Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (גרנט No. 21771103, 21977047), הקרן המדע הטבעי של מחוז ג'יאנגסו (גרנט לא. BK20160639) ו Shuangchuang התוכנית של מחוז ג'יאנגסו.

1. הפקת חלבון
<ol><li>
שיבוט ג'ין
	<ol>
<li>לרכוש גנים קידוד עבור חלבון העניין (פוי): אוביקוויסין, Rubredoxin (RD)51, מודול מחייב תאית (cbm), הפריצה לתחום X (xdoc) ו לכידות מ Ruמינוקוקוס flavefacience, וירוס איכול טבק (tev) פרוטאז, אלסטין כמו פוליפפטידים (elps).</li>
		<li>לבצע תגובת שרשרת פולימראז ולהשת?...

תיארנו פרוטוקול לביוסינתזה אנזימטית והשתק של פוליפרוטאין ואימת את עיצוב הפוליפרוטאין באמצעות SMFS מבוסס AFM. מתודולוגיה זו מספקת גישה הרומן לבניית חלבון-פולימרים ברצף מעוצב, אשר משלים את השיטות הקודמות עבור הנדסת פוליפרוטאין ומשתק4,6,52,</...

לעומת פולימרים סינתטיים, טבעי מרובת תחומים חלבונים יש מבנה אחיד עם מספר מבוקרת היטב סוג של תת תחומים1. תכונה זו מובילה בדרך כלל לשיפור תפקוד ביולוגי ויציבות2,3. גישות רבות, כגון מבוססי cysteine קשר קשר דיסולפידי בונד וטכנולוגיית ה-DNA רקומביננטי, פותחו לבניית חלבון כזה פולימרין עם תחומים מרובים4,5,6,7. עם זאת, השיטה הקודמת תמיד גורמת לרצף אקראי ובלתי מבוקר, והאחרון מוביל לבעיות אחרות, כולל הקושי להבעת היתר של חלבונים רעילים בגודל גדול וטיהור של חלבון מורכב עם קופקטור ואנזימים עדינים אחרים.
כדי לענות על האתגר הזה, אנו מפתחים שיטה אנזימטית אשר מעלה באוב חלבון מונומר ביחד עבור פולימר/פוליפרוטאין בצורה מעניינת בעזרת ליגאז חלבון OaAEP1 בשילוב עם פרוטאז tev8,9. OaAEP1 הוא endopeptidase קפדנית ויעילה. שני חלבונים יכולים להיות מקושרים בעקשנות כמו הרצף Asn-לי-Leu (NGL) דרך שני termini על ידי OaAEP1 בתוך פחות מ 30 דקות אם הטרמינוס N-Leu משקעים (GL) והשני שבו C-טרמינוס הוא שאריות NGL10. עם זאת, השימוש OaAEP1 רק כדי לקשר מונומר חלבון מוביל לפולימר חלבון עם רצף בלתי מבוקרת כמו שיטת הזיווג המבוסס cysteine. לכן, אנו לעצב את N-הטרמינוס של יחידת החלבון עם האתר של TEV פרוטאז נשלף בתוספת שאריות לאוצין כמו ENLYFQ/G-L-לפוי. לפני המחשוף של TEV, ה-N-terminal לא ישתתף בOaAEP1. ואז שאריות GL ב-N-טרמינוס, אשר תואמים OaAEP1 ליטל נוסף, נחשף לאחר מחשוף TEV. לפיכך, השגנו שיטה ביוסינתזה אנזימטית רציפה של פוליפרוטאין עם רצף מבוקר יחסית.
כאן, שיטת הסינתזה הצעדיטית שלנו יכולה לשמש בהכנה לדגימת פוליפרוטאין, כולל מבוקרת רצף ובלתי מבוקרת, ומשתק חלבונים גם למחקרים חד-מולקולות, במיוחד למערכת המורכבת כגון מטאלופרוטאין.
יתר על כן, ניסויים AFM מבוססי מאפשר לנו לאשר את הבנייה פולימר חלבון בנייה ויציבות ברמה חד מולקולה. מולקולה בודדת ספקטרוסקופיית כוח, כולל afm, הטוויטר אופטי ו פינצטה מגנטי, הוא כלי כללי בננו-טכנולוגיה כדי לתמרן ביואוכאל מכנית ולמדוד את היציבות שלהם11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. מולקולה בודדת afm כבר בשימוש נרחב במחקר של חלבון (האו ם) קיפול21,22,23,24,25, מדידת כוח של קולטן-ligandאינטראקציה 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, בונד כימי אורגני20,36,37,38,39,40,41,42,43 ו-ligand בונד ב-מטאלופרוטאין44,45,46,47,48, 49,50 . כאן, מולקולה יחידה AFM משמש כדי לאמת את רצף פוליפרוטאין מסונתז מבוסס על האות חלבון התגלגלות המקביל.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

