Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) og Shuangchuang Program of Jiangsu-provinsen.

1. Proteinproduksjon
<ol><li>
Genklone
	<ol>
<li>Kjøp gener koding for protein av interesse (POI): Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, cellulosebindende modul (CBM), dockerin-X domene (XDoc) og samhold fra Ruminococcus flavefacience, tobakk etch virus (TEV) protease, elastin-lignende polypeptider (ELPs).</li>
		<li>Utfør polymerasekjedereaksjon og bruk tre-restriksjons fordøyelsesenzymsystem BamHI-BglII-KpnI for å kombinere genet fra forskjellig...

Vi har beskrevet en protokoll for enzymatisk biosyntese og immobilisering av polyprotein og verifisert polyproteindesignen av AFM-baserte SMFS. Denne metodikken gir en ny tilnærming til å bygge protein-polymer i en designet sekvens, som utfyller tidligere metoder for polyprotein engineering og immobilisering4,6,52,53,54,55<...

Sammenlignet med syntetiske polymerer har naturlige multidomener proteiner en ensartet struktur med et godt kontrollert antall og type underdomener1. Denne funksjonen fører vanligvis til forbedret biologisk funksjon og stabilitet2,3. Mange tilnærminger, som cystein-basert disulfid bindingkobling og rekombinant DNA-teknologi, er utviklet for å bygge et slikt polymerisert protein med flere domener4,5,6,7. Den tidligere metoden resulterer imidlertid alltid i en tilfeldig og ukontrollert sekvens, og sistnevnte fører til andre problemer, inkludert vanskeligheten for overuttrykk av giftige og store proteiner og rensing av komplekst protein med cofactor og andre delikate enzymer.
For å møte denne utfordringen utvikler vi en enzymatisk metode som konjugerer proteinmonomer sammen for polymer / polyprotein på en trinnvis måte ved hjelp av en proteinligase OaAEP1 kombinert med en protease TEV8,9. OaAEP1 er en streng og effektiv endopeptidase. To proteiner kan knyttes sammen kovalent som Asn-Gly-Leu sekvens (NGL) gjennom to termini av OaAEP1 på mindre enn 30 min hvis N-terminus er Gly-Leu rester (GL) og den andre som C-terminus er NGL rester10. Imidlertid fører bruk av OaAEP1 bare for å koble proteinmonomer til en proteinpolymer med en ukontrollert sekvens som cysteinbasert koblingsmetode. Derfor utformer vi N-terminus av proteinenheten med et flyttbart TEV-proteaseområde pluss en leukcinerester som ENLYFQ/G-L-POI. Før TEV-spalingen ville ikke N-terminalen delta i OaAEP1 ligation. Og så blir GL-rester ved N-terminus, som er kompatible med ytterligere OaAEP1 ligation, utsatt etter TEV-spaltingen. Dermed har vi oppnådd en sekvensiell enzymatisk biosyntesemetode for polyprotein med en relativt godt kontrollert sekvens.
Her kan vår trinnvise enzymatiske syntesemetode brukes i polyproteinprøvepreparat, inkludert sekvenskontrollert og ukontrollert, og proteinimmobilisering for enkeltmolekylstudier også, spesielt for det komplekse systemet som metalloprotein.
Videre tillater AFM-baserte SMFS-eksperimenter oss å bekrefte proteinpolymerkonstruksjonen og stabiliteten på enkeltmolekylnivå. Enkeltmolekylkraftspektroskopi, inkludert AFM, optisk pinsett og magnetisk pinsett, er et generelt verktøy i nanoteknologi for å manipulere biomolekyl mekanisk og måle stabiliteten11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20. Enkeltmolekylet AFM har vært mye brukt i studiet av protein (un)folding21,22,23,24,25, styrkemåling av reseptor-ligand interaksjon26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, uorganisk kjemisk binding20,36,37,38,39,40,41,42,43 og metall-ligand binding i metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Her brukes enkeltmolekylet AFM til å verifisere den syntetiserte polyproteinsekvensen basert på det tilsvarende proteinutfoldende signalet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

Kjemiske og bio-konjugering teknikker har blitt utviklet raskt de siste årene og tillate bygging av protein polymerer. Imidlertid er en kontrollert proteinpolymeriseringsprosess alltid en utfordring. Her har vi utviklet en enzymatisk metodikk for å konstruere polymerisert protein trinnvis i en rasjonelt kontrollert sekvens. I denne metoden er C-terminus av et protein monomer NGL for proteinbøyning ved hjelp av OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) mens N-terminus var et cleavable TEV (tobakk etsevirus) spaltingssted pluss en L (ENLYFQ/GL) for midlertidig N-beskyttende terminaling. Følgelig var OaAEP1 i stand til å legge til bare én proteinmonomer om gangen, og deretter tev protease spaltet N-terminus mellom Q og G for å avsløre NH2-Gly-Leu. Deretter er enheten klar for neste OaAEP1 ligation. Det konstruerte polyproteinet undersøkes ved å utfolde individuell proteindomene ved hjelp av atomkraftmikroskopibasert enkeltmolekylstyrkespektroskopi (AFM-SMFS). Derfor gir denne studien en nyttig strategi for polyproteinengineering og immobilisering.

