Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu-provinsen (Grant No. BK20160639) og Shuangchuang Program i Jiangsu-provinsen.

1. Proteinproduktion
<ol><li>
Genkloning
	<ol>
<li>Køb gener kodning for protein af interesse (POI): Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, cellulose-bindende modul (CBM), dockerin-X domæne (XDoc) og samhørighed fra Ruminococcus flavefacience, tobak etch virus (TEV) protease, elastin-lignende polypeptider (ELP' er).</li>
		<li>Udfør polymerase kædereaktion og bruge tre-begrænsning fordøjelseenzym system BamHI-BglII-KpnI for rekombinere genet fra...

Vi har beskrevet en protokol for enzymatisk biosyntese og immobilisering af polyprotein og verificeret polyprotein design af AFM-baserede SMFS. Denne metode giver en ny tilgang til opbygning af protein-polymer i en designet sekvens, som supplerer tidligere metoder til polyprotein engineering og immobilisering4,6,52,53,54,55,<...

Sammenlignet med syntetiske polymerer har naturlige multidomæneproteiner en ensartet struktur med et velkontrolleret antal og typen af underdomæner1. Denne funktion fører normalt til forbedret biologisk funktion og stabilitet2,3. Mange tilgange, såsom cystein-baserede disulfid binding kobling og rekombinant DNA-teknologi, er blevet udviklet til at opbygge en sådan polymeriseret protein med flere domæner4,5,6,7. Men den tidligere metode resulterer altid i en tilfældig og ukontrolleret sekvens, og sidstnævnte fører til andre problemer, herunder vanskeligheden for overekspression af giftige og store proteiner og rensning af komplekst protein med cofaktor og andre sarte enzymer.
For at imødekomme denne udfordring udvikler vi en enzymatisk metode, der sammenlægger proteinmonomer sammen for polymer/polyprotein på en trinvis måde ved hjælp af en proteinligase OaAEP1 kombineret med en protease TEV8,9. OaAEP1 er en streng og effektiv endopeptidase. To proteiner kan forbindes kovalent som Asn-Gly-Leu sekvens (NGL) gennem to termini af OaAEP1 på mindre end 30min. Men brugen af OaAEP1 kun at forbinde protein monomer fører til et protein polymer med en ukontrolleret sekvens som cystein-baserede kobling metode. Derfor designer vi N-endepunktet af proteinenheden med et aftageligt TEV protease-sted plus en leucinrester som ENLYFQ/G-L-POI. Før TEV-kavalergangen ville N-terminalen ikke deltage i OaAEP1 ligation. Og så eksponeres GL-resterne ved N-endeinus, som er forenelige med yderligere OaAEP1 ligation, efter TEV-kavalergangen. Således har vi opnået en sekventiel enzymatisk biosyntese metode til polyprotein med en relativt velkontrolleret sekvens.
Her kan vores trinvise enzymatiske syntesemetode anvendes i polyproteinprøvepræparat, herunder sekvenskontrolleret og ukontrolleret, og proteinimmobilisering til enkeltmolekyleundersøgelser, især til det komplekse system som f.eks. metalloprotein.
Desuden giver AFM-baserede SMFS-eksperimenter os mulighed for at bekræfte proteinpolymerkonstruktionen og stabiliteten på enkeltmolekyleniveau. Single-molekyle kraft spektroskopi, herunder AFM, optisk pincet og magnetisk pincet, er et generelt redskab i nanoteknologi til at manipulere biomolekyle mekanisk og måle deres stabilitet11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Single-molecule AFM har været meget udbredt i studiet af protein (un)foldning21,22,23,24,25, styrken måling af receptor-ligand interaktion26,27,28,29,30,31,32,33,34 ,34, 35, uorganisk kemisk binding20,36,37,38,39,40,41,42,43 og metal-ligand binding i metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Her anvendes single-molecule AFM til at verificere den syntetiserede polyproteinsekvens baseret på det tilsvarende proteinudfoldersignal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

Kemiske og bio-bøjning teknikker er blevet udviklet hurtigt i de seneste år og tillader opførelse af protein polymerer. Men en kontrolleret protein polymerisering proces er altid en udfordring. Her har vi udviklet en enzymatisk metode til konstruktion af polymeriseret protein trin for trin i en rationelt kontrolleret sekvens. I denne metode er C-terminus af et proteinmonomer NGL for proteinbøjning ved hjælp af OaAEP1(Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases)1), mens N-terminus var en cleavable TEV (tobak etch virus) spaltning site plus en L (ENLYFQ / GL) for midlertidig N-terminal beskyttelse. Derfor var OaAEP1 i stand til kun at tilføje ét proteinmonomer ad gangen, og derefter kløvede TEV N-endeinusmellem Q og G for at afsløre NH 2-Gly-Leu. Derefter er enheden klar til næste OaAEP1 ligation. Det manipulerede polyprotein undersøges ved at udfolde individuelle proteindomæne ved hjælp af atomkraftmikroskopibaseret single-molecule force spektroskopi (AFM-SMFS). Derfor, denne undersøgelse giver en nyttig strategi for polyprotein engineering og immobilisering.

