Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

この研究は、中国自然科学財団(グラントNo.21771103、21977047)、江蘇省自然科学財団(グラントNo.)BK20160639)と江蘇省双荘プログラム。

1. タンパク質の生産
<ol><li>
遺伝子クローン
	<ol>
<li>目的タンパク質(POI)用にコード化した遺伝子(POI):ユビキチン、ルブレドキシン(RD)51、セルロース結合モジュール(CBM)、ドッカリンXドメイン(XDoc)およびルミノコッカスフラベファシス、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ、エラスチン様ポリペプチド(Elps)からの凝集体。</li>
		<li>ポリメラーゼ連鎖反?...

我々は、ポリタンパク質の酵素性生合成および固定化のためのプロトコルを説明し、AFMベースのSMFSによるポリタンパク質設計を検証した。この方法論は、ポリタンパク質工学と固定化4、6、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61のための以前の方法を補完する、設計された配列でタンパク質ポリマーを構築する?...

合成ポリマーと比較して、天然の多ドメインタンパク質は、サブドメイン1の数と種類がよく制御された均一な構造を有する。この機能は、通常、改善された生物学的機能と安定性2、3をもたらす。システイン系ジスルフィド結合結合結合や組換えDNA技術など多くのアプローチが、複数ドメイン4、5、6、7を有する重合タンパク質を構築するために開発されている。しかし、前者の方法は常にランダムで制御されていない配列を生み出し、後者の方法は、有毒で大きなタンパク質の過剰発現の困難さや、補因子やその他の繊細な酵素による複雑なタンパク質の精製など、他の問題につながります。
この課題に対応するため、プロテアーゼTEV8,9と組み合わせたプロテインリガーゼOaAEP1を用いて、ポリマー/ポリタンパク質のタンパク質モノマーを段階的に結合する酵素法を開発しています。OaAEP1 は、厳格かつ効率的な内ペプチダーゼ.2つのタンパク質は、N末限がGly-Leu残基(GL)であり、C末終点がNGL残基である他のタンパク質がNGL残基である場合、30分以内にOaAEP1によって2つのテルミニを介してAsn-Gly-Leu配列(NGL)として共有結合することができる。しかし、OaAEP1を使用してタンパク質モノマーをリンクさせると、システイン系カップリング法のような制御されていない配列を有するタンパク質ポリマーに導く。そこで、取り外し可能なTEVプロテアーゼ部位とロイシン残基をENLYFQ/G-L-POIとして持つタンパク質ユニットのN末限を設計しています。TEV切断の前に、N末端はOaAEP1ライゲーションに関与しなかった。そして、さらにOaAEP1ライゲーションと互換性があるN末経でGL残基がTEV切断後に暴露される。このように、比較的良好な配列を持つポリタンパク質の逐次酵素生合成法を達成した。
ここでは、当社の段階的酵素合成法は、配列制御および制御されていないポリタンパク質サンプル調製法、および単分子研究のためのタンパク質固定化、特に次のような複雑系に使用することができます。金属タンパク質。
さらに、AFMベースのSMFS実験により、タンパク質ポリマーの構造と安定性を単一分子レベルで確認することができます。AFM、光ツイーザー、磁気ツイーザーを含む単分子力分光法は、ナノテクノロジーにおける一般的なツールで、生体分子を機械的に操作し、その安定性を測定する11、12、13、14、15、16、17、18、19、20である。単分子AFMは、タンパク質(un)折りたたみ21、22、23、24、25、受容体リガンド相互作用26、27、28、29、30、31、32、33、34の研究で広く使用されています。 35,無機化学結合20,36,37,38,39,40,41,42,43および金属- リガンド結合 , 金属タンパク質44,45,46,47,48,49,50.ここで、単分子AFMは、対応するタンパク質展開シグナルに基づいて合成されたポリタンパク配列を検証するために使用される。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