NGL-rester introdusert mellom tilstøtende proteiner av OaAEP1 ligation vil ikke påvirke protein monomerstabilitet i polymeren som utfoldende kraft (<Fu>), og konturlengdeøkning (<ΔLc>) kan sammenlignes med forrige studie (Figur 1). Renseresultatet av rubredoksinproteinet er vist i figur 2. For å bevise proteinet etter TEV-spalting er kompatibelt med følgende OaAEP1 ligation for å konstruere proteinpolymer med en kontrollsekvens og ko...

Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Her presenterer vi en protokoll for å konjugere proteinmonomer ved enzymer som danner proteinpolymer med en kontrollert sekvens og immobilisere den på overflaten for enkeltmolekylkraftspektroskopistudier.

OaAEP1-mediert enzymatisk syntese og immobilisering av polymerisert protein for enkeltmolekylet kraftspektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Vår enzymatiske metode bruker protein oligomer med et kontrollert antall polymeriseringsgrad. Det er et perfekt prøvepreparat for enkeltmolekylkraftspektroskopistudie samt proteinbasert materialkonstruksjon. Vår metode introduserer ikke cystein til målproteinet.Fordi cystein er en av de viktigste funksjonelle rester for protein, letter det bygging av polymerisert materieprotein eller enzymer. Demonstrere prosedyren vil være Yibing Deng og Shengchao Shi, grad studenter fra laboratoriet mitt. For å begynne, oppløs 20 gram kaliumkromat i 40 milliliter ultrapure vann i et beger.Tilsett sakte 360 milliliter konsentrert svovelsyre til kaliumdiktromatoppløsningen og bruk en glassstang til å røre forsiktig. Legg en glassdeksleglass i kromosyren og overfør den til en ovn ved 80 grader Celsius i 30 minutter. Rengjør dekkslippen med vann og deretter absolutt etylalkohol og tørk dekkslippen med en strøm av nitrogen.Senk dekkslepperen helt ned i 1 % volum ved volum APTES-toluenløsning i én time ved romtemperatur samtidig som den beskytter dem mot lys. Vask dekkslippen med toluen først og deretter med absolutt etylalkohol og tørk dekkslippen med en strøm av nitrogen. Inkuber dekkslippen ved 80 grader Celsius i 15 minutter, og la den avkjøles til romtemperatur.Bruk en pipette til å legge til 200 mikroliter på ett milligram per milliliter Sulfo-SMCC i DMSO-løsning mellom to immobiliserte dekkslepper og inkubere i en time beskyttet mot lys. Etter en time, vask dekkglassene med DMSO først og deretter med absolutt etylalkohol for å fjerne gjenværende Sulfo-SMCC. Tørk dekkslippen under en strøm av nitrogen.Pipette 60 mikroliter av 200 mikromos GL-ELP-50 cys-protein løsning på en funksjonalisert dekkslips og inkubere ved 25 grader Celsius i ca tre timer. Deretter vasker du dekkslippen med ultrarent vann for å fjerne den uacted GL-ELP-50-cys. For å forberede funksjonalisert cantilever overflate, først dyppe cantilevers i kromosyre og rengjør cantilevers på 80 grader Celsius i 10 minutter.Bruk vann og absolutt etylalkohol til å vaske bort syren. Senk kantileveren ned med 1 % volum APTES toluenløsning for å utføre aminosaltering i en plastrørhette i én time. Skyll cantilever med absolutt etylalkohol og stek deretter cantilever ved 80 grader Celsius i 15 minutter.Senk kantileveren i Sulfo-SMCC-oppløsningen i en time, og skyll deretter cantileveren med absolutt etylalkohol. For å koble cys-ELP-50-NGL til overflaten, senk kantilevers i cys-ELP-50-NGL med maleimide gruppen sulfo-SMCC i 1,5 timer. Vask deretter bort den uacted cys-ELP-50-NGL på cantilever med ultrapure vann.Deretter fordyper du en funksjonalisert cantilever i en løsning som inneholder 200 mikroliter på 50 mikromos GL-CBM-XDockerin proteinløsning med 200 nanomolar OaAEP1 og plasserer dem på 25 grader Celsius i 20 til 30 minutter. Bruk deretter AFM-bufferen til å vaske bort uacted protein. Det er viktig å vaske bort uaktert restprotein før AFM-eksperimentet fordi det vil danne en cohesin-dockerin par og blokken