טכניקות כימיות וביו-קוניוגציה פותחו במהירות בשנים האחרונות ומאפשרות לבניית פולימרים של חלבונים. בכל אופן, תהליך של חלבון מבוקר. הוא תמיד אתגר בשלב זה פיתחנו מתודולוגיה אנזימטית לבניית שליטת החלבון צעד אחר צעד ברצף הנשלט באופן רציונלי. בשיטה זו, C-טרמינוס של מונומר חלבון הוא NGL עבור הקוניוגציה חלבון באמצעות OaAEP1 (Oldenlandia נדיה affinis asparaginyl endop) 1) בעוד N-טרמינוס היה tev בקליקל (וירוס איכול טבק) באתר מחשוף ועוד L (ENLYFQ/GL) להגנה זמנית N-terminal. כתוצאה מכך, OaAEP1 הייתה מסוגלת להוסיף רק מונומר חלבון אחד בכל פעם, ואז פרוטאז TEV ביקעה את ה-N-טרמינוס בין Q ו-G כדי לחשוף את NH2-בסדר-Leu. ואז היחידה מוכנה. לOaAEP1 הבאה פוליפרוטאין מהונדס נבדק על ידי מתחם חלבון בודד התפתחות באמצעות מיקרוסקופ כוח אטום מבוססי כוח מולקולה בודדת ספקטרוסקופיה (AFM-SMFS). לכן, מחקר זה מספק אסטרטגיה שימושית עבור הנדסת פוליפרוטאין ו השתק.

שאריות NGL הציג בין חלבונים סמוכים על ידי OaAEP1 הקשר לא ישפיע על יציבות החלבון מונומר בפולימר כמו כוח התפתחות (< Fu>), ואת אורך מתאר להגדיל (< ΔLc>) הוא דומה למחקר הקודם (איור 1). תוצאת הטיהור של החלבון rubredoxin מוצג באיור 2. כדי להוכיח את החלבון לאחר מחשוף TEV תו...

Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלים מונומר חלבון על ידי אנזימים היוצרים פולימר פולימרי עם רצף מבוקר ומשתק אותו על פני השטח עבור לימודי מולקולה בודדת של כוח ספקטרוסקופיית.

