Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
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这项工作得到了国家自然科学基金（授权号21771103，21977047），江苏省自然科学基金（授权号21771103）的支持。BK20160639）和江苏省双川计划。

1. 蛋白质生产
<ol><li>
基因克隆
	<ol>
<li>购买感兴趣的蛋白质（POI）的基因编码：泛素、鲁布雷多辛（RD）51、纤维素结合模块（CBM）、Dockerin-X域（XDoc）和从鲁米诺球菌浮躁、烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶、弹性蛋白样多肽（ELPs）的内聚力。</li>
		<li>进行聚合酶链反应，并使用三限消化酶系统BamHI-BglII-KpnI对不同蛋白质片段的基因进行重组。<...

我们描述了一种酶生物合成和多蛋白固定化方案，并验证了基于AFM的SMFS的多蛋白设计。这种方法提供了一种新方法，以设计的顺序构建蛋白质聚合物，补充了以前多蛋白工程和固定4、6、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61的方法。</su...

与合成聚合物相比，天然多域蛋白具有统一的结构，具有控制良好的数量和子域1的类型。此功能通常导致改善生物功能和稳定性2，3。许多方法，如基于半胱氨酸的二硫化物结合和重组DNA技术，已经开发用于建立这种聚合蛋白与多个领域4，5，6，7。然而，前一种方法总是导致一个随机和不受控制的序列，而后者会导致其他问题，包括有毒和大型蛋白质的过度表达和复合蛋白与辅因子和其他微妙酶的纯化的困难。
为了迎接这一挑战，我们开发了一种酶法，利用蛋白胶合OaAEP1与蛋白酶TEV8、9相结合，将蛋白质单体结合在一起，以循序渐进的方式用于聚合物/多蛋白。OaAEP1是一种严格而高效的内肽酶。如果N-终点为Gly-Leu残留物（GL），则两种蛋白质可于30分钟内通过OaAEP1通过两个终点线（NGL）进行共价连接，而C-终点为NGL残留物10。然而，使用OaAEP1只将蛋白质单体与蛋白质聚合物联系起来，其序列与基于半胱氨酸的耦合方法一样不受控制。因此，我们设计了具有可移动TEV蛋白酶位点的蛋白质单元的N-终点，以及作为ENLYFQ/G-L-POI的亮氨酸残留物。在 TEV 裂解之前，N 终端不会参与 OaAEP1 连接。然后，N-总站的GL残留物，与进一步的OaAEP1结扎兼容，在TEV裂解后暴露。因此，我们实现了多蛋白的连续酶生物合成方法，序列控制相对较好。
在这里，我们的分步酶合成方法可用于多蛋白样品制备，包括序列控制和不受控制，以及蛋白质固定用于单分子研究，特别是对于复杂系统，如金属蛋白。
此外，基于AFM的SMFS实验使我们能够确认蛋白质聚合物在单分子水平上的结构和稳定性。单分子力光谱，包括AFM，光学钳子和磁钳，是纳米技术中一般工具，以机械方式操纵生物分子，测量其稳定性11，12，13，14，15，16，17，18，19，20。单分子AFM已广泛应用于蛋白质（非）折叠21，22，23，24，25，受体-配体相互作用的强度测量26，27，28，29，30，31，32，33，34， 35，无机化学键20，36，37，38，39，40，41，42，43和金属配体键在金属蛋白44，45，46，47，48，49，50.在这里，使用单分子AFM验证基于相应蛋白质展开信号的合成多蛋白序列。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

近年来，化学和生物结合技术发展迅速，使蛋白质聚合物得以形成。然而，受控的蛋白质聚合过程始终是一个挑战。在这里，我们开发了一种酶方法，用于在合理控制的序列中逐步构建聚合蛋白。在这种方法中，蛋白质单体的C端是NGL用于蛋白质结合使用OaAEP1 （奥德兰尼亚亲基苯甲酰二甲苯肽酶） 1），而N端是一个可夹紧的TEV（烟草蚀刻病毒）裂解位点加L（ENLYFQ/GL）用于临时N端保护。因此，OaAEP1一次只能添加一个蛋白质单体，然后TEV蛋白酶在Q和G之间将N-终点板分刻，以暴露NH 2-Gly-Leu。然后，该装置已准备好进行下一次 OaAEP1 结扎。工程多蛋白通过展开单个蛋白质域使用原子力显微镜为基础的单分子力光谱（AFM-SMFS）进行检查。因此，本研究为多蛋白工程和固定化提供了一个有用的策略。

OaAEP1结扎在相邻蛋白质之间引入的NGL残留物不会影响聚合物中的蛋白质单体稳定性，因为展开力（<Fu>）和轮廓长度增量（<+Lc>;）与上一项研究（图1）相当。红霉素蛋白的纯化结果如图2所示。为了证明TEV裂解后的蛋白质与以下OaAEP1结扎相容，以构建具有控制序列的蛋白质聚合物，结构高效，图3提供了SDS-PAGE图像作...

