Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) en Shuangchuang Programma van de provincie Jiangsu.

1. Eiwitproductie
<ol><li>
Genkloon
	<ol>
<li>Aankoopgenen codering voor het eiwit van belang (POI): Ubiquitine, Rubredoxin (RD)51, de cellulose-bindende module (CBM), dockerin-X domein (XDoc) en cohesie van Ruminococcus flavefacience, tabak etch virus (TEV) protease, elastine-achtige polypeptiden (ELP's).</li>
		<li>Voer polymerase kettingreactie uit en gebruik drie-beperking spijsverteringsenzymsysteem BamHI-BglII-KpnI voor het recombineren ...

We hebben een protocol beschreven voor enzymatische biosynthese en immobilisatie van polyproteïne en geverifieerd de poly-eiwit ontwerp door AFM-gebaseerde SMFS. Deze methodologie biedt een nieuwe benadering voor het bouwen van het eiwitpolymeer in een ontworpen sequentie, die een aanvulling vormt op eerdere methoden voor polyproteïnetechniek en immobilisatie4,6,52,53,<sup class="x...

Vergeleken met synthetische polymeren hebben natuurlijke multi-domein eiwitten een uniforme structuur met een goed gecontroleerd aantal en type subdomeinen1. Deze functie leidt meestal tot een verbeterde biologische functie en stabiliteit2,3. Veel benaderingen, zoals cysteïnegebaseerde disulfide bindingkoppeling en recombinante DNA-technologie, zijn ontwikkeld voor het bouwen van een dergelijk gepolymeriseerd eiwit met meerdere domeinen4,5,6,7. Echter, de voormalige methode resulteert altijd in een willekeurige en ongecontroleerde sequentie, en de laatste leidt tot andere problemen, met inbegrip van de moeilijkheid voor de overexpressie van giftige en grote eiwitten en de zuivering van complexe eiwitten met cofactor en andere delicate enzymen.
Om deze uitdaging aan te gaan, ontwikkelen we een enzymatische methode die eiwitmonomeer samenvoegt voor polymeer/polyproteïne op een stapsgewijze manier met behulp van een eiwitligase OaAEP1 gecombineerd met een protease TEV8,9. OaAEP1 is een strikte en efficiënte endopeptidase. Twee eiwitten kunnen in minder dan 30 min als Asn-Gly-Leu-sequentie (NGL) door twee termini van OaAEP1 in minder dan 30 min worden gekoppeld als het N-terminus gly-leuresiduen (GL) en de andere daarvan NGL-residuen10. Het gebruik van OaAEP1 leidt echter alleen om eiwitmonomeer te koppelen tot een eiwitpolymeer met een ongecontroleerde sequentie zoals de op cysteïne gebaseerde koppelingsmethode. Daarom ontwerpen we het N-eindpunt van de eiwiteenheid met een verwijderbare TEV protease site plus een leucine residu als ENLYFQ/G-L-POI. Vóór het TEV-decolleté zou de N-terminal niet deelnemen aan OaAEP1 ligatie. En dan worden de GL-resten bij N-terminus, die compatibel zijn met verdere OaAEP1-ligatie, blootgesteld na het TEV-decolleté. Zo hebben we een sequentiële enzymatische biosynthesemethode van poly-eiwit bereikt met een relatief goed gecontroleerde sequentie.
Hier kan onze stapsgewijze enzymatische synthesemethode worden gebruikt in polyproteïnemonsterbereiding, inclusief sequentiegestuurd en ongecontroleerd, en eiwitimmobilisatie voor enkelmolecuulstudies, vooral voor het complexe systeem zoals metalloproteïne.
Bovendien stellen afm-gebaseerde SMFS-experimenten ons in staat om de constructie en stabiliteit van het eiwitpolymeer op het niveau van één molecuul te bevestigen. Single-molecule krachtspectroscopie, met inbegrip van AFM, optische pincet en magnetische pincet, is een algemeen instrument in nanotechnologie om biomolecule mechanisch te manipuleren en hun stabiliteit te meten11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Single-molecule AFM is veel gebruikt in de studie van eiwit (on)vouwen21,22,23,24,25, de sterkte meting van receptor-ligand interactie26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, anorganische chemische binding20,36,37,38,39,40,41,42,43 en metaalligand binding in metalloproteïne44,45,46,47,48,49,50 . Hier wordt single-molecule AFM gebruikt om de gesynthetiseerde polyproteïnesequentie te verifiëren op basis van het bijbehorende eiwitontvouwende signaal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

