Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
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Este trabajo fue apoyado por la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation of Jiangsu Province (Grant No. BK20160639) y el Programa Shuangchuang de la provincia de Jiangsu.

1. Producción de proteínas
<ol><li>
Clon genético
	<ol>
<li>Comprar genes que codifican para la proteína de interés (POI): Ubiquitina, Rubredoxin (RD)51, el módulo de unión a la celulosa (CBM), dominio dockerin-X (XDoc) y cohesión de Ruminococcus flavefaciencia, virus de la fjma ción tabaco (TEV) proteasa, polipéptidos similares a la elastina (ELP).</li>
		<li>Realizar la reacción en cadena de la polimerasa y utilizar el sistema enzimático de digestión de t...

Hemos descrito un protocolo para la biosíntesis enzimática y la inmovilización de poliproteínas y verificado el diseño de poliproteínas por AFM-basado SMFS. Esta metodología proporciona un enfoque novedoso para construir el polímero de proteína en una secuencia diseñada, que complementa los métodos anteriores para la ingeniería poliproteica y la inmovilización4,6,52,53,<...

En comparación con los polímeros sintéticos, las proteínas naturales multidominio tienen una estructura uniforme con un número bien controlado y tipo de subdominios1. Esta característica generalmente conduce a una mejor función biológica y estabilidad2,3. Se han desarrollado muchos enfoques, como el acoplamiento de enlace de disulfuro a base de cisteína y la tecnología de ADN recombinante, para la construcción de una proteína polimerizada de este tipo con múltiples dominios4,5,6,7. Sin embargo, el método primero siempre resulta en una secuencia aleatoria e incontrolada, y el segundo conduce a otros problemas, incluyendo la dificultad para la sobreexpresión de proteínas tóxicas y de gran tamaño y la purificación de proteínas complejas con cofactor y otras enzimas delicadas.
Para hacer frente a este reto, desarrollamos un método enzimático que conjuga el monómero proteico para polímero/poliproteína de manera escalonada utilizando una ligasa proteica OaAEP1 combinada con una proteasa TEV8,9. OaAEP1 es una endopeptidasa estricta y eficiente. Dos proteínas pueden vincularse covalentemente como secuencia Asn-Gly-Leu (NGL) a través de dos termini por OaAEP1 en menos de 30 min si el N-terminus es residuos de Gly-Leu (GL) y el otro de los cuales el C-terminus es residuos de NGL10. Sin embargo, el uso de OaAEP1 sólo para vincular monómero de proteína conduce a un polímero proteico con una secuencia incontrolada como el método de acoplamiento basado en cisteína. Por lo tanto, diseñamos el N-terminus de la unidad de proteína con un sitio de proteasa TEV extraíble más un residuo de leucina como ENLYFQ/G-L-POI. Antes de la escisión TEV, el N-terminal no participaría en la ligadura OaAEP1. Y luego los residuos de GL en N-terminus, que son compatibles con la ligadura OaAEP1 adicional, se expone después de la escisión TEV. Así, hemos logrado un método secuencial de biosíntesis enzimática de poliproteína con una secuencia relativamente bien controlada.
Aquí, nuestro método de síntesis enzimática escalonada se puede utilizar en la preparación de muestras de poliproteínas, incluyendo controlado por secuencia e incontrolado, e inmovilización de proteínas para estudios de una sola molécula, especialmente para el sistema complejo como metaloproteína.
Además, los experimentos SMFS basados en AFM nos permiten confirmar la construcción y estabilidad de polímeros proteicos a nivel de una sola molécula. La espectroscopia de fuerza de una sola molécula, incluyendo AFM, pinza óptica y pinza magnética, es una herramienta general en nanotecnología para manipular la biomolécula mecánicamente y medir su estabilidad11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. El AFM monomolécula ha sido ampliamente utilizado en el estudio de la proteína (un)folding21,22,23,24,25, la medición de la fuerza de la interacción receptor-ligand26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, enlace químico inorgánico20,36,37,38,39,40,41,42,43 y el enlace metal-ligand en metalloproteína44,45,46,47,48,49,50 . Aquí, El AFM de una sola molécula se utiliza para verificar la secuencia de poliproteína sintetizada basada en la señal de despliegue de proteínas correspondiente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

Las técnicas químicas y de bioconjugación se han desarrollado rápidamente en los últimos años y permiten la construcción de polímeros proteicos. Sin embargo, un proceso controlado de polimerización de proteínas siempre es un desafío. Aquí, hemos desarrollado una metodología enzimática para la construcción de proteínapolis polimerizadas paso a paso en una secuencia racionalmente controlada. En este método, el C-terminus de un monómero proteico es NGL para la conjugación de proteínas utilizando OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) mientras que el N-terminus era un teV