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OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

在这里，我们提出了一个方案，通过酶形成蛋白质聚合物与受控序列结合蛋白质单体，并将其固定在表面进行单分子力光谱研究。

OaAEP1介导酶合成和聚合蛋白固定，用于单分子力光谱

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

我们的酶方法使用具有受控聚合度的蛋白寡聚物。它是单分子力光谱学研究以及基于蛋白质的材料结构的完美样品制备。我们的方法不引入半胱氨酸的目标蛋白质。由于半胱氨酸是蛋白质最重要的功能残留物之一，它有利于聚合物质蛋白或酶的构建。演示程序将是邓一兵和石胜超，我实验室的研究生。首先，在烧杯中将20克铬酸钾溶解在40毫升的超纯水中。在二氯酸钾溶液中慢慢加入360毫升浓缩硫酸，并使用玻璃棒轻轻搅拌。将玻璃盖玻片放入铬酸中，在80摄氏度下将其转移到烤箱中30分钟。用水清洁盖玻片，然后用绝对乙醇清洁盖玻片，然后用氮流干燥盖玻片。在室温下，将盖玻片完全浸入 1% 体积的 APTES 甲苯溶液中，在室温下浸泡一小时，同时保护其免受光线影响。首先用甲苯清洗盖玻片，然后用绝对乙醇清洗盖玻片，然后用氮气流擦干盖玻片。在80摄氏度下孵育盖玻片15分钟，然后让它冷却至室温。在两个固定盖玻片和孵育一小时之间，使用移液器在 DMSO 溶液中加入 200 微升，每毫升 Sulfo-SMCC 1 毫克。一小时后，先用 DMSO 清洗盖玻片，然后用绝对乙醇清洗，以去除残留的 Sulfo-SMCC。在氮气流下干燥盖玻片。200微摩尔GL-ELP-50 cys蛋白溶液的60微升，在功能化盖玻片上，在25摄氏度下孵育约3小时。之后，用超纯水清洗盖玻片，以去除未反应的 GL-ELP-50-cys。要准备功能化悬臂表面，首先将悬臂浸入铬酸中，并在 80 摄氏度下清洁悬臂，10 分钟。用水和绝对乙醇洗去酸。将悬臂浸入1%体积的APTES甲苯溶液中，在塑料管盖中进行一小时的氨基盐化。用绝对乙醇冲洗悬臂，然后在80摄氏度下烘烤悬臂15分钟。将悬臂浸入 Sulfo-SMCC 溶液中一小时，然后用绝对乙醇冲洗悬臂。要将囊-ELP-50-NGL 与表面连接，请将囊-ELP-50-NGL 中的连形器与 Sulfo-SMCC 的雄胺组浸入 1.5 小时。然后用超纯水洗去悬臂上未反应的囊-ELP-50-NGL。接下来，将功能化悬臂浸入含有 200 微升 50 微摩尔 GL-CBM-XDockerin 蛋白溶液和 200 纳米摩尔 OaAEP1 溶液的溶液中，并在 25 摄氏度下放置 20 至 30 分钟。然后使用AFM缓冲液洗去未反应的蛋白质。在AFM实验之前洗去未反应的残余蛋白质至关重要，因为它将形成一个鳕欣-多金对和块悬臂，以在表面接受新的蛋白质。要将感兴趣的-NGL的结扎单元cohesin-T-L-protein与固定在盖玻片表面的GL-ELP-50连接，在盖玻片上加入15微升OAAEP1，让它孵育30分钟。使用 15 到 20 毫升的 AFM 缓冲液洗去任何未反应的蛋白质。加入100微升的TEV蛋白酶，在25摄氏度的TEV识别点切割蛋白质单元一小时。然后使用15至20毫升AFM缓冲液洗去残留蛋白质。将感兴趣的-NGL的结扎单元cohesin-T-L-蛋白与OAAEP1的GL-泛素-NGL玻璃连接30分钟。根据蛋白质结构GL-泛素-NGL要建立在玻璃表面，重复多蛋白制备步骤n1次。省略最后一个 TEV 裂解反应，将蛋白聚合物上的 cohesin 作为 cohesin-TEV-L-泛素-n-NGL 玻璃。在AFM液室中加入一毫升AFM缓冲液，加入10毫摩尔氯化钙和5毫摩尔抗坏血酸。为实验选择功能化 AFM 探头的 D 尖端。将探头浸入 AFM 缓冲区中。以 400 纳米/秒的恒定速度从表面缩回悬臂。同时，以 4，000 赫兹的采样率记录力延伸曲线。在每次实验前，使用装备定理校准AFM缓冲液中的悬臂，并采用精确的弹簧常数K值。将用码头素功能化的悬臂尖端连接到蛋白沉积表面，用鳕欣功能化，形成鳕欣-多金对。然后打开JPK数据处理软件，选择具有特色的锯齿型和高分离力的力延伸曲线。在这项研究中，OaAEP1结扎在相邻蛋白质之间引入的NGL残留物不影响聚合物中的蛋白质单体稳定性，其表达为展开力，反长增量与先前的研究相当。铁质鲁布雷多辛的纯化呈现了495纳米和575纳米的典型UV可视化吸收峰值，而锌形态则没有。 步进消化和结扎的SDS页面凝胶结果表明，TEV-L-泛素、TEV裂解、纯GFP-TEV-蛋白酶和纯化产品GL-泛素的结果蛋白混合物。带无OAAEP1和纯OAAEP1的切割GL-泛素和cohesin-TEV-L-泛素结扎混合物也显示。使用有源的 Sulfo-SMCC 使表面功能化至关重要，以成功进行肽附件。在这里，我们提供了一种制造聚合蛋白的新方法。它便于研究人员使用单分子力光谱研究复杂的蛋白质系统。铬酸具有很强的腐蚀性和酸性。准备和处理它时要小心。

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