Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

وقد دعم هذا العمل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 21771103، 21977047)، مؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة جيانغسو (المنحة رقم BK20160639) وبرنامج شوانغتشوانغ في مقاطعة جيانغسو.

1. إنتاج البروتين
<ol><li>
استنساخ الجينات
	<ol>
<li>شراء الجينات الترميز للبروتين الفائدة (POI): Ubiquitin، Rubredoxin (RD)51،وحدة السليلوز ملزمة (CBM)، dockerin-X المجال (XDoc) والتماسك من فلافيلولاينس Ruminococcus،التبغ حفر فيروس (TEV) البروتياز، الإيلاستين مثل البولي ببتيدات (ELPs).</li>
		<li>أداء تفاع...

لقد وصفنا بروتوكولًا لعملية التركيب الحيوي الأنزيمي وشل حركة البروتين المتعدد البروتين وتحققنا من تصميم البروتين المتعدد بواسطة SMFS المستندة إلى AFM. توفر هذه المنهجية منهجًا جديدًا لبناء البروتين البوليمر في تسلسل مصمم ، والذي يكمل الأساليب السابقة لهندسة البروتين المتعدد البروتين والت...

بالمقارنة مع البوليمرات الاصطناعية ، والبروتينات الطبيعية متعددة المجالات لديها بنية موحدة مع عدد وتسيطر عليها بشكل جيد ونوع من النطاقات الفرعية1. هذه الميزة عادة ما يؤدي إلى تحسين الوظيفة البيولوجية والاستقرار2،3. وقد تم تطوير العديد من النهج، مثل السيستين المستندة إلى اقتران السندات ثنائي كبريتيد وتكنولوجيا الحمض النووي المؤتلف، لبناء مثل هذا البروتين المبلمرة مع مجالات متعددة4،5،6،7. ومع ذلك ، فإن الطريقة الأولى تؤدي دائمًا إلى تسلسل عشوائي وغير منضبط ، والأخيرة تؤدي إلى مشاكل أخرى ، بما في ذلك صعوبة التعبير المفرط للبروتينات السامة والكبيرة الحجم وتنقية البروتين المعقد مع العامل المساعد والإنزيمات الحساسة الأخرى.
لمواجهة هذا التحدي، ونحن تطوير طريقة الأنزيمية التي تترافق مونومر البروتين معا للبوليمر / البروتين المتعدد بطريقة تدريجية باستخدام بروتين ليغاز OaAEP1 جنبا إلى جنب مع TEV البروتياز8،9. OaAEP1 هو endopeptidase صارمة وفعالة. يمكن ربط بروتينين covalently كما Asn-Gly-Leu تسلسل (NGL) من خلال اثنين من التالتيني من قبل OaAEP1 في أقل من 30 دقيقة إذا كان N-terminus هو بقايا جلي ليو (GL) والآخر منها C-terminus هو مخلفات NGL10. ومع ذلك ، فإن استخدام OaAEP1 فقط لربط مونومر البروتين يؤدي إلى بروتين البوليمر مع تسلسل غير المنضبط مثل طريقة الاقتران القائمة على السيستين. لذلك ، نقوم بتصميم N-terminus لوحدة البروتين مع موقع بروتياز TEV قابل للإزالة بالإضافة إلى بقايا الليسين كـ ENLYFQ/G-L-POI. قبل انشقاق TEV، لن تشارك محطة N في ربط OaAEP1. ومن ثم يتم كشف بقايا GL في N-terminus ، والتي تتوافق مع ربط OaAEP1 ، بعد انشقاق TEV. وهكذا، حققنا طريقة التركيب الحيوي الأنزيمي متتابعة من البروتين المتعدد مع تسلسل تسيطر عليها بشكل جيد نسبيا.
هنا ، يمكن استخدام طريقة التوليف الأنزيمية خطوة بخطوة في إعداد عينة البروتين ، بما في ذلك تسلسل تسيطر عليها وغير المنضبط ، وتجميد البروتين للدراسات جزيء واحد كذلك ، وخاصة بالنسبة للنظام المعقد مثل metalloprotein.
وعلاوة على ذلك، تسمح لنا تجارب SMFS المستندة إلى AFM بتأكيد بناء البوليمر البروتيني واستقراره على مستوى الجزيء الواحد. الفئاب الطيفي أحادية الجزيء، بما في ذلك AFM، ملاقط بصرية وملاقط مغناطيسي، هو أداة عامة في تكنولوجيا النانو للتلاعب بالجزيء الحيوي ميكانيكيا وقياس استقرارها11،12،13،14،15،16،17،18،19،20. وقد استخدمت على نطاق واسع AFM جزيء واحد في دراسة البروتين (الأمم المتحدة) قابلة للطي21،22،23،24،25، وقياس قوة مستقبلات ليغاند التفاعل26،27،28،29،30،31،32،33،34 ،34، 35، السندات الكيميائية غير العضوية20،36،37،38،39،40،41،42،43والمعادن ligand السندات في metalloprotein44،45،46،47،48،49، 50 . هنا، يتم استخدام AFM جزيء واحد للتحقق من تسلسل البروتين متعدد البروتين توليفها على أساس إشارة البروتين تتكشف المقابلة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

