Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
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Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) et Shuangchuang De la province du Jiangsu.

1. Production de protéines
<ol><li>
Clone génétique
	<ol>
<li>Acheter des gènes codant pour la protéine d'intérêt (POI) : Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, le module de cellulose-contraignant (CBM), le domaine de dockerin-X (XDoc) et la cohésion de Ruminococcus flavefacience, le virus de l'etch de tabac (TEV), les polypeptides d'élastine-like (ELPs).</li>
		<li>Effectuer la réaction en chaîne de polymérase et utiliser le système d'enzymes de digestion à trois ...

Nous avons décrit un protocole pour la biosynthèse enzymatique et l'immobilisation de la polyprotéine et vérifié la conception de polyprotéine par SMFS AFM-basé. Cette méthodologie fournit une nouvelle approche à la construction de la protéine-polymère dans une séquence conçue, qui complète les méthodes précédentes pour l'ingénierie et l'immobilisation des polyprotéines4,6,52,53</s...

Comparéaux aux polymères synthétiques, les protéines multi-domaines naturelles ont une structure uniforme avec un nombre et un type bien contrôlés de sous-domaines1. Cette caractéristique conduit généralement à l'amélioration de la fonction biologique et la stabilité2,3. Beaucoup d'approches, telles que le couplage disulfure à base de cystéine et la technologie recombinante d'ADN, ont été développées pour construire une telle protéine polymérisée avec les domaines multiples4,5,6,7. Cependant, la première méthode aboutit toujours à une séquence aléatoire et incontrôlée, et la seconde conduit à d'autres problèmes, y compris la difficulté pour la surexpression des protéines toxiques et de grande taille et la purification de protéines complexes avec cofactor et d'autres enzymes délicates.
Pour relever ce défi, nous développons une méthode enzymatique qui combine monomère de protéines ensemble pour polymère / polyprotéine d'une manière progressive en utilisant une ligase de protéines OaAEP1 combiné avec une protéase TEV8,9. OaAEP1 est un endopeptidase strict et efficace. Deux protéines peuvent être reliées de façon covalente comme séquence Asn-Gly-Leu (NGL) à travers deux termini par OaAEP1 en moins de 30 min si le terminus N est résidus Dely-Leu (GL) et l'autre dont le c-terminus est résidus NGL10. Cependant, l'utilisation d'OaAEP1 seulement pour lier le monomère de protéine mène à un polymère de protéine avec une séquence incontrôlée comme la méthode de couplage cystéine-basée. Par conséquent, nous concevons le N-terminus de l'unité protéique avec un site amovible de protéase TEV plus un résidu de leucine comme ENLYFQ/G-L-POI. Avant le clivage TEV, le N-terminal ne participerait pas à la ligature OaAEP1. Et puis les résidus de GL à N-terminus, qui sont compatibles avec d'autres ligature OaAEP1, est exposé après le clivage TEV. Ainsi, nous avons réalisé une méthode de biosynthèse enzymatique séquentielle de polyprotéine avec une séquence relativement bien contrôlée.
Ici, notre méthode de synthèse enzymatique progressive peut être utilisée dans la préparation d'échantillons de polyprotéines, y compris la séquence contrôlée et incontrôlée, et l'immobilisation des protéines pour les études monomolécules ainsi, en particulier pour le système complexe tel que métalloprotéine.
De plus, les expériences SMFS basées sur l'AFM nous permettent de confirmer la construction et la stabilité des polymères protéiques au niveau d'une seule molécule. La spectroscopie de force d'une seule molécule, y compris l'AFM, la pince optique et la pince magnétique, est un outil général en nanotechnologie pour manipuler mécaniquement la biomolécule et mesurer leur stabilité11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. AFM monomolécule a été largement utilisé dans l'étude des protéines (non)pliage21,22,23,24,25, la mesure de la force de l'interaction récepteur-ligand26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, liaison chimique inorganique20,36,37,38,39,40,41,42,43 et métal-ligand bond en metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Ici, l'AFM monomolécule est utilisé pour vérifier la séquence de polyprotéine synthétisée basée sur le signal de progression de la protéine correspondante.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

