Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant no. BK20160639) e il programma Shuangchuang della provincia di Jiangsu.

1. Produzione di proteine
<ol><li>
Clone genico
	<ol>
<li>Acquistare geni codificando per la proteina di interesse (POI): Ubiquitina, Rubredoxin (RD)51, il modulo di cellulosa-legante (CBM), dominio dockerin-X (XDoc) e coesione da Ruminococcus flavefacience, tabacco etch virus (TEV) protease, polietidi elastin-like (ELP).</li>
		<li>Eseguire la reazione a catena della polimerasi e utilizzare il sistema enzimatico di digestione a tre restrizioni BamHI-Bgl</e...

Abbiamo descritto un protocollo per la biosintesi e l'immobilizzazione eimmobilistica della poliproteina e verificato la progettazione della poliproteina da parte di SMFS basato su AFM. Questa metodologia fornisce un nuovo approccio alla costruzione del polimero proteico in una sequenza progettata, che integra i metodi precedenti per l'ingegneria poliproteina e l'immobilizzazione4,6,52,53,...

Rispetto ai polimeri sintetici, le proteine naturali multidominio hanno una struttura uniforme con un numero ben controllato e un tipo di sottodomini1. Questa caratteristica di solito porta a migliorare la funzione biologica e la stabilità2,3. Molti approcci, come l'accoppiamento del legame disulfide a base di cisteina e la tecnologia del DNA ricombinante, sono stati sviluppati per la costruzione di una proteina polimerizzata con più domini4,5,6,7. Tuttavia, il primo metodo si traduce sempre in una sequenza casuale e incontrollata, e il secondo porta ad altri problemi, tra cui la difficoltà per la sovraespressione di proteine tossiche e di grandi dimensioni e la purificazione di proteine complesse con cofattore e altri enzimi delicati.
Per affrontare questa sfida, sviluppiamo un metodo ezimatico che coniuga il monomero proteico insieme per polimero/poliproteina in modo graduale utilizzando una proteina ligase OaAEP1 combinata con un TEV di proteasi8,9. OaAEP1 è un endopeptidase rigoroso ed efficiente. Due proteine possono essere collegate covalentmente come sequenza Asn-Gly-Leu (NGL) attraverso due termini da OaAEP1 in meno di 30 min se lo N-terminus è residui di Gly-Leu (GL) e l'altro di cui il C-terminus è residui NGL10. Tuttavia, l'uso di OaAEP1 solo per collegare il monomero proteico porta a un polimero proteico con una sequenza incontrollata come il metodo di accoppiamento a base di cisteina. Pertanto, progettiamo il capo N dell'unità proteica con un sito di proteasi TEV rimovibile più un residuo di leucina come ENLYFQ/G-L-POI. Prima della scissione TEV, il terminale N non avrebbe partecipato alla legatura OaAEP1. E poi i residui di GL a N-terminus, che sono compatibili con l'ulteriore legatura OaAEP1, viene esposto dopo la scissione TEV. Così, abbiamo raggiunto un metodo di biosintesi ezimatica sequenziale della poliproteina con una sequenza relativamente ben controllata.
Qui, il nostro metodo di sintesi ezimatica graduale può essere utilizzato nella preparazione del campione di poliproteina, compresa la produzione di campioni di poliproteina, inclusa la sequenza controllata e incontrollata, e l'immobilizzazione delle proteine anche per studi a singola molecola, in particolare per il sistema complesso come metalloproteina.
Inoltre, gli esperimenti SMFS basati su AFM ci permettono di confermare la costruzione e la stabilità del polimero proteico a livello di singola molecola. La spettroscopia di forza a singola molecola, tra cui AFM, pinzetta ottica e pinzetta magnetica, è uno strumento generale nella nanotecnologia per manipolare la biomolecola meccanicamente e misurare la loro stabilità11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. AFM a singola molecola è stato ampiamente utilizzato nello studio delle proteine (un)folding21,22,23,24,25, la misura della forza di interazione recettore-ligando26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, legame chimico inorganico20,36,37,38,39,40,41,42,43 e legame metallo-ligando in metalloproteine44,45,46,47,48,49,50 . In questo caso, l'AFM a singola molecola viene utilizzato per verificare la sequenza di poliproteine sintetizzate in base al corrispondente segnale di spiegatura delle proteine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

