Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. BK20160639) und Shuangchuang-Programm der Provinz Jiangsu.

1. Proteinproduktion
<ol><li>
Genklon
	<ol>
<li>Kaufen Sie Gene, die für das Protein von Interesse (POI) kodieren: Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, das Cellulose-Bindungsmodul (CBM), dockerin-X Domain (XDoc) und Kohäsion aus Ruminococcus flavefacience, Tabak-Etch-Virus (TEV) Protease, Elastin-ähnliche Polypeptide (ELPs).</li>
		<li>Führen Sie polymerase-Kettenreaktion durch und verwenden Sie das Drei-Restriktions-Verdauungsenzymsystem BamHI-BglII-...

Wir haben ein Protokoll zur enzymatischen Biosynthese und Immobilisierung von Polyprotein beschrieben und das Polyproteindesign durch AFM-basierte SMFS verifiziert. Diese Methode bietet einen neuartigen Ansatz für den Aufbau des Protein-Polymers in einer entworfenen Sequenz, die frühere Methoden für Polyprotein-Engineering und Immobilisierung4,6,52,53,54<su...

Im Vergleich zu synthetischen Polymeren haben natürliche Mehrdomänenproteine eine einheitliche Struktur mit einer gut kontrollierten Anzahl und Art der Subdomains1. Diese Funktion führt in der Regel zu einer verbesserten biologischen Funktion und Stabilität2,3. Viele Ansätze, wie z. B. die Zysulfidbindungskopplung und die rekombinante DNA-Technologie, wurden für den Aufbau eines solchen polymerisierten Proteins mit mehreren Domänen4,5,6,7entwickelt. Die erste Methode führt jedoch immer zu einer zufälligen und unkontrollierten Sequenz, und die zweite führt zu anderen Problemen, einschließlich der Schwierigkeit für die Überexpression toxischer und großformatigen Proteine und der Reinigung komplexer Proteine mit Kofaktor und anderen empfindlichen Enzymen.
Um dieser Herausforderung gerecht zu werden, entwickeln wir eine enzymatische Methode, die Proteinmonomer für Polymer/Polyprotein schrittweise mit einer Proteinligase OaAEP1 in Kombination mit einem Protease TEV8,9konjugiert. OaAEP1 ist eine strenge und effiziente Endopeptidase. Zwei Proteine können kovalent als Asn-Gly-Leu-Sequenz (NGL) durch zwei Termini von OaAEP1 in weniger als 30 min verbunden werden, wenn der N-Terminus Gly-Leu-Rückstände(GL) und das andere, von dem der C-Terminus NGL-Rückstände10ist. Die Verwendung von OaAEP1 führt jedoch nur zur Verknüpfung von Proteinmonomer zu einem Proteinpolymer mit einer unkontrollierten Sequenz wie der Cystein-basierten Kopplungsmethode. Daher entwerfen wir den N-Terminus der Proteineinheit mit einer abnehmbaren TEV-Protease-Site plus einem Leucin-Rückstand als ENLYFQ/G-L-POI. Vor der TEV-Spaltung würde das N-Terminal nicht an der OaAEP1-Liga teilnehmen. Und dann werden die GL-Rückstände am N-terminus, die mit weiterer OaAEP1-Ligatur kompatibel sind, nach der TEV-Spaltung freigelegt. So haben wir eine sequenzielle enzymatische Biosynthesemethode von Polyprotein mit einer relativ gut kontrollierten Sequenz erreicht.
Hier kann unsere schrittweise enzymatische Synthesemethode in der Polyproteinprobenvorbereitung eingesetzt werden, einschließlich sequenzgesteuerter und unkontrollierter, und Proteinimmobilisierung auch für Einzelmolekül-Studien, insbesondere für das komplexe System wie Metalloprotein.
Darüber hinaus ermöglichen uns AFM-basierte SMFS-Experimente, die Proteinpolymerkonstruktion und -stabilität auf Einzelmolekülebene zu bestätigen. Die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie, einschließlich AFM, optischer Pinzette und magnetischer Pinzette, ist ein allgemeines Werkzeug in der Nanotechnologie, um Biomoleküle mechanisch zu manipulieren und deren Stabilität zu messen11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Ein-Molekül AFM wurde weit verbreitet in der Untersuchung von Protein (un)folding21,22,23,24,25, die Festigkeitsmessung der Rezeptor-Ligand-Wechselwirkung26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, anorganische chemische Bindung20,36,37,38,39,40,41,42,43 und Metall-Ligand-Bindung in Metallprotein44,45,46,47,48,49,50 . Hier wird einmolekulares AFM verwendet, um die synthetisierte Polyproteinsequenz auf Basis des entsprechenden Proteinentfaltungssignals zu verifizieren.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