Les techniques chimiques et de bioconjugation ont été développées rapidement ces dernières années et permettent la construction de polymères protéiques. Cependant, un processus de polymérisation des protéines contrôlée est toujours un défi. Ici, nous avons développé une méthodologie enzymatique pour construire des protéines polymérisées étape par étape dans une séquence rationnellement contrôlée. Dans cette méthode, le c-terminus d'un monomère de protéine est NGL pour la conjugaison de protéine utilisant OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) tandis que le N-terminus était un site de clivage cleavable de TEV (virus d'etch de tabac) plus un L (ENLYFQ/GL) pour la protection temporaire de N-terminal. Par conséquent, OaAEP1 a été en mesure d'ajouter un seul monomère de protéines à la fois, puis la protéase TEV clivé le N-terminus entre Q et G pour exposer le NH2-Gly-Leu. Ensuite, l'unité est prête pour la prochaine ligature OaAEP1. La polyprotéine modifiée est examinée en dépliant le domaine de protéine individuelle utilisant la spectroscopie de force unique à base de microscopie atomique (AFM-SMFS). Par conséquent, cette étude fournit une stratégie utile pour l'ingénierie et l'immobilisation des polyprotéines.

Les résidus de NGL introduits entre les protéines adjacentes par la ligature OaAEP1 n'affecteront pas la stabilité du monomère protéique dans le polymère, car la force qui se déroule (lt;Fuet l'augmentation de la longueur du contour (lt;Lc'estcomparable à l'étude précédente (Figure 1). Le résultat de purification de la protéine rubredoxine est montré dans la figure 2. Pour prouver la protéine après clivage TEV est compatible...

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OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Ici, nous présentons un protocole pour conjuguer le monomère de protéine par des enzymes formant le polymère de protéine avec une séquence commandée et l'immobiliser sur la surface pour des études de spectroscopie de force d'une molécule simple.