وقد تم تطوير تقنيات الشبهة الكيميائية والبيولوجية بسرعة في السنوات الأخيرة وتسمح ببناء البوليمرات البروتينية. ومع ذلك ، فإن عملية بلمرة البروتين التي تسيطر عليها هي دائما تحديا. هنا ، قمنا بتطوير منهجية أنزيمية لبناء البروتين المبلمر خطوة بخطوة في تسلسل يتم التحكم فيه بعقلانية. في هذه الطريقة، C-terminus من مونومر البروتين هو NGL لاقتران البروتين باستخدام OaAEP1(Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases)1) في حين أن N-terminus كان TEV قابل للفك (فيروس التبغ حفر) موقع الانقسام بالإضافة إلى L (ENLYFQ/GL) لحماية N-المحطة الطرفية المؤقتة. وبالتالي، كان OaAEP1 قادرة على إضافة مونومر بروتين واحد فقط في وقت واحد، ومن ثم البروتياز TEVمتشبثة ن-تالتيموس بين س وG لفضح NH 2-Gly-Leu. ثم الوحدة جاهزة لربط OaAEP1 المقبل. يتم فحص البروتين متعدد البروتين المهندس من خلال مجال البروتين الفردي المتكشف باستخدام المجهر الذري القائم على النسخة الطيفية أحادية الجزيء (AFM-SMFS). لذلك ، توفر هذه الدراسة استراتيجية مفيدة لهندسة البروتين المتعدد والتجميد.

لن تؤثر بقايا NGL التي تم إدخالها بين البروتينات المجاورة من قبل ربط OaAEP1 على استقرار مونومر البروتين في البوليمر حيث أن القوة المتكشفة (<Fu> ) ، وزيادة طول كفاف (< ΟLc> ) قابلة للمقارنة مع الدراسة السابقة(الشكل 1). تظهر نتيجة تنقية بروتين الروبيدوكسين في الش?...

Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

هنا ، نقدم بروتوكولًا لاقتران مونومر البروتين بواسطة الإنزيمات التي تشكل بروتين البوليمر مع تسلسل يتم التحكم فيه وشل حركته على السطح لإجراء دراسات مطياف قوة أحادية الجزيء.