Chemische en bio-vervoegingstechnieken zijn de laatste jaren snel ontwikkeld en maken het mogelijk om eiwitpolymeren op te bouwen. Echter, een gecontroleerd eiwit polymerisatie proces is altijd een uitdaging. Hier hebben we een enzymatische methodologie ontwikkeld voor het stapsgewijs construeren van gepolymeriseerde eiwitten in een rationeel gecontroleerde sequentie. Bij deze methode is het C-eindpunt van een eiwitmonomeer NGL voor eiwitvervoeging met oaaep1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1), terwijl het N-terminus een cleavable TEV (tabaksetch virus) decolletésite plus een L (ENLYFQ/GL) voor tijdelijke N-terminal bescherming was. Bijgevolg kon OaAEP1 slechts één eiwitmonomeer tegelijk toevoegen, waarna de TEV protease het N-terminus tussen Q en G afhakte om de NH2-Gly-Leu bloot te leggen. Dan is het apparaat klaar voor de volgende OaAEP1 ligatie. Het gemanipuleerde polyproteïne wordt onderzocht door het ontvouwen van individueel eiwitdomein met behulp van atomaire kracht microscopie-gebaseerde single-molecule kracht spectroscopie (AFM-SMFS). Daarom biedt deze studie een nuttige strategie voor polyproteïnetechniek en immobilisatie.

De NGL-residuen die door OaAEP1-ligatie tussen aangrenzende eiwitten worden geïntroduceerd, hebben geen invloed op de eiwitmonomeerstabiliteit in het polymeer, aangezien de uitvouwkracht (<Fu>), en contourlengtetoename (<ΔLc>) vergelijkbaar is met de vorige studie (figuur 1). Het zuiveringsresultaat van het rubredoxine-eiwit wordt weergegeven in figuur 2. Om te bewijzen dat het eiwit na TEV decolleté compatibel is met de volgende OaAEP1 ...

Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Hier presenteren we een protocol om eiwitmonomeer te vervoegen door enzymen die eiwitpolymeer vormen met een gecontroleerde sequentie en het op het oppervlak immobiliseren voor spectroscopiestudies met één molecuul.

OaAEP1-Gemedeerde Enzymatische Synthese en Immobilisatie van gepolymeriseerd eiwit voor Single-Molecule Force Spectroscopie

