibüler organları kaldırmak için forceps kullanın. Koklea kesildikten ve taze L-15 media ile yeni bir tabağa yerleştirildikten sonra, yuvarlak pencerede bir delik yara ve apikal koklear bölgede bir delik yapmak için cerrahi forseps kullanın.Tüm kokleae hasat edildiğinde, taze L-15 orta 200 mikrolitre içeren dokuz kuyulu cam depresyon plaka bir kuyu içine doku yerleştirin. İzole dokuların dekstran etiketleme için, floresan konjuge dextran mililitre başına iki miligram ile takviye taze L-15 orta 200 mikrolitre ile iyi her örnekten orta değiştirin. Numuneleri oda sıcaklığında iki saat ve ışıktan korunan 25 derecelik eğimli bir açıyla üç boyutlu bir çalkalayıcıda dakikada 25 dönüş için kuluçkaya yatırın.Kuluçka sonunda, dokuları orta ve bir kez hbss ile yıkama başına iki dakika yıkayın. İkinci yıkamadan sonra numuneleri oda sıcaklığında 30 dakika boyunca %4 paraformaldehit ve ardından HBSS'de iki hızlı ve nazik yıkama ile düzeltin. İkinci yıkamadan sonra koklear kemiği, spiral ligamenti ve tektorial membranı çıkarmak ve HBSS'de Corti'nin izole organını yıkamak için ince uçlu çertikler kullanın.Saç hücrelerindeki doku bu adımda kolayca zarar görebildiği için şeffaf tektorial membranı çıkarırken ekstra özen. F-aktin etiketlemek için, pbs içinde 0.5% Triton X-100 içinde floresan phalloidin 100 ila 200 seyreltme ile desteklenen örnekleri permeabilize oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ışıktan korunan. Kuluçka sonunda, pbs tek bir yıkama ardından gösterildiği gibi yıkama başına taze HBSS dokuları 2-3 kez yıkayın.Corti dokularının organını cam mikroskop üzerine monte etmek için uygun bir montaj ortamı kullanın saç stereocilia yanları yukarı yaslanır ve 63X yağ daldırma hedefini kullanarak örnekleri floresan konfokal mikroskobun üzerinde görüntüleyin. Texas Red ile konjuge üç kilodalton dekstran floresan ile iki saatlik bir kuluçka sonra, yabani tip postnatal gün altı fareler Corti explant organı hem iç hem de dış saç hücrelerinin sağlam ve özel etiketleme göstermektedir. Saç hücresi stereocilia ve hücre organlarının görüntüleme sadece kendi hücre vücudunda üç kilodalton dextran Texas Red dahil olan bu hücrelerin de stereocilia floresan etiketleme gösterdi ortaya koymaktadır.Daha da önemlisi, mechanotransdüksiyon kanalının bulunduğu kısa stereositif sıraların uçlarında zenginleştirme ile stereosita boyunca tek tip floresan sinyal gözlenir. Saç hücrelerinin hücre vücudunda vezikül benzeri yapılar ve komşu destek hücreleri de dextran Texas Red de endositon tarafından alınabilir düşündüren gözlenmiştir. Daha büyük 10 kilodalton dekstrans da saç hücreleri ve destekleyen hücrelerin hücre vücudunda vezikül benzeri bir desen üretti.Özellikle, bir kalsiyum şelatör veya mekotransdüksiyon kanal blokerleri varlığı stereocilia etiketleme ve saç hücrelerinde üç kilodalton dextran Texas Red alımını önler. Vezikül benzeri desen hala mechanotransdüksiyon kanalı abluka varlığında gözlenen, ancak, alım bu desen fonksiyonel MET kanalları bağımsız olduğunu gösteren. Corti dokusunun organını dikkatle incelemek ve görüntüleme için doku monte etmeden önce saç hücrelerinin doğru yönünü doğrulamak çok önemlidir.Canlı ve fonksiyonel saç hücrelerinin dekstran etiketleme sonra, sabit doku immünboyama ilgi proteinlerin belirli hücre türlerini belirlemek için yapılabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles

Hücre Etiketleme ve Süperparamanyetik Demir Oksit Nanopartiküller ile Hedefleme

Targeted delivery of cells and therapeutic agents would benefit a wide range of biomedical applications by concentrating the therapeutic effect at the ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

bir<em&gt; İn Vitro</emKemirgen İntervertebral Disk&gt; Organ Kültürü Modeli

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Üç boyutlu Poly(ε-caprolactone) İskele kontrol edilebilir türleri morfoloji ile Electrospinning yazma doku mühendisliği uygulamaları için erime

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

The Organoid Reconstitution Assay ORA for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

Fonksiyonel analiz bağırsak kök ve niş hücre Organoid sulandırma tahlil (ORA)

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Falcarindiol tarafından insan mezenkimal kök hücre içeren yeni Lipid kaplı nano tanecikleri alımını

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

High-resolution Imaging of Nuclear Dynamics in Live Cells under Uniaxial Tensile Strain

Tek eksenli çekme gerinim altında canlı hücrelerde nükleer dinamiklerin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi

Extracellular mechanical strain is known to elicit cell phenotypic responses and has physiological relevance in several tissue systems. To capture the ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Canlı Hücrelerde Eşzamanlı Lazer Tarama Konfokal ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (Conpokal) Yakınında

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Floresan Boya Etiketli Lipozomların İn Vivo Dokuya Özgü Hücresel Alımının Hazırlanması, Uygulanması ve Değerlendirilmesi

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...