OaAEP1 بوساطة التوليف الأنزيمي وتجميد البروتين المبلمر للمطاطي للقوة أحادية الجزيء

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

أسلوبنا الأنزيمي استخدام oligomer البروتين مع عدد تسيطر عليها من درجة البلمرة. وهو إعداد عينة مثالية لدراسة الطيفية للقوة أحادية الجزيء وكذلك بناء المواد القائمة على البروتين. طريقتنا لا يقدم السيستين إلى البروتين المستهدف.لأن السيستين هو واحد من أهم المخلفات الوظيفية للبروتين، فإنه يسهل بناء البروتين مادة بلمرة أو الإنزيمات. يدل الإجراء سيكون ييبين دينغ وShengchao شي، طلاب غراد من مختبري. للبدء، قم بحل 20 غراما من كرومات البوتاسيوم في 40 ملليلتر من الماء فائق البور في منقار.إضافة ببطء 360 ملليلتر من حمض الكبريتيك المركزة إلى محلول dichromate البوتاسيوم واستخدام قضيب زجاجي لتحريك بلطف. ضع غطاء زجاجي في حمض الكرومك ونقله إلى فرن عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. تنظيف الغطاء بالماء ثم الكحول الإيثيل المطلق وتجفيف الغطاء مع تيار من النيتروجين.غمر تماما في coverlip 1٪ حجم من قبل حجم مفتاح APTES toluene لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع حمايتهم من الضوء. غسل الغطاء مع التولوين أولا ثم مع الكحول الإيثيل المطلقة وتجفيف الأغطية مع تيار من النيتروجين. احتضان الغطاء في 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ثم ندعه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.استخدام ماصة لإضافة 200 ميكرولترات من ملليغرام واحد لكل ملليلتر Sulfo-SMCC في حل DMSO بين اثنين من الأغطية غير المُشلَّولة واحتضان لمدة ساعة واحدة محمية من الضوء. بعد ساعة، غسل الأغطية مع DMSO أولا ثم مع الكحول الإيثيل المطلق لإزالة المتبقية Sulfo-SMCC. جفف غطاء الغط تحت تيار من النيتروجين.مازيت 60 ميكرولترات من 200 ميكرومولار GL-ELP-50 محلول cys-البروتين على غطاء وظيفية واحتضان في 25 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات تقريبا. بعد ذلك، قم بغسل الغطاء بالماء فائق الخطورة لإزالة الـ GL-ELP-50-cys غير المنقحة. لإعداد سطح cantilever وظيفية، أولا غمر cantilevers في حمض الكروم وتنظيف cantilevers في 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.استخدام الماء والكحول الإيثيلي المطلقة لغسل حمض. غمر cantilever مع 1٪ حجم من قبل حجم مفتاح APTES toluene لأداء الملوحة الأمينية في غطاء أنبوب من البلاستيك لمدة ساعة واحدة. شطف cantilever مع الكحول الإيثيل المطلقة ثم خبز cantilever في 80 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.غمر cantilever في حل Sulfo-SMCC لمدة ساعة واحدة ثم شطف cantilever مع الكحول الإيثيلي المطلق. لربط cys-ELP-50-NGL إلى السطح، غمر الـ cantilevers في cys-ELP-50-NGL مع مجموعة maleimide من Sulfo-SMCC لمدة 1.5 ساعة. ثم غسل بعيدا غير المنقحة cys-ELP-50-NGL على cantilever عن طريق المياه فائقة البور.المقبل, تزج cantilever وظيفية في محلول يحتوي على 200 ميكرولترات من 50 ميكرومولار GL-CBM-XDockerin حل البروتين مع 200 نانومولار OaAEP1 ووضعها في 25 درجة مئوية لمدة 20 إلى 30 دقيقة. ثم استخدام AFM العازلة لغسل البروتين غير المنقح. من الأهمية بمكان أن تغسل البروتين المتبقي غير المنقح قبل تجربة AFM لأنها ستشكل أزواجًا من التماسك دوكرين وكتلة الـ cantilever لأخذ بروتين جديد على السطح.