OaAEP1-תיווך אנזימטית והשתק של חלבון פלסטריזציה לספקטרוסקופיית מולקולות יחיד

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

השיטה האנזימטית שלנו משתמשת אוליגומר חלבון עם מספר מבוקר של תואר פילמיזציה. זוהי הכנת מדגם מושלמת למחקר ספקטרוסקופיה כוח מולקולה אחת, כמו גם בניית חומר מבוסס חלבון. השיטה שלנו אינה מציגה ציסטאין לחלבון היעד.בגלל ציסטאין הוא אחד השאריות הפונקציונליות החשובות ביותר עבור חלבון, זה מקל על בניית חלבון חומר פולימרי או אנזימים. הדגמת ההליך תהיה יבינג דנג ושנגחאו שי, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להמיס 20 גרם של כרומט אשלגן ב 40 מיליליטר של מים אולטרה רגליים בבקבוק.מוסיפים לאט 360 מיליליטר של חומצה גופרתית מרוכזת לתופת dichromate אשלגן ולהשתמש מוט זכוכית לבחוש בעדינות. מניחים כיסוי בחומצה הכרומית ומעבירים לתנור ב 80 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. נקה את הכיסויים במים ולאחר מכן אלכוהול אתיל מוחלט וייבש את הכיסויים עם זרם של חנקן.טבול לחלוטין את הכיסויים בנפח של 1% לפי נפח APTES פתרון טולואן למשך שעה בטמפרטורת החדר תוך הגנה עליהם מפני אור. לשטוף את הכיסוי עם טולואן הראשון ולאחר מכן עם אלכוהול אתיל מוחלט לייבש את הכיסוי עם זרם של חנקן. דגירה כיסוי ב 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ולאחר מכן לתת לו להתקרר לטמפרטורת החדר.השתמשו בפיפטה כדי להוסיף 200 מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר Sulfo-SMCC בתסרון DMSO בין שני כיסויים משותקים ודגירה למשך שעה מוגנת מפני אור. לאחר שעה, לשטוף את הכיסויים עם DMSO הראשון ולאחר מכן עם אלכוהול אתיל מוחלט כדי להסיר שאריות Sulfo-SMCC. יבש את הכיסוי תחת זרם של חנקן.פיפטה 60 מיקרוליטר של 200 GL-ELP-50 מיקרומולרי פתרון חלבון ציסטה על כיסוי פונקציונלי דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך כשלוש שעות. לאחר מכן, לשטוף את כיסוי עם מים אולטרה-חוץ כדי להסיר את GL-ELP-50-cys שלא נותק. כדי להכין משטח cantilever פונקציונלי, תחילה לטבול את cantilevers בחומצה כרומית ולנקות את cantilevers ב 80 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.השתמש במים ואלכוהול אתיל מוחלט לשטוף את החומצה. לטבול את cantilever עם 1% נפח לפי נפח APTES פתרון toluene לבצע מליחות אמינו במכסה צינור פלסטיק במשך שעה אחת. לשטוף את cantilever עם אלכוהול אתיל מוחלט ולאחר מכן לאפות את cantilever ב 80 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.לטבול את cantilever ב פתרון Sulfo-SMCC במשך שעה אחת ולאחר מכן לשטוף את cantilever עם אלכוהול אתיל מוחלט. כדי לקשר את cys-ELP-50-NGL אל פני השטח, לטבול את cantilevers ב cys-ELP-50-NGL עם הקבוצה maleimide של Sulfo-SMCC במשך 1.5 שעות. ואז לשטוף את cys-ELP-50-NGL לא ערוך על cantilever על ידי מים אולטרה חוץ.לאחר מכן, לטבול cantilever פונקציונלי בתתא המכיל 200 microliters של 50 מיקרומולרי GL-CBM-XDockerin פתרון חלבון עם 200 nanomolar OaAEP1 ולמקם אותם ב 25 מעלות צלזיוס במשך 20 עד 30 דקות. לאחר מכן השתמשו במאגר AFM כדי לשטוף חלבון לא מופק. זה קריטי לשטוף חלבון שיורית לא מוצהר לפני ניסוי AFM כי זה יהיה ליצור זוגות מלוהסין-dockerin ואת הבלוק cantilever לקחת חלבון חדש על פני השטח.