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Onze enzymatische methode gebruikt eiwit oligomer met een gecontroleerd aantal polymerisatie graad. Het is een perfecte monstervoorbereiding voor single-molecule force spectroscopie studie evenals eiwit-gebaseerde materiaal constructie. Onze methode introduceert geen cysteïne in het doeleiwit.Omdat cysteïne een van de belangrijkste functionele residuen voor eiwitten is, vergemakkelijkt het de bouw van gepolymeriseerde materie-eiwitten of enzymen. Het aantonen van de procedure zal Yibing Deng en Shengchao Shi, grad studenten van mijn laboratorium. Los om te beginnen 20 gram kaliumchromaat op in 40 milliliter ultrazuiver water in een beker.Voeg langzaam 360 milliliter geconcentreerd zwavelzuur toe aan de kaliumdichromaatoplossing en gebruik een glazen staaf om zachtjes te roeren. Plaats een glazen coverslip in het chroomzuur en breng het naar een oven op 80 graden Celsius gedurende 30 minuten. Reinig de coverslip met water en vervolgens absolute ethylalcohol en droog de coverslip met een stroom van stikstof.Dompel de coverslip volledig onder in 1% volume volume APTES tolueen oplossing gedurende een uur bij kamertemperatuur, terwijl ze worden beschermd tegen licht. Was eerst de coverslip met tolueen en vervolgens met absolute ethylalcohol en droog de coverslip met een stroom stikstof. Incubeer de coverslip bij 80 graden Celsius gedurende 15 minuten en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.Gebruik een pipet om 200 microliter van een milligram per milliliter Sulfo-SMCC toe te voegen in DMSO-oplossing tussen twee geïmmobiliseerde coverslips en incubaat gedurende een uur beschermd tegen licht. Na een uur was je eerst de covers met DMSO en daarna met absolute ethylalcohol om de resterende Sulfo-SMCC te verwijderen. Droog de coverslip onder een stroom stikstof.Pipette 60 microliter van 200 micromolar GL-ELP-50 cys-eiwit oplossing op een gefunctionaliseerde coverslip en incubaat bij 25 graden Celsius gedurende ongeveer drie uur. Daarna was je de coverslip met ultrazuiver water om de niet-gereageerde GL-ELP-50-cys te verwijderen. Om het gefunctionaliseerde cantileveroppervlak voor te bereiden, dompel je eerst de cantilevers onder in chromisch zuur en reinig je de cantilevers op 80 graden Celsius gedurende 10 minuten.Gebruik water en absolute ethylalcohol om het zuur weg te spoelen. Dompel de cantilever onder met 1% volume volume APTES tolueen oplossing om aminoverzilting uit te voeren in een plastic buis dop voor een uur. Spoel de cantilever met absolute ethylalcohol en bak de cantilever vervolgens 15 minuten op 80 graden Celsius.Dompel de cantilever een uur onder in Sulfo-SMCC oplossing en spoel de cantilever vervolgens af met absolute ethylalcohol. Om de cys-ELP-50-NGL aan het oppervlak te koppelen, dompel je de cantilevers 1,5 uur onder in de cys-ELP-50-NGL met de maleimidegroep sulfo-SMCC. Was vervolgens de niet-gereageerde cys-ELP-50-NGL op de cantilever weg met ultrazuiver water.Dompelen vervolgens een gefunctionaliseerde cantilever onder in een oplossing die 200 microliter van 50 micromolar GL-CBM-XDockerin eiwitoplossing met 200 nanomolar OaAEP1 bevat en plaats ze gedurende 20 tot 30 minuten op 25 graden Celsius. Gebruik dan de AFM-buffer om ongereacteerd eiwit weg te spoelen. Het is van cruciaal belang om ongereacteerd resteiwit weg te wassen voordat afm experimenteert, omdat het een samenhangend-dockerin paren en het blok van de cantilever zal vormen om nieuw eiwit op het oppervlak op te nemen.Om het ligatie-apparaat samenhangend-T-L-eiwit van belang-NGL te koppelen aan de GL-ELP-50 geïmmobiliseerd op het coverslipoppervlak, voeg 15 microliter OaAEP1 toe aan de coverslip en laat het 30 minuten incuren. Gebruik 15 tot 20 milliliter AFM buffer om alle niet-gereageerd eiwitten weg te wassen. Voeg 100 microliter TEV-protease toe om de eiwiteenheid op de TEV-herkenningsplaats gedurende een uur bij 25 graden Celsius te klijpen.Gebruik vervolgens 15 tot 20 milliliter AFM-buffer om resteiwitten weg te spoelen. Koppel het ligatie-apparaat cohesin-T-L-protein van belang-NGL gedurende 30 minuten aan het GL-ubiquitine-NGL glas van OaAEP1. Afhankelijk van eiwitconstructies gl-ubiquitine-NGL worden gebouwd op het glasoppervlak, herhaal de polyproteïne voorbereiding stappen n1 keer.Laat de laatste TEV decolletéreactie weg op reservesdarm op het eiwitpolymeer als cohesin-TEV-L-ubiquitine-n-NGL glas. Voeg een milliliter AFM-buffer met 10 millimolar calciumchloride en vijf millimolar ascorbinezuur toe aan de AFM-vloeistofkamer. Kies de D-tip van de gefunctionaliseerde AFM-sonde voor het experiment.Dompel de sonde onder in de AFM-buffer. Trek de cantilever met een constante snelheid van 400 nanometer per seconde van het oppervlak. In de tussentijd registreert u de krachtextensiecurve met een monstersnelheid van 4.000 hertz.Gebruik de stelling van de uitrustingsartition om de cantilever in afm buffer te kalibreren met een nauwkeurige veerconstante K-waarde voor elk experiment. Bevestig de cantilever tip gefunctionaliseerd met dockerine aan het eiwit gedeponeerd oppervlak gefunctionaliseerd met samenhangende cohesine om de samenhangende dockerin paar te vormen. Open vervolgens JPK-gegevensverwerkingssoftware en selecteer de force extension curve met het karakteristieke zaagtand-achtig patroon en een hoge onthechtingskracht.In deze studie hadden de NGL-residuen die door OaAEP1 ligatie tussen aangrenzende eiwitten werden geïntroduceerd geen invloed op de stabiliteit van eiwitmonomeer in het polymeer, uitgedrukt omdat de ontvouwende kracht en de toename van de contralengte vergelijkbaar waren met eerdere studie. De zuivering van de ferrische vorm rubredoxine gepresenteerd typische UV-gevisualiseerde absorptie pieken op 495 nanometer en 575 nanometer, terwijl de zinkvorm niet. SDS-pagina gel resultaten van de stapsgewijze spijsvertering en ligatie tonen samenhangende TEV-L-ubiquitine, het resultaat eiwit mengsel van TEV decolleté, pure GFP-TEV-protease, en purified product GL-ubiquitine.Ook het cleaved GL-ubiquitine en cohesin-TEV-L-ubiquitin ligatiemengsel met of zonder OaAEP1 en pure OaAEP1 worden getoond. Het is van cruciaal belang om het oppervlak te functionaliseren met actieve Sulfo-SMCC voor succesvol peptide bevestiging. Hier bieden we een nieuwe methode om gepolymeriseerde eiwitten te bouwen.Het vergemakkelijkt onderzoekers om complexe eiwit systeem met behulp van single-molecule kracht spectroscopie studie. Chromic zuur is sterk corrosief en zuur. Wees voorzichtig wanneer u zich voorbereidt en ermee omgaat.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Rapid One-step enzymatische synthese en All-waterige Zuivering van Trehalose analogen

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

High Precision FRET op single-molecuul niveau voor biomolecule structuur bepaling

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kracht spectroscopie van één eiwitmolecules met behulp van een Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molecuul manipulatie van G-quadruplexes door magnetische pincet

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Met behulp van 3 Single-molecuul FRET te bestuderen de correlatie van eiwitinteractie

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Covalente immobilisatie van eiwitten voor de enkel molecuul Force spectroscopie

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Een fluorescentie schommelingen spectroscopie Assay voor eiwit-eiwitinteractie op cel contacten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single cell analyse van transcriptioneel actieve allelen door single molecule FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study van ribosoom eiwitsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...