لربط وحدة الربط التماسك T-L-البروتين من الفائدة-NGL إلى GL-ELP-50 شل على سطح الغطاء، إضافة 15 ميكرولترات من OaAEP1 على غطاء والسماح لها احتضان لمدة 30 دقيقة. استخدام 15 إلى 20 ملليلتر من AFM العازلة لغسل أي البروتينات غير المنقحة. أضف 100 ميكرولتر من بروتين TEV لشق وحدة البروتين في موقع التعرف على TEV لمدة ساعة واحدة عند 25 درجة مئوية.ثم استخدام 15 إلى 20 ملليلتر من AFM العازلة لغسل البروتينات المتبقية. ربط وحدة الربط التماسك-T-L-البروتين من الفائدة-NGL إلى الزجاج GL-ubiquitin-NGL بواسطة OaAEP1 لمدة 30 دقيقة. اعتمادا على البروتين يبني GL-ubiquitin-NGL التي سيتم بناؤها على سطح الزجاج, كرر خطوات إعداد البوليبروتين n1 مرات.حذف رد فعل شق TEV الماضي إلى التماسك الاحتياطي على البوليمر البروتين كما التماسك-TEV-L-ubiquitin-n-NGL الزجاج. إضافة ملليلتر واحد من AFM العازلة مع كلوريد الكالسيوم 10 ملليمولار وخمسة حمض الأسكوربيك ملليمولار إلى غرفة السوائل AFM. اختر طرف D من مسبار AFM الوظيفي للتجربة.غمر المسبار في المخزن المؤقت لـ AFM. سحب cantilever في سرعة ثابتة من 400 نانومتر في الثانية من السطح. في هذه الأثناء، تسجيل منحنى تمديد القوة بمعدل عينة من 4،000 هرتز.استخدام نظرية equipartition لمعايرة cantilever في AFM العازلة مع دقيقة قيمة ثابتة الربيع K قبل كل تجربة. نعلق تلميح cantilever وظيفية مع دوكرين إلى السطح البروتين المودع وظيفية مع التماسك لتشكيل زوج التماسك دوكرين. ثم فتح برنامج معالجة البيانات JPK وتحديد منحنى تمديد القوة مع نمط مثل sawtooth مميزة وقوة مفرزة عالية.في هذه الدراسة، لم تؤثر بقايا NGL التي أدخلت بين البروتينات المجاورة من قبل ربط OaAEP1 على استقرار مونومر البروتين في البوليمر الذي تم التعبير عنه حيث كانت القوة المتكشفة وزيادة طول الكونترا قابلة للمقارنة مع الدراسة السابقة. قدمت تنقية rubredoxin شكل الحديديك نموذجي قمم امتصاص الأشعة فوق البنفسجية تصور في 495 نانومتر و 575 نانومتر في حين أن شكل الزنك لم. SDS صفحة هلام النتائج من الهضم خطوة وربط تظهر متماسكة TEV-L-ubiquitin, خليط البروتين نتيجة من شق TEV, نقية GFP-TEV-protease, والمنتج النقي GL-ubiquitin.يتم عرض خليط الربط GL-ubiquitin المشقوق والتماسك-TEV-L-ubiquitin liga مع أو بدون OaAEP1 و OaAEP1 النقي كذلك. من المهم أن تعمل على وظيفية السطح مع النشط Sulfo-SMCC لمرفق الببتيد بنجاح. هنا نقدم طريقة جديدة لبناء البروتين البلمرة.يسهل على الباحثين دراسة نظام البروتين المعقد باستخدام التحليل الطيفي للقوة أحادية الجزيء. حمض الكروميك هو تآكل بقوة والحمضية. كن حذرا عند إعداد والتعامل معها.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

السريع خطوة واحدة الأنزيمية توليف وجميع المائيه تنقية طرهالوز النظائر

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

التلاعب جزيء واحد من كوادروبليكسيس ز بملاقط مغناطيسية

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

استخدام ألوان جزيء واحد الحنق لدراسة الترابط بين تفاعلات البروتين

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

تحليل خلية واحدة من الأليل النشطة نسخيا بواسطة جزيء واحد FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

جزيء واحد فلورسينس دراسة نقل الطاقة من تخليق البروتين ريبوسوم

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...