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Notre méthode enzymatique utilise l’oligomer protéique avec un nombre contrôlé de degré de polymérisation. Il s’agit d’une préparation parfaite de l’échantillon pour l’étude de la spectroscopie de force d’une molécule unique ainsi que la construction de matériaux à base de protéines. Notre méthode n’introduit pas la cystéine dans la protéine cible.Puisque la cystéine est l’un des résidus fonctionnels les plus importants pour la protéine, elle facilite la construction de la protéine ou des enzymes polymérisées de matière. Yibing Deng et Shengchao Shi, étudiants diplômés de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Pour commencer, dissoudre 20 grammes de chromate de potassium dans 40 millilitres d’eau ultrapure dans un bécher.Ajouter lentement 360 millilitres d’acide sulfurique concentré à la solution de dichromate de potassium et utiliser une tige de verre pour remuer doucement. Placer un couvercle en verre dans l’acide chromique et le transférer au four à 80 degrés Celsius pendant 30 minutes. Nettoyez le coverslip avec de l’eau, puis de l’alcool éthylique absolu et séchez le coverslip avec un jet d’azote.Immerger complètement le coverslip en 1% de volume par volume APTES solution toluène pendant une heure à température ambiante tout en les protégeant de la lumière. Lavez le coverslip avec du toluène d’abord, puis avec de l’alcool éthylique absolu et séchez le coverslip avec un jet d’azote. Incuber le coverslip à 80 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis laisser refroidir à température ambiante.Utilisez une pipette pour ajouter 200 microlitres d’un milligramme par millilitre Sulfo-SMCC dans la solution DMSO entre deux coverslips immobilisés et incuber pendant une heure à l’abri de la lumière. Après une heure, laver les coverslips avec DMSO d’abord, puis avec de l’alcool éthylique absolu pour éliminer sulfo-SMCC résiduel. Sécher le coverslip sous un jet d’azote.Pipette 60 microlitres de 200 micromolaires GL-ELP-50 cys-protéine solution sur un coverslip fonctionnalisé et incuber à 25 degrés Celsius pendant environ trois heures. Après cela, laver le coverslip avec de l’eau ultrapure pour enlever les GL-ELP-50-cys non réagis. Pour préparer la surface fonctionnelle en porte-à-faux, plongez d’abord les cantilevers dans de l’acide chromique et nettoyez les cantilevers à 80 degrés Celsius pendant 10 minutes.Utilisez de l’eau et de l’alcool éthylique absolu pour laver l’acide. Immerger le porte-à-faux avec 1% de volume par volume APTES solution toluène pour effectuer la salinisation des acides aminés dans un bouchon de tube en plastique pendant une heure. Rincer le porte-à-faux avec de l’alcool éthylique absolu, puis cuire le porte-à-faux à 80 degrés Celsius pendant 15 minutes.Plongez le porte-à-faux dans la solution Sulfo-SMCC pendant une heure, puis rincez le porte-à-faux avec de l’alcool éthylique absolu. Pour relier les cys-ELP-50-NGL à la surface, plongez les cantilevers dans les cys-ELP-50-NGL avec le groupe maleimide de Sulfo-SMCC pendant 1,5 heure. Ensuite, lavez les cys-ELP-50-NGL non réagis sur le porte-à-faux par de l’eau ultrapure.Ensuite, immerger un porte-à-faux fonctionnalisé dans une solution contenant 200 microlitres de 50 micromolaires GL-CBM-XDockerin solution de protéines avec 200 nanomolaires OaAEP1 et les placer à 25 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes. Utilisez ensuite le tampon AFM pour laver les protéines non réagies. Il est essentiel de laver les protéines résiduelles non réagies avant l’expérience AFM, car elle formera une paire de cohésine-dockerine et le bloc du porte-à-faux pour prendre de nouvelles protéines à la surface.Pour relier l’unité de ligature cohesin-T-L-protéine d’intérêt-NGL à la GL-ELP-50 immobilisée sur la surface du coverslip, ajoutez 15 microlitres d’OaAEP1 sur le coverslip et laissez-la incuber pendant 30 minutes. Utilisez 15 à 20 millilitres de tampon AFM pour laver les protéines non réagies. Ajouter 100 microlitres de protéase TEV pour fendre l’unité protéique au site de reconnaissance TEV pendant une heure à 25 degrés Celsius.Utilisez ensuite 15 à 20 millilitres de tampon AFM pour laver les protéines résiduelles. Reliez l’unité de ligature cohésine-T-L-protéine d’intérêt-NGL au verre GL-ubiquitin-NGL par OaAEP1 pendant 30 minutes. Selon les constructions protéiques GL-ubiquitine-NGL à construire sur la surface du verre, répétez les étapes de préparation de polyprotéine n1 fois.Omettre la dernière réaction de clivage TEV pour réserver la cohésine sur le polymère protéique sous forme de verre cohesin-TEV-L-ubiquitin-n-NGL. Ajouter un millilitre de tampon AFM avec du chlorure de calcium de 10 millimlaires et cinq millimolaires d’acide ascorbique à la chambre fluide de l’AFM. Choisissez la pointe D de la sonde AFM fonctionnalisée pour l’expérience.Plongez la sonde dans le tampon AFM. Rétractez le porte-à-faux à une vitesse constante de 400 nanomètres par seconde de la surface. Entre-temps, enregistrez la courbe d’extension de la force à un taux d’échantillon de 4000 hertz.Utilisez le théorem d’équipartition pour calibrer le porte-à-faux dans le tampon AFM avec une valeur K constante de ressort précise avant chaque expérience. Fixez la pointe en porte-à-faux fonctionnalisée avec de la dockerine à la surface déposée par protéine fonctionnalisée avec de la cohesine pour former la paire cohesin-dockerin. Ouvrez ensuite le logiciel de traitement des données JPK et sélectionnez la courbe d’extension de force avec le motif caractéristique en forme de tooth et une force de détachement élevée.Dans cette étude, les résidus de NGL introduits entre les protéines adjacentes par la ligature OaAEP1 n’ont pas affecté la stabilité du monomère protéique dans le polymère exprimé car la force de déroulement et l’incrément de contre-longueur étaient comparables à ceux de l’étude précédente. La purification de la rubredoxine de forme ferrique a présenté des pics typiques d’absorption UV-visualisés à 495 nanomètres et 575 nanomètres tandis que la forme de zinc n’a pas. Les résultats typiques de gel de SDS-page de la digestion et de la ligature stepwise montrent tev-L-ubiquitine cohésif, le mélange de protéine de résultat du clivage de TEV, du GFP-TEV-protease purifié, et du produit purifié GL-ubiquitin.Le mélange de ligature GL-ubiquitine fendus et cohesin-TEV-L-ubiquitine avec ou sans OaAEP1 et oaAEP1 pur sont également montrés. Il est essentiel de fonctionnaliser la surface avec sulfo-SMCC actif pour réussir l’attachement peptidique. Ici, nous fournissons une nouvelle méthode pour construire des protéines polymérisées.Il facilite les chercheurs à étudier le système protéique complexe à l’aide de la spectroscopie de force à molécule unique. L’acide chromique est fortement corrosif et acide. Soyez prudent lorsque vous le préparez et le manipulez.

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