cantilever å ta opp nytt protein på overflaten.For å koble ligation enheten cohesin-T-L-protein av interesse-NGL til GL-ELP-50 immobilisert på dekkglassoverflaten, tilsett 15 mikroliter OaAEP1 på dekkslippen og la den inkubere i 30 minutter. Bruk 15 til 20 milliliter AFM-buffer for å vaske bort eventuelle uacted proteiner. Tilsett 100 mikroliter TEV protease for å holde proteinenheten på TEV-gjenkjenningsstedet i en time ved 25 grader Celsius.Bruk deretter 15 til 20 milliliter AFM-buffer for å vaske bort gjenværende proteiner. Koble ligation enheten cohesin-T-L-protein av interesse-NGL til GL-ubiquitin-NGL glass av OaAEP1 i 30 minutter. Avhengig av protein konstruerer GL-ubiquitin-NGL som skal bygges på glassoverflaten, gjenta polyprotein forberedelse trinn n1 ganger.Utelate den siste TEV cleavage reaksjon å reservere cohesin på protein polymer som cohesin-TEV-L-ubiquitin-n-NGL glass. Tilsett ett milliliter AFM-buffer med 10 millimolar kalsiumklorid og fem millimolar askorbinsyre til AFM-væskekammeret. Velg D-spissen på den funksjonaliserte AFM-sonden for eksperimentet.Senk sonden ned i AFM-bufferen. Trekk kantileveren tilbake i en konstant hastighet på 400 nanometer per sekund fra overflaten. I mellomtiden registrerer du kraftforlengelseskurven med en samplingshastighet på 4000 hertz.Bruk equipartition teoremet til å kalibrere cantilever i AFM buffer med en nøyaktig fjær konstant K verdi før hvert eksperiment. Fest cantilever spissen funksjonalisert med dockerin til protein avsatt overflate funksjonalisert med cohesin å danne cohesin-dockerin par. Åpne deretter JPK-databehandlingsprogramvaren og velg kraftforlengelseskurve med det karakteristiske sagtoth-lignende mønsteret og en høy løsrivelseskraft.I denne studien påvirket NGL-rester introdusert mellom tilstøtende proteiner ved OaAEP1-ligation ikke proteinmonomerstabiliteten i polymeren uttrykt da utfoldelseskraften og innretningslengdeøkningen var sammenlignbar med tidligere studie. Rensingen av ferric form rubredoxin presenterte typiske UV-visualiserte absorpsjonstopper på 495 nanometer og 575 nanometer mens sinkformen ikke gjorde det. SDS-side gelresultater av den trinnvise fordøyelsen og ligationen viser sammenhengende TEV-L-ubiquitin, resultatproteinblandingen av TEV-spalting, ren GFP-TEV-protease og renset produkt GL-ubiquitin.Den spaltede GL-ubiquitin- og cohesin-TEV-L-ubiquitin ligationblandingen med eller uten OaAEP1 og ren OaAEP1 vises også. Det er avgjørende å funksjonalisere overflaten med aktiv Sulfo-SMCC for vellykket peptidtilbehør. Her gir vi en ny metode for å bygge polymerisert protein.Det gjør det mulig for forskere å studere komplekst proteinsystem ved hjelp av enkeltmolekylkraftspektroskopi. Kromosyre er sterkt etsende og surt. Vær forsiktig når du forbereder og håndterer det.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Rapid Ett-trinns Enzymatisk Syntese og All-vandig Rensing av Trehalose analoger

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Tvinge spektroskopi enkelt Protein molekyler med en Atomic Force mikroskopet

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Single-molekylet manipulering av G-quadruplexes av magnetiske pinsett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Bruker tre farger Single-molekylet bånd å studere sammenhengen av Protein interaksjoner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering av proteiner for ett molekyl Force spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens svingninger spektroskopi analysen av Protein-Protein interaksjoner i celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Enkeltcelleanalyse av transkripsjonsaktive alleler av enkeltmolekyl fisk

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enkeltmolekyl fluorescens energioverføringsstudie av ribosomet proteinsyntese

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...