Le tecniche chimiche e di bioconiugazione sono state sviluppate rapidamente negli ultimi anni e consentono la costruzione di polimeri proteici. Tuttavia, un processo di polimerizzazione delle proteine controllato è sempre una sfida. Qui, abbiamo sviluppato una metodologia ezimatica per la costruzione di proteine polimerizzate passo dopo passo in una sequenza controllata razionalmente. In questo metodo, il capolinea C di un monomero proteico è NGL per la coniugazione proteica che utilizza OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) mentre l'N-terminus era un TEV scissione scissione scissione scissione scissionio più un L (ENLYFQ/GL) per la protezione temporanea dei N-terminali. Di conseguenza, OaAEP1 è stato in grado di aggiungere un solo monomero proteico alla volta, e poi la proteasi TEV ha sfoltito il N-terminus tra Q e G per esporre l'NH2-Gly-Leu. Quindi l'unità è pronta per la prossima legatura OaAEP1. La poliproteina ingegnerizzata viene esaminata dispiegando un singolo dominio proteico utilizzando la spettroscopia a forza singola a forza atomica a base di microscopia (AFM-SMFS). Pertanto, questo studio fornisce una strategia utile per l'ingegneria poliproteica e l'immobilizzazione.

I residui NGL introdotti tra le proteine adiacenti dalla legatura OaAEP1 non influiscono sulla stabilità del momomero proteico nel polimero poiché la forza di dispiegamento (<Fu>) e l'incremento della lunghezza del contorno (<z-zlc>) sono paragonabili allo studio precedente (Figura 1). Il risultato della purificazione della proteina rubredossina è mostrato nella Figura 2. Per dimostrare la proteina dopo che la scissione TEV è compatibil...

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OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Qui, presentiamo un protocollo per coniugare il monomero proteico mediante enzimi formando polimeri proteici con una sequenza controllata e immobilizzandolo sulla superficie per studi di spettroscopia di forza singola molecola.

Sintesi enzimatica mediata OaAEP1 e immobilizzazione delle proteine polimerizzate per la spettroscopia a singola molecola