Chemische und biokonjugationische Techniken wurden in den letzten Jahren schnell entwickelt und ermöglichen den Aufbau von Proteinpolymeren. Ein kontrollierter Proteinpolymerisationsprozess ist jedoch immer eine Herausforderung. Hier haben wir eine enzymatische Methodik entwickelt, um polymerisiertes Protein Schritt für Schritt in einer rational gesteuerten Sequenz zu konstruieren. Bei dieser Methode ist der C-Terminus eines Proteinmonomers NGL für die Proteinkonjugation mit OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1), während der N-Terminus eine skleavable TEV (Tabak-Etch-Virus) Spaltungsstelle plus ein L (ENLYFQ/GL) zum vorübergehenden N-Terminal-Schutz war. Folglich konnte OaAEP1 jeweils nur ein Proteinmonomer hinzufügen, und dann spaltete die TEV-Protease die N-Terminus zwischen Q und G, um den NH2-Gly-Leu freizulegen. Dann ist das Gerät bereit für die nächste OaAEP1 Ligation. Das entwickelte Polyprotein wird durch Die Entfaltung einzelner Proteindomäne mittels atomarer Mikroskopie-basierter Einzelmolekül-Kraftspektroskopie (AFM-SMFS) untersucht. Daher bietet diese Studie eine nützliche Strategie für Die Polyprotein-Engineering und Immobilisierung.

Die NGL-Rückstände, die durch OaAEP1-Ligation zwischen benachbarten Proteinen eingebracht werden, haben keinen Einfluss auf die Proteinmonomerstabilität im Polymer, da die Entfaltungskraft (<Fu>) und das Konturlängeninkrement (<-Lc>) mit der vorherigen Studie vergleichbar ist (Abbildung 1). Das Reinigungsergebnis des Rubredoxin-Proteins ist in Abbildung 2dargestellt. Um das Protein nach der TEV-Spaltung zu beweisen, ist es kompatibel mi...

Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Hier stellen wir ein Protokoll zur Konjugierung von Proteinmonomer durch Enzyme vor, die Proteinpolymere mit einer kontrollierten Sequenz bilden, und immobilisieren es auf der Oberfläche für Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studien.