De NGL-restkoncentrationer, der indføres mellem tilstødende proteiner ved OaAEP1 ligation, vil ikke påvirke proteinmonomerstabiliteten i polymeren som udfoldelseskraft (<Fu>), og konturlængdeforøgelsen (<ΔLc>) kan sammenlignes med den foregående undersøgelse (figur 1). Rensningsresultatet af rubredoxinproteinet er vist i figur 2. For at bevise, at proteinet efter TEV spaltning er kompatibelt med følgende OaAEP1 ligation til at kons...

Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Her præsenterer vi en protokol til konjugere proteinmonomer af enzymer, der danner proteinpolymer med en kontrolleret sekvens og immobiliserer den på overfladen til enkeltmolekylets gennemspektroskopiundersøgelser.

OaAEP1-Medieret enzymatisk syntese og immobilisering af polymeriseret protein til enkeltmolekylet spektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Vores enzymatiske metode bruger protein oligomer med et kontrolleret antal polymeriseringsgrad. Det er en perfekt prøve forberedelse til enkelt-molekyle kraft spektroskopi undersøgelse samt protein-baseret materiale konstruktion. Vores metode introducerer ikke cystein til målproteinet.Fordi cystein er en af de vigtigste funktionelle rester for protein, det letter opbygningen af polymeriseret stof protein eller enzymer. Demonstrere proceduren vil være Yibing Deng og Shengchao Shi, Grad studerende fra mit laboratorium. Til at begynde, opløse 20 gram kalium kromat i 40 milliliter ultrarent vand i et bægerglas.Tilsæt langsomt 360 milliliter koncentreret svovlsyre til kaliumdichromatopløsningen, og brug en glasstang til at røre forsigtigt. Placer et glas coverslip i kromsyre og overføre den til en ovn ved 80 grader Celsius i 30 minutter. Rengør dækslæbet med vand og derefter absolut ethylalkohol og tør dækslæbet med en nitrogenstrøm.Dækslæbet nedsænkes fuldstændigt i 1% volumen efter volumen APTES toluenopløsning i en time ved stuetemperatur, samtidig med at de beskyttes mod lys. Dækslædlen vaskes først med toluen og derefter med absolut ethylalkohol, og dækslæbet tørres af med en nitrogenstrøm. Inkuber dækslet ved 80 grader Celsius i 15 minutter og lad den derefter køle ned til stuetemperatur.Brug en pipette til at tilføje 200 mikroliter på en milligram pr. milliliter Sulfo-SMCC i DMSO-opløsning mellem to immobiliserede dæksæber og inkuberes i en time beskyttet mod lys. Efter en time vaskes dækslerne med DMSO først og derefter med absolut ethylalkohol for at fjerne resterende Sulfo-SMCC. Tør dækslæbet under en nitrogenstrøm.Pipette 60 mikroliter på 200 mikromolar GL-ELP-50 cys-protein opløsning på en funktionaliseret coverslip og inkubere ved 25 grader Celsius i omkring tre timer. Derefter vaskes dækslet med ultrarent vand for at fjerne de ureagerede GL-ELP-50-cys. For at forberede funktionaliseret cantilever overflade, først nedsænkes cantilevers i kromsyre og rense cantilevers ved 80 grader Celsius i 10 minutter.Brug vand og absolut ethylalkohol til at vaske syren væk. Nedsænk cantilever med 1% volumen efter volumen APTES toluen løsning til at udføre aminosaltning i en plastrør hætte i en time. Skyl cantilever med absolut ethylalkohol og derefter bage cantilever ved 80 grader Celsius i 15 minutter.Nedsænk cantilever i Sulfo-SMCC opløsning i en time og derefter skylles cantilever med absolut ethylalkohol. For at forbinde cys-ELP-50-NGL til overfladen, nedsænkes cantilevers i cys-ELP-50-NGL med maleimide gruppen af Sulfo-SMCC i 1,5 timer. Vask derefter de ureagerede cys-ELP-50-NGL på cantilever af ultrarent vand.Dernæst nedsænkes en funktionaliseret cantilever i en opløsning, der indeholder 200 mikroliter af 50 micromolar GL-CBM-XDockerin proteinopløsning med 200 nanomolar OaAEP1, og læg dem på 25 grader Celsius i 20 til 30 minutter. Brug derefter AFM buffer til at