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Il nostro metodo enzimatico utilizza oligomero proteico con un numero controllato di grado di polimerizzazione. È una preparazione perfetta del campione per lo studio della spettroscopia a forza a singola molecola e per la costruzione di materiali a base proteica. Il nostro metodo non introduce la cisteina nella proteina bersaglio.Poiché la cisteina è uno dei residui funzionali più importanti per le proteine, facilita la costruzione di proteine o enzimi della materia polimerizzata. A dimostrare la procedura saranno Yibing Deng e Shengchao Shi, studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare, sciogliere 20 grammi di cromato di potassio in 40 millilitri di acqua ultrapura in un bicchiere.Aggiungere lentamente 360 millilitri di acido solforico concentrato alla soluzione di dicromato di potassio e utilizzare un'asta di vetro per mescolare delicatamente. Posizionare una coverlip di vetro nell'acido cromico e trasferirla in un forno a 80 gradi Celsius per 30 minuti. Pulire il coverslip con acqua e quindi alcol etilico assoluto e asciugare il coverslip con un flusso di azoto.Immergere completamente il coverslip in soluzione toluene APTES dell'1% volume per volume per un'ora a temperatura ambiente proteggendoli dalla luce. Lavare prima il coverslip con toluene e poi con alcool etilico assoluto e asciugare il coverslip con un flusso di azoto. Incubare il coverslip a 80 gradi Celsius per 15 minuti e quindi lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.Utilizzare una pipetta per aggiungere 200 microlitri da un milligrammo per millilitro Sulfo-SMCC in soluzione DMSO tra due coverslip immobilizzati e incubare per un'ora protetti dalla luce. Dopo un'ora, lavare prima le coverlips con DMSO e poi con alcol etilico assoluto per rimuovere il Sulfo-SMCC residuo. Asciugare il coverslip sotto un flusso di azoto.Pipetta 60 microlitri di soluzione micromolare GL-ELP-50 cis-proteina su un coverslip funzionalizzato e incubare a 25 gradi Celsius per circa tre ore. Successivamente, lavare il coperchio con acqua ultrapura per rimuovere i GL-ELP-50-cy non rievocati. Per preparare la superficie a sbalzi funzionalizzata, immergere prima i cantilever in acido cromico e pulire i cantilever a 80 gradi Celsius per 10 minuti.Utilizzare acqua e alcol etilico assoluto per lavare via l'acido. Immergere il cantilever con soluzione toluene APTES dell'1% volume per volume per eseguire l'amino salinizzazione in un tappo di tubo di plastica per un'ora. Risciacquare il sbalzino con alcol etilico assoluto e quindi cuocere il sbalzino a 80 gradi Celsius per 15 minuti.Immergere il sbalzino nella soluzione Sulfo-SMCC per un'ora e quindi risciacquare il cantilever con alcol etilico assoluto. Per collegare il cys-ELP-50-NGL alla superficie, immergere i cantilever nel cys-ELP-50-NGL con il gruppo maleimide di Sulfo-SMCC per 1,5 ore. Quindi lavare via la cis-ELP-50-NGL non transazionale sul sbalzino con acqua ultrapura.Successivamente, immergere un sbalzino funzionalizzato in una soluzione contenente 200 microlitri di soluzione proteica GL-CBM-XDockerin micromolare con 200 nanomolare OaAEP1 e posizionarli a 25 gradi Celsius per 20-30 minuti. Quindi utilizzare il buffer AFM per lavare via le proteine non transazionate. È fondamentale lavare via la proteina residua non transazionale prima dell'esperimento AFM perché formerà coppie coesina-dockerin e il blocco il cantilever per assumere nuove proteine sulla superficie.Per collegare l'unità di legatura coessina-T-L-proteina di interesse-NGL al GL-ELP-50 immobilizzato sulla superficie del coverslip, aggiungere 15 microlitri di OaAEP1 sul coverslip e lasciarlo incubare per 30 minuti. Utilizzare da 15 a 20 millilitri di tampone AFM per lavare via eventuali proteine nonrie. Aggiungere 100 microlitri di proteasi TEV per scindere l'unità proteica nel sito di riconoscimento TEV per un'ora a 25 gradi Celsius.Quindi utilizzare da 15 a 20 millilitri di tampone AFM per lavare via le proteine residue. Collegare l'unità di legazione coessina-T-L-proteina di interesse-NGL al vetro GL-ubiquitin-NGL di OaAEP1 per 30 minuti. A seconda dei costrutti proteici GL-ubiquitin-NGL da costruire sulla superficie del vetro, ripetere i passaggi di preparazione della poliproteina n1 volte.Omettere l'ultima reazione di scissione TEV per riservare la coessina sul polimero proteico come vetro coessina-TEV-L-ubiquitina-n-NGL. Aggiungere un millilitro di tampone AFM con cloruro di calcio millimolare e cinque millimolare acido ascorbico alla camera del fluido AFM. Scegliete la punta D della sonda AFM funzionalizzata per l'esperimento.Immergere la sonda nel buffer AFM. Ritrarre il sbalzino ad una velocità costante di 400 nanometri al secondo dalla superficie. Nel frattempo, registrare la curva di estensione della forza ad una velocità del campione di 4.000 hertz.Usa il teorema di equipartizione per calibrare il cantilever nel buffer AFM con un accurato valore K costante della molla prima di ogni esperimento. Attaccare la punta a sbalzi funzionalizzata con dockerina alla superficie depositata proteica funzionalizzata con coessina per formare la coppia coessina-dockerin. Quindi aprire il software di elaborazione dati JPK e selezionare la curva di estensione della forza con il caratteristico modello simile a un dente di sega e un'elevata forza di distacco.In questo studio, i residui NGL introdotti tra proteine adiacenti dalla legatura OaAEP1 non hanno influenzato la stabilità del monomero proteico nel polimero espressa in quanto la forza di dispiegamento e l'incremento della contro-lunghezza erano paragonabili allo studio precedente. La purificazione della forma ferrica rubredossina presentava tipici picchi di assorbimento visualizzazione UV a 495 nanometri e 575 nanometri mentre la forma di zinco no. I risultati del gel di pagina SDS della digestione e della legazione stepwise mostrano una TEV-L-ubiquitina coesa, la miscela proteica risultante della scissione TEV, la pura proteasi GFP-TEV e il prodotto purificato GL-ubiquitina.Vengono mostrate anche la miscela di legatura GL-ubiquitina e coessina-TEV-L-ubiquitina con o senza OaAEP1 e OaAEP1 puro. È fondamentale funzionalizzare la superficie con Sulfo-SMCC attivo per un attacco peptidico con successo. Qui forniamo un nuovo metodo per costruire proteine polimerizzate.Facilita ai ricercatori lo studio di un sistema proteico complesso utilizzando la spettroscopia di forza a singola molecola. L'acido cromico è fortemente corrosivo e acido. Fai attenzione quando lo prepari e lo gestisci.

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