OaAEP1-Vermittelte enzymatische Synthese und Immobilisierung von polymerisiertem Protein für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Unsere enzymatische Methode verwendet Proteinoligomer mit einer kontrollierten Anzahl von Polymerisationsgraden. Es ist eine perfekte Probenvorbereitung für die Einzelmolekül-Kraftspektroskopie-Studie sowie die proteinbasierte Materialkonstruktion. Unsere Methode führt kein Cystein in das Zielprotein ein.Da Cystein einer der wichtigsten funktionellen Rückstände für Proteine ist, erleichtert es den Aufbau von polymerisiertem Materieprotein oder Enzymen. Demonstriert wird das Verfahren von Yibing Deng und Shengchao Shi, Grad-Studenten aus meinem Labor. Zu Beginn 20 Gramm Kaliumchromat in 40 Milliliter Reinstwasser in einem Becher auflösen.360 Milliliter konzentrierte Schwefelsäure langsam in die Kaliumdichromatlösung geben und mit einer Glasstange sanft rühren. Einen Glasdeckel in die Chromsäure geben und 30 Minuten bei 80 Grad Celsius in einen Ofen geben. Reinigen Sie den Deckelrutsch mit Wasser und dann absoluten Ethylalkohol und trocknen Sie den Deckelrutsch mit einem Stickstoffstrom.Tauchen Sie den Deckelschlupf in 1%Volumen pro Volumen APTES Toluluenlösung für eine Stunde bei Raumtemperatur ein und schützen sie vor Licht. Waschen Sie den Deckelrutsch zuerst mit Toluin und dann mit absolutem Ethylalkohol und trocknen Sie den Deckelrutsch mit einem Stickstoffstrom. Den Deckelrutsch bei 80 Grad Celsius 15 Minuten lang inkubieren und dann auf Raumtemperatur abkühlen lassen.Verwenden Sie eine Pipette, um 200 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Sulfo-SMCC in DMSO-Lösung zwischen zwei immobilisierten Abdeckungen hinzuzufügen und für eine Stunde vor Licht geschützt zu inkubieren. Nach einer Stunde die Deckelmitlipse zuerst mit DMSO und dann mit absolutem Ethylalkohol waschen, um Denrest Sulfo-SMCC zu entfernen. Trocknen Sie den Deckelunterstrich unter einem Stickstoffstrom.60 Mikroliter 200 Mikromolien GL-ELP-50 Cys-Protein-Lösung auf einen funktionalisierten Deckelschlupf und inkubieren bei 25 Grad Celsius für etwa drei Stunden. Danach den Deckelrutsch mit reinstem Wasser waschen, um die unreagierten GL-ELP-50-Cys zu entfernen. Um die funktionalisierte Auslegeroberfläche vorzubereiten, tauchen Sie zunächst die Ausleger in Chromsäure ein und reinigen Sie die Ausleger bei 80 Grad Celsius für 10 Minuten.Verwenden Sie Wasser und absoluten Ethylalkohol, um die Säure wegzuwaschen. Tauchen Sie den Ausleger mit 1%Volumen pro Volumen APTES Tolululuin-Lösung ein, um eine Stunde lang eine Aminosalinisierung in einer Kunststoffrohrkappe durchzuführen. Spülen Sie den Ausleger mit absolutem Ethylalkohol und backen Sie den Ausleger bei 80 Grad Celsius 15 Minuten.Den Ausleger eine Stunde in Sulfo-SMCC-Lösung eintauchen und dann mit absolutem Ethylalkohol abspülen. Um die cys-ELP-50-NGL mit der Oberfläche zu verbinden, tauchen Sie die Ausleger 1,5 Stunden lang in die cys-ELP-50-NGL mit der Maleimidgruppe von Sulfo-SMCC ein. Dann waschen Sie die unreagierten Zys-ELP-50-NGL auf dem Ausleger durch Reinstwasser weg.Als nächstes tauchen Sie einen funktionalisierten Ausleger in eine Lösung ein, die 200 Mikroliter 50 Mikroliter GL-CBM-XDockerin-Proteinlösung mit 200 Nanomolar OaAEP1 enthält, und legen Sie sie 20 bis 30 Minuten bei 25 Grad Celsius ab. Verwenden Sie dann den AFM-Puffer, um unreagiertes Protein wegzuwaschen. Es ist wichtig, unreagiertes Restprotein vor dem AFM-Experiment wegzuwaschen, da es ein Kohesin-Dockerin-Paar bildet und der Block der Ausleger, um neues Protein auf der Oberfläche aufzunehmen.Um das Ligationseinheit-Cohesin-T-L-Protein von interest-NGL mit dem auf der Deckbedeckungsoberfläche immobilisierten GL-ELP-50 zu verbinden, fügen Sie 15 Mikroliter OaAEP1 auf den Deckelschlupf ein und lassen es 30 Minuten brüten. Verwenden Sie 15 bis 20 Milliliter AFM-Puffer, um unreagierte Proteine wegzuwaschen. Fügen Sie 100 Mikroliter TEV-Protease hinzu, um die Proteineinheit