化学・バイオコンジュゲーション技術は近年急速に開発され、タンパク質ポリマーの構築が可能です。しかし、制御されたタンパク質重合プロセスは常に課題です。ここでは、合理的に対照的な配列で重合タンパク質を段階的に構築するための酵素的方法論を開発しました。この方法では、タンパク質モノマーのC末端は、OaAEP1(オルデンランディア・アフィニアスパラジニアル・エンドペプチダーゼ)1)を用いたタンパク質結合のためのNGLであり、N末端は一時的なN末端保護のための鎖切りTEV(タバコエッチウイルス)切断部位に加えてL(ENLYFQ/GL)であった。その結果、OaAEP1は一度に1つのタンパク質モノマーのみを添加することができ、その後TEVプロテアーゼはQとGの間のN末経を切断してNH 2-Gly-Leuを暴露した。その後、ユニットは次のOaAEP1ライゲーションの準備ができています。この工学的ポリタンパク質は、原子間力顕微鏡ベースの単分子力分光法(AFM-SMFS)を用いて個々のタンパク質ドメインを展開することによって検査される。したがって、本研究は、ポリタンパク質工学と固定化のための有用な戦略を提供する。

OaAEP1ライゲーションによって隣接するタンパク質間に導入されたNGL残基は、展開力(<F u>)としてポリマー中のタンパク質モノマー安定性に影響を及ぼさないし、輪郭長増分(<ΔLc>)は前の研究と同等である(図1)。このルブレドキシンタンパク質の精製結果を図2に示す。TEV切断後のタンパク質が、制御配列を有するタンパク質ポリマー?...

Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

ここでは、タンパク質ポリマーを制御された配列で形成する酵素によってタンパク質モノマーを結合し、単一分子力分光研究のために表面に固定化するプロトコルを提示する。

OaAEP1-媒介酵素合成と単分子力分光法のための重合タンパク質の固定化

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

我々の酵素法は、制御された数の重合度を有するプロテインオリゴマーを使用する。これは、タンパク質ベースの材料構築と同様、単一分子力分光分析研究のための完璧なサンプル調製物です。我々の方法は、標的タンパク質にシステインを導入しない。システインはタンパク質にとって最も重要な機能残基の1つであるため、重合物質タンパク質または酵素の構築を容易にします。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるイビン・デンとシェンチャオ・シーです。まず、20グラムのクロム酸カリウムを40ミリリットルの超純水にビーカーで溶かします。ジクロメートカリウム溶液に360ミリリットルの濃硫酸をゆっくりと加え、ガラス棒を使って軽くかき混ぜます。クロム酸にガラスカバースリップを入れ、摂氏80度でオーブンに30分間移します。カバースリップを水で洗浄し、絶対エチルアルコールを洗浄し、カバースリップを窒素の流れで乾燥させます。光から保護しながら、室温で1時間、容量APTESトルエン溶液によって1%体積でカバースリップを完全に浸漬。最初にトルエンでカバースリップを洗い、次に絶対的なエチルアルコールで洗い、カバースリップを窒素の流れで乾かします。カバースリップを摂氏80度で15分間インキュベートし、室温まで冷まします。ピペットを使用して、2つの固定されたカバーリップの間のDMSO溶液中の1ミリグラム当たり1ミリグラムの200マイクロリットルをDMSO溶液に加え、光から保護された1時間インキュベートします。1時間後、最初にDMSOでカバーリップを洗い、次に絶対的なエチルアルコールで洗い、残留スルフォ-SMCCを除去します。カバースリップを窒素の流れの下で乾かします。ピペット60マイクロモルGL-ELP-50 cys-タンパク質溶液を機能化したカバースリップに入れ、摂氏25度で約3時間インキュベートします。その後、カバースリップを超純水で洗い、未反応のGL-ELP-50-cysを取り除きます。官能化されたカンチレバー表面を調製するには、まず片持ち面をクロム酸に浸し、80°Cで10分間片持ち面を洗浄します。酸を洗い流すために水と絶対エチルアルコールを使用してください。プラスチックチューブキャップに1時間アミノ酸分を行うほど、容量APTESトルエン溶液で1%体積でカンチレバーを浸します。絶対エチルアルコールでカンチレバーをすすぎ、80°Cで15分間焼きます。片持ち体をスルフォ-SMCC溶液に1時間浸し、絶対エチルアルコールでカンチレバーをすすきます。cys-ELP-50-NGLを表面にリンクするには、カチレバーをcys-ELP-50-NGLにスルフォ-SMCCのマレイミド群に1.5時間浸漬します。その後、未反応のcys-ELP-50-NGLを超純水で片持ち体に洗い流します。次に、機能性のある片持ち体を、200ナノモルOaAEP1を用いた50マイクロモルGL-CBM-XDockerinタンパク質溶液200マイクロリットルを含む溶液に浸漬し、20〜30分間摂氏25度に置きます。その後、AFMバッファーを使用して未反応のタンパク質を洗い流します。AFM実験の前に未反応の残留タンパク質を洗い流すのが重要です。対象となるグリゲーション単位の凝集-T-L-タンパク質をカバースリップ表面に固定化されたGL-ELP-50にリンクするには、15マイクロリットルのOaAEP1をカバースリップに加え、30分間インキュベートさせます。未反応のタンパク質を洗い流すために15〜20ミリリットルのAFMバッファーを使用してください。TEVプロテアーゼを100マイクロリットル加え、TEV認識部位でタンパク質ユニットを摂氏25度で1時間切断します。その後、AFMバッファーの15〜20ミリリットルを使用して、残留タンパク質を洗い流します。OaAEP1によって30分間、目的の結合単位の凝集-T-L-タンパク質をGL-ユビキチン-NGLガラスにリンクします。ガラス表面に構築されるGL-ユビキチン-NGLを構築するタンパク質に応じて、ポリタンパク質調製ステップn1回を繰り返す。最後のTEV切断反応を省略し、タンパク質ポリマー上の凝集を凝集-TEV-L-ユビキチン-n-NGLガラスとして凝集して予備する。10ミリモルの塩化カルシウムと5ミリモルアスコルビン酸を含むAFMバッファーを1ミリリットルをAFM液室に加えます。実験用に、機能化されたAFMプローブのD先端を選択します。プローブを AFM バッファに浸します。表面から毎秒400ナノメートルの一定の速度で片持ち面を引き込みます。その間に、4,000ヘルツのサンプルレートで力延長曲線を記録します。等分割定理を使用して、各実験の前に正確なばね定数K値でAFMバッファ内の片持ち体を較正する。ドッカリンで機能したカンチレバーチップを、凝集して機能するタンパク質に取り付け、凝集ドキンペアを形成します。次に、JPKデータ処理ソフトを開き、特徴的なのこぎりのようなパターンと高い剥離力を持つ力延長曲線を選択します。本研究では、OaAEP1ライゲーションにより隣接タンパク質間に導入されたNGL残基は、展開力およびコントラ長インクリメントとして発現されるポリマーにおけるタンパク質単量体安定性に影響を及ぼさなかったが、以前の研究と同等であった。フェルベドキシンのフェリック形態の精製は、495ナノメートルおよび575ナノメートルの典型的なUV視覚化吸収ピークを提示したが、亜鉛形態は、ステップワイズ消化およびライゲーションのSDSページゲル結果は、TEV切断、純粋なGFP-TEV-プロテアーゼ、および精製された製品-UBQuitiのタンパク質混合物である凝集性TEV-L-ユビキチンを示した。切断されたGL-ユビキチンおよび凝集-TEV-L-ユビキチンライゲーション混合物を、OaAEP1および純粋OaAEP1の有無にかかわらず同様に示す。ペプチドの取り付けに成功するためには、活性スルフォ-SMCCで表面を機能化することが重要です。ここでは、重合タンパク質を構築する新しい方法を提供します。これは、研究者が単一分子力分光法を使用して複雑なタンパク質システムを研究することを容易にします。クロム酸は強く腐食性および酸性である。準備して取り扱うときは注意してください。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

迅速なワンステップ酵素合成とトレハロース類似体のすべての水精製

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

生体分子構造決定のための単分子レベルでの高精度FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

原子間力顕微鏡を用いた単一タンパク質分子の力分光法

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

磁気ピンセットで G quadruplexes の単一分子マニピュレーション

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

3色 1 分子 FRET を使用して蛋白質の相互作用の相関関係を研究するには

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

力の単一分子分光法のための蛋白質の共有結合固定

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

プロテオーム的分類の単一分子レベルでの均一性の定量化

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

単一分子FISHによる転写活性アレスの単一細胞解析

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

リボソームタンパク質合成の単一分子蛍光エネルギー転移研究

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...