כדי לקשר את יחידת הרצועות cohesin-T-L-חלבון של עניין-NGL כדי GL-ELP-50 משותק על משטח coverslip, להוסיף 15 microliters של OaAEP1 על coverslip ולתת לו דגירה במשך 30 דקות. השתמש 15 עד 20 מיליליטר של חיץ AFM לשטוף את כל החלבונים שלא נותק. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של פרוטאז TEV כדי לחשוף את יחידת החלבון באתר זיהוי TEV למשך שעה ב-25 מעלות צלזיוס.לאחר מכן השתמש 15 עד 20 מיליליטר של חיץ AFM לשטוף את החלבונים שיורית. לקשר את יחידת הרצועות cohesin-T-L-חלבון של עניין-NGL לזכוכית GL-ubiquitin-NGL על ידי OaAEP1 במשך 30 דקות. בהתאם לחלבון בונה GL-ubiquitin-NGL להיבנות על משטח הזכוכית, לחזור על צעדי הכנת פוליפרוטאין n1 פעמים.השמט את תגובת המחשוף האחרונה של TEV כדי לשמור על לכידות על פולימר החלבון כזכוכית לכידות-TEV-L-ubiquitin-n-NGL. הוסף מיליליטר אחד של חיץ AFM עם 10 מילימולר סידן כלורי וחומצה אסקורבית מילימולרית לתא הנוזלים AFM. בחר את קצה ה- D של גשושית AFM המתפקדת עבור הניסוי.לטבול את החללית במאגר AFM. נסיגה cantilever במהירות קבועה של 400 ננומטר לשנייה מפני השטח. בינתיים, תקליט את עקומת הארכת הכוח בקצב מדגם של 4,000 הרץ.השתמשו במאורת האקוויפרטציה כדי לכייל את ה-cantilever במאגר AFM עם ערך K קבוע קפיץ מדויק לפני כל ניסוי. חבר את קצה cantilever פונקציונלי עם דוקרין למשטח המופקד חלבון פונקציונלי עם לכידות כדי ליצור את זוג מלוהסין-דוקרין. לאחר מכן פתחו את תוכנת עיבוד הנתונים JPK ובחרו עקומת הרחבת כוח עם התבנית האופיינית דמוית המסור וכוח ניתוק גבוה.במחקר זה, שאריות NGL שהוכנסו בין חלבונים סמוכים על ידי קשירה OaAEP1 לא השפיעו על יציבות מונומר חלבון בפולימר לידי ביטוי ככוח המתפתח תוספת אורך קונטרה היה דומה עם מחקר קודם. הטיהור של רוברדוקסין בצורת ברזל הציג פסגות ספיגה טיפוסיות של UV ב-495 ננומטר ו-575 ננומטר ואילו צורת האבץ לא. תוצאות ג'ל SDS-page של עיכול צעד ו קשירה להראות מגולל TEV-L-ubiquitin, תערובת החלבון תוצאה של מחשוף TEV, טהור GFP-TEV-פרוטאז, מוצר מטוהר GL-ubiquitin.תערובת קשירה GL-ubiquitin מקולקל ו לכידות-TEV-L-ubiquitin עם או בלי OaAEP1 ו OaAEP1 טהור מוצגים גם כן. זה קריטי כדי לתפקד את פני השטח עם פעיל Sulfo-SMCC עבור מצורף פפטיד בהצלחה. כאן אנו מספקים שיטה חדשה לבניית חלבון פולימרי.זה מקל על החוקרים לחקור מערכת חלבון מורכבת באמצעות ספקטרוסקופיית כוח מולקולה אחת. חומצה כרומית היא מאוד מאכלת וחומצית. היזהר כשאתה מכין ומטפל בזה.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

צעד אחד ראפיד סינתזה האנזימטית-כל מימית טיהור של אנלוגים trehalose

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

דיוק גבוהה סריג ברמת מולקולה בודדת עבור קביעת מבנה ביומולקולה

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

באמצעות תלת-צבעי קשת/קשתית מולקולה בודדת ללמוד הקורלציה של אינטראקציות חלבון

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

ניתוח תא יחיד של אללים פעילים בתעתיק על ידי מולקולה אחת FISH

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...