Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
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이 작품은 중국의 국립 자연 과학 재단에 의해 지원되었다 (그랜트 번호 21771103, 21977047), 장쑤성 자연 과학 재단 (그랜트 번호) . BK20160639) 및 장쑤성 황추앙 프로그램.

1. 단백질 생산
<ol><li>
유전자 클론
	<ol>
<li>관심 있는 단백질(POI)을 코딩하는 유전자를 구매하는 유전자: 유비퀴틴, 루브루독신(RD)51,셀룰로오스 결합 모듈(CBM), 도커린-X 도메인(XDoc) 및 루미노크코커스 플라베파시에서응집성,담배 에칭 바이러스(TEV) 프로테아제, 엘라스틴-유사 폴리펩티드(ELPs).</li>
		<li>중합효소 연쇄 반응을 수행하고 상이한 단백질 단편으로?...

우리는 효소 생합성 및 다단백질의 고정화를 위한 프로토콜을 기술하고 AFM 기지를 둔 SMFS에 의하여 polyprotein 디자인을 확인했습니다. 이 방법론은 폴리 단백질 공학 및 고정4,6,52,53,54,55,56,57,<sup cl...

합성 중합체에 비해, 천연 다중 도메인 단백질은 잘 제어 된 수와 하위 도메인1의유형과 균일 한 구조를 갖는다. 이 기능은 일반적으로 향상된 생물학적 기능 및 안정성2,3을이끈다. 시스테인 계이황화 결합 결합 및 재조합 DNA 기술과 같은 많은 접근법은, 다중 도메인4,5,6,7과같은 중합 단백질을 구축하기 위해 개발되었다. 그러나, 전자 방법은 항상 무작위 및 통제되지 않는 서열을 초래하고, 후자의 방법은 독성 및 대형 단백질의 과발현어려움 및 보조 인자 및 기타 섬세한 효소로 복잡한 단백질의 정제를 포함한 다른 문제를 초래한다.
이러한 과제를 충족시키기 위해, 우리는 프로테아제 TEV8,9와결합된 단백질 리가세 OaAEP1을 사용하여 단계적으로 폴리머/폴리단백질에 대한 단백질 단량체를 결합하는 효소 방법을 개발합니다. OaAEP1은 엄격하 고 효율적인 엔도 펩 티 다아제. 2개의 단백질은 N-종단이 글리-루 잔기(GL)이고 다른 하나는 C-종단이 NGL 잔기10인경우 30분 이내에 OaAEP1에 의해 2개의 테르미니를 통해 Asn-Gly-Leu 서열(NGL)으로 공유적으로 연결될 수 있다. 그러나, OaAEP1의 사용은 단백질 단량체를 연결하는 것만이 시스테인 계 커플링 방법과 같은 조절되지 않은 서열을 가진 단백질 중합체로 이끈다. 따라서, 우리는 ENLYFQ/G-L-POI로 착유류 잔류물을 더한 탈착식 TEV 프로테아제 부위를 가진 단백질 단위의 N-종단을 디자인합니다. TEV 분열 전에, N-단말은 OaAEP1 결찰에 참여하지 않을 것이다. 그리고 추가 OaAEP1 결찰과 호환되는 N-종점의 GL 잔기는 TEV 절단 후에 노출됩니다. 따라서, 우리는 비교적 잘 조절된 서열을 가진 다단백질의 순차적 효소 생합성 방법을 달성하였다.
여기서, 우리의 단계적 효소 합성 방법은 서열 조절 및 조절되지 않는, 단일 분자 연구를 위한 단백질 고정화를 포함하여 다단백질 샘플 준비에 사용될 수 있으며, 특히 같은 복잡한 시스템에 대해서도 금속 단백질.
더욱이, AFM 기반 SMFS 실험을 통해 단일 분자 수준에서 단백질 중합체 구조 및 안정성을 확인할 수 있습니다. AFM, 광학 핀계 및 자기 트위저를 포함한 단일 분자 힘 분광법은 생체 분자를 기계적으로 조작하고 안정성을 측정하는 나노 기술의 일반적인 도구입니다11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. 단 하나 분자 AFM은 단백질 (un)접이식21,22,23,24,25,수용체 -리간드 상호 작용26,27,28,29,30,31,32,33,34, 34의연구에 널리 사용되어 왔다. 35,무기 화학 결합20,36,37,38,39,40,41 ,42,43 및 금속 리간드 결합 금속 단백질44,45,46,47,48,49,50 . 여기서, 단일 분자 AFM은 상응하는 단백질 전개 신호에 기초하여 합성된 다단백질 서열을 검증하는데 사용된다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