am TEV-Erkennungsstandort eine Stunde lang bei 25 Grad Celsius zu spalten.Verwenden Sie dann 15 bis 20 Milliliter AFM-Puffer, um Restproteine wegzuwaschen. Verknüpfen Sie die Ligationseinheit cohesin-T-L-Protein von interest-NGL 30 Minuten lang mit dem GL-ubiquitin-NGL Glas von OaAEP1. Je nach Proteinkonstrukte GL-Ubiquitin-NGL, die auf der Glasoberfläche aufgebaut werden soll, wiederholen Sie die Polyproteinvorbereitungsschritte n1 mal.Lassen Sie die letzte TEV-Spaltungsreaktion aus, um Cohesin auf dem Proteinpolymer als Cohesin-TEV-L-Ubiquitin-n-NGL-Glas zu reservieren. Fügen Sie einen Milliliter AFM-Puffer mit 10 Millimolar Calciumchlorid und fünf Millimolar-Ascorbinsäure in die AFM-Flüssigkeitskammer. Wählen Sie die D-Spitze der funktionalisierten AFM-Sonde für das Experiment aus.Tauchen Sie die Sonde in den AFM-Puffer ein. Ziehen Sie den Ausleger mit einer konstanten Geschwindigkeit von 400 Nanometern pro Sekunde von der Oberfläche ab. Zeichnen Sie in der Zwischenzeit die Kraftverlängerungskurve mit einer Abtastrate von 4.000 Hertz auf.Verwenden Sie den Equipartitionssatz, um den Ausleger im AFM-Puffer vor jedem Experiment mit einem genauen Federkonstanten-K-Wert zu kalibrieren. Befestigen Sie die mit Dockerin funktionalisierte Auslegerspitze an der mit Kohesin funktionalisierten Protein-Ablagefläche, um das Kohesin-Dockerin-Paar zu bilden. Öffnen Sie dann die JPK-Datenverarbeitungssoftware und wählen Sie die Kraftverlängerungskurve mit dem charakteristischen Sägezahn-ähnlichen Muster und einer hohen Absenkraft.In dieser Studie hatten die NGL-Rückstände, die durch OaAEP1-Ligation zwischen benachbarten Proteinen eingebracht wurden, keinen Einfluss auf die Proteinmonomerstabilität im Polymer, ausgedrückt als die Entfaltungskraft und das Contra-Längen-Inkrement mit früheren Studien vergleichbar war. Die Reinigung von Eisenform Rubredoxin zeigte typische UV-visualisierte Absorptionsspitzen bei 495 Nanometern und 575 Nanometern, während die Zinkform dies nicht tat. SDS-Seiten-Gel-Ergebnisse der schrittweisen Verdauung und Ligation zeigen kohäsives TEV-L-Ubiquitin, die Ergebnisproteinmischung aus TEV-Spaltung, reiner GFP-TEV-Protease und gereinigtem Produkt GL-Ubiin.Die gespaltete GL-Ubiquitin und Cohesin-TEV-L-Ubiquitin Ligationsmischung mit oder ohne OaAEP1 und reines OaAEP1 werden ebenfalls gezeigt. Es ist wichtig, die Oberfläche mit aktivem Sulfo-SMCC für eine erfolgreiche Peptidbefestigung zu funktionalisieren. Hier bieten wir eine neue Methode, um polymerisiertes Protein zu bauen.Es erleichtert Forschern, komplexe Proteinsysteme mit einer Einzelmolekül-Kraftspektroskopie zu untersuchen. Chromsäure ist stark korrosiv und sauer. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie es vorbereiten und behandeln.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Schnelle Ein-Schritt-enzymatische Synthese und All-wässrige Reinigung von Trehalose Analogen

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Forschung

Biochemie

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hochpräzisions-FRET auf Einzelmolekül-Niveau für die Bestimmung der Biomolekülstruktur

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Einzelmolekül-Manipulation von G-Quadruplexe von magnetischen Pinzette

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Verwendung von dreifarbigen Einzelmolekül-Bund, die Korrelation von Protein-Interaktionen zu studieren

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente Immobilisierung von Proteinen für die Einzelmolekül-Spektroskopie Kraft

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-weite Quantifizierung des Benennens Homogenität auf der Ebene des einzelnen Moleküls

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Einzelzellanalyse transkriptionell aktiver Allele mittels Einzelmolekül FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Einzelmolekül-Fluoreszenz-Energieübertragungsstudie zur Ribosomenproteinsynthese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...