vaske væk ureageret protein. Det er vigtigt at vaske væk ureagerede resterende protein før AFM eksperiment, fordi det vil danne en cohesin-dockerin par og blokere cantilever at tage op nyt protein på overfladen.At forbinde ligation enhed cohesin-T-L-protein af interesse-NGL til GL-ELP-50 immobiliseret på coverslip overflade, tilføje 15 mikroliter af OaAEP1 på coverslip og lad det inkubere i 30 minutter. Brug 15 til 20 milliliter AFM buffer til at vaske væk eventuelle ureagerede proteiner. Der tilsættes 100 mikroliter TEV-protease for at kløve proteinenheden på TEV-genkendelsesstedet i en time ved 25 grader Celsius.Brug derefter 15 til 20 milliliter AFM buffer til at vaske væk resterende proteiner. Sammenkæd ligationsenheden cohesin-T-L-protein af interesse-NGL med GL-ubiquitin-NGL-glasset ved OaAEP1 i 30 minutter. Afhængigt af protein konstrukt GL-ubiquitin-NGL, der skal bygges på glasoverfladen, gentages polyproteinpræparattrinene n1 gange.Ude udelade den sidste TEV spaltning reaktion til at reservere cohesin på protein polymer som cohesin-TEV-L-ubiquitin-n-NGL glas. Der tilsættes en milliliter AFM-buffer med 10 millimolar calciumchlorid og fem millimolar ascorbinsyre til AFM-væskekammeret. Vælg D spidsen af den funktionaliserede AFM-sonde til eksperimentet.Sænk sonden i AFM-bufferen. Træk cantilever med en konstant hastighed på 400 nanometer per sekund fra overfladen. I mellemtiden skal du registrere kraftforlængelseskurven med en stikprøvehastighed på 4.000 hertz.Brug equipartitionteoret til at kalibrere cantilever i AFM buffer med en nøjagtig fjeder konstant K værdi før hvert eksperiment. Fastgør cantilever spidsen funktionaliseret med dockerin til protein deponeret overflade funktionaliseret med cohesin til at danne cohesin-dockerin par. Åbn derefter JPK-databehandlingssoftware, og vælg kraftforlængelseskurve med det karakteristiske savfortættelignende mønster og en høj løsrivelseskraft.I denne undersøgelse påvirkede NGL-restkoncentrationerne, der blev indført mellem tilstødende proteiner ved OaAEP1-ligation, ikke proteinmonmisk stabilitet i polymeren udtrykt som udfoldelseskraften, og kontralængdeforøgelsen var sammenlignelig med tidligere undersøgelse. Rensningen af ferriform rubredoxin præsenterede typiske UV-visualiserede absorptionstoppe ved 495 nanometer og 575 nanometer, mens zinkformen ikke gjorde. SDS-sidegelresultater af den trinvise fordøjelse og ligation viser sammenhængende TEV-L-ubiquitin, resultatet proteinblanding af TEV-spaltning, ren GFP-TEV-protease og renset produkt GL-ubiquitin.Den kløvet GL-ubiquitin og cohesin-TEV-L-ubiquitin ligation blanding med eller uden OaAEP1 og ren OaAEP1 er vist så godt. Det er afgørende at funktionalisere overfladen med aktiv Sulfo-SMCC for vellykket peptid vedhæftet fil. Her tilbyder vi en ny metode til at bygge polymeriseret protein.Det letter forskere til at studere komplekse protein system ved hjælp af enkelt-molekyle kraft spektroskopi. Kromsyre er stærkt ætsende og sure. Vær forsigtig, når du forbereder og håndterer det.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Rapid Et-trins enzymatisk syntese og All-vandig Oprensning af trehalose Analoger

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET på enkeltmolekyliveau for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Enkelt-molekyle Manipulation af G-quadruplexes af magnetiske pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Ved hjælp af trefarvet enkelt-molekyle FRET at studere sammenhængen af Protein interaktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse af transskriptionsaktive alleler efter enkeltmolekyle FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyle fluorescens energioverførsel undersøgelse af ribosom proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...