화학 및 바이오 컨쥬게이션 기술은 최근 몇 년 동안 급속히 개발되어 단백질 폴리머의 구축을 허용하고 있습니다. 그러나, 제어 된 단백질 중합 과정은 항상 도전이다. 여기에서, 우리는 합리적으로 통제된 순서에 있는 단계별로 중합된 단백질을 건설하기 위한 효소 방법론을 개발했습니다. 이 방법에서, 단백질 단면제의 C-말단은 OaAEP1(Oldenlandiaaffinis asparaginis asparaginyl endopeptidases)을사용하여 단백질 컨쥬게이션을 위한 NGL인 반면, N-말단은 클레이브 가능한 TEV(담배 에칭 바이러스) 분열 부위와 L(ENLYFQ/GL)을 임시 N-단말 보호를 위한 것이다. 결과적으로, OaAEP1은 한 번에 하나의 단백질 단량체만 을 첨가할 수 있었고, 그 후 TEV 프로테아제는Nh 2-Gly-Leu를 노출시키기 위해 Q와 G 사이의 N-종단을 갈라졌다. 그런 다음 장치는 다음 OaAEP1 결찰에 대한 준비가 됩니다. 엔지니어링 된 다단백질은 원자력 현미경 검사법 기반 단일 분자 힘 분광학 (AFM-SMFS)을 사용하여 개별 단백질 도메인을 전개하여 검사됩니다. 따라서, 이 연구는 다단백질 공학 및 고정화를 위한 유용한 전략을 제공한다.

OaAEP1 결찰에 의해 인접한 단백질 사이에 도입된 NGL 잔기는 전개력(&F u>)및 윤곽 길이 증분(&ΔL c>)으로서 중합체의 단백질 단량체 안정성에 영향을 미치지 않을 것이며(<ΔL c>)는 이전 연구와 비교할 수 있다(그림1). 루브레독신 단백질의 정제 결과는 도 2에나타내고 있다. TEV 절단 후 단백질을 증명하기 위해 제어 서열과 함께 단백질 중합?...

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OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

여기에서, 우리는 통제된 순서로 단백질 중합체를 형성하는 효소에 의해 단백질 단량체를 융합하고 단 분자 힘 분광법 연구를 위한 표면에 그것을 고정화하는 프로토콜을 제시합니다.

단일 분자 힘 분광학을 위한 OaAEP1 중재된 효소 합성 및 중합단백질의 고정화

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

우리의 효소 방법은 중합 정도의 제어 된 수와 단백질 올리고머를 사용합니다. 단백질 계 재료 구조뿐만 아니라 단일 분자 힘 분광법 연구를위한 완벽한 샘플 준비입니다. 우리의 방법은 표적 단백질에 시스테인을 소개하지 않습니다.시스테인은 단백질에 대한 가장 중요한 기능성 잔류물 중 하나이기 때문에 중합물질 단백질 또는 효소의 건축을 용이하게 합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 졸업생 인 이빙 덩과 성차오 시입니다. 시작하려면, 비커에 초순수 물 40 밀리리터에 칼륨 크로메이트 20 그램을 녹입니다.360밀리리터의 농축 황산을 칼륨 이크로메이트 용액에 천천히 넣고 유리 막대를 사용하여 부드럽게 저어줍니다. 크로믹산에 유리 덮개 슬립을 놓고 30 분 동안 섭씨 80도에서 오븐에 옮겨. 물로 커버 슬립을 청소한 다음 절대 에틸 알코올을 청소하고 질소 스트림으로 커버 슬립을 건조시십시오.커버슬립을 실온에서 1시간 동안 부피 APTES 톨루엔 솔루션으로 1%의 부피로 완전히 몰입시키면서 빛으로부터 보호합니다. 커버슬립을 톨루엔으로 먼저 씻은 다음 절대 에틸 알코올로 씻어 낸 다음 질소 스트림으로 커버슬립을 건조시다. 커버슬립을 섭씨 80도에서 15분간 배양한 다음 실온으로 식힙니다.파이펫을 사용하여 2개의 고정 커버립과 빛으로부터 보호된 1시간 동안 인큐베이터 사이에 DMSO 솔루션에 밀리리터 Sulfo-SMCC당 1밀리그램의 200 마이크로리터를 추가합니다. 한 시간 후, 커버립을 DMSO로 먼저 씻은 다음 절대 에틸 알코올로 씻어 잔류 Sulfo-SMCC를 제거하십시오. 질소 스트림 에서 커버 슬립을 건조.파이펫 60 마이크로리터 200 마이크로몰라 GL-ELP-50 사이단백질 용액을 기능화된 커버슬립에, 약 3시간 동안 섭씨 25도의 배양한다. 그 후, 초순수물로 커버슬립을 세척하여 반응하지 않은 GL-ELP-50-cys를 제거합니다. 기능화된 캔틸레버 표면을 준비하려면 먼저 칸틸레버를 크로믹산에 담그고 캔틸레버를 섭씨 80도에서 10분간 청소하십시오.물과 절대 에틸 알코올을 사용하여 산을 씻어 내보도록 하십시오. 볼륨 APTES 톨루엔 용액으로 캔틸레버를 1% 부피로 담그고 플라스틱 튜브 캡에서 1시간 동안 아미노 살리니화를 수행합니다. 절대 에틸 알코올캔틸레버를 헹구고 캔틸레버를 섭씨 80도에서 15분간 굽습니다.설포-SMCC 솔루션에 캔틸레버를 1시간 동안 담그고 절대 에틸 알코올로 캔틸레버를 헹구는 다. CYs-ELP-50-NGL을 표면에 연결하려면 시낭-ELP-50-NGL에 캔틸레버를 Sulfo-SMCC의 말리미드 그룹과 1.5시간 동안 담급드하십시오. 그런 다음 캔틸레버에 반응하지 않은 CYs-ELP-50-NGL을 초순수물로 씻어내라.다음으로, 200 나노몰러 OaAEP1을 사용하여 50 마이크로몰라 GL-CBM-XDockerin 단백질 용액 200 마이크로리터를 포함하는 용액에 기능화된 캔틸레버를 담그고 20~30분 동안 섭씨 25도에 배치합니다. 그런 다음 AFM 버퍼를 사용하여 반응하지 않은 단백질을 씻어 내도록 합니다. AFM 실험 전에 반응하지 않은 잔류 단백질을 씻어내는 것이 중요합니다.관심-NGL의 응집력-T-L 단백질을 커버슬립 표면에 고정된 GL-ELP-50에 연결하려면, 뚜껑슬립에 OaAEP1 의 15 마이크로리터를 추가하고 30분 동안 배양하게 한다. AFM 버퍼 15~20밀리리터를 사용하여 반응하지 않은 단백질을 씻어내도록 하십시오. TEV 프로테아제 100마이크로리터를 추가하여 TEV 인식 부위의 단백질 장치를 섭씨 25도에서 1시간 동안 크리브합니다.그런 다음 AFM 버퍼15~20밀리리터를 사용하여 잔류 단백질을 씻어내도록 합니다. 관심-NGL의 결집력-T-L-단백질을 OaAEP1에 의해 GL-유비퀴틴-NGL 유리에 30분간 연결한다. 유리 표면에 내장될 GL-유비퀴틴-NGL을 구성하는 단백질에 따라, 폴리단백질 제제 단계 n1회 반복한다.마지막 TEV 분열 반응을 생략하여 단백질 폴리머에 응집력을 응집력-TEV-L-유비퀴틴-n-NGL 유리로 예약한다. AFM 유체 챔버에 10 밀리머 칼슘 염화칼슘과 5 밀리풀아 아스코르브 산을 첨가하십시오. 실험에 대한 기능화된 AFM 프로브의 D 끝을 선택합니다.프로브를 AFM 버퍼에 담그면 됩니다. 표면에서 초당 400 나노미터의 일정한 속도로 캔틸레버를 철회합니다. 한편, 포스 연장 곡선을 4, 000 헤르츠의 샘플 속도로 기록한다.equipartition 정리를 사용하여 각 실험 전에 정확한 스프링 상수 K 값으로 AFM 버퍼의 캔틸레버를 보정합니다. 도커린으로 기능화된 캔틸레버 팁을 응집력으로 기능화된 단백질 증착 표면에 부착하여 응집력 있는 도커린 쌍을 형성한다. 그런 다음 JPK 데이터 처리 소프트웨어를 열고 특징적인 톱니 모양 패턴과 높은 분리 력으로 힘 확장 곡선을 선택합니다.본 연구에서는, OaAEP1 결찰에 의해 인접한 단백질 들 사이에 도입된 NGL 잔기는 전개력 및 콘트라 길이 증분으로 발현된 폴리머의 단백질 단조량 안정성에 영향을 미치지 않았으며, 이전 연구와 비교할 수 있었다. 페리 형태의 루브레독신의 정제는 495나노미터와 575나노미터의 전형적인 UV 시각화 흡수 피크를 제시했으며 아연 형태는 그렇지 않았다.OaAEP1 및 순수 OaAEP1의 유무에 관계없이 갈라진 GL-유비퀴틴 및 응집력-TEV-L-유비퀴틴 결찰 혼합물도 표시됩니다. 펩타이드 부착을 성공적으로 위해 활성 Sulfo-SMCC로 표면을 기능화하는 것이 중요합니다. 여기서 우리는 중합단백질을 만드는 새로운 방법을 제공한다.그것은 단일 분자 힘 분광법을 사용하여 복잡한 단백질 시스템을 공부하는 연구원을 용이하게합니다. 크로믹산은 강하게 부식성 및 산성입니다. 준비하고 다룰 때주의하십시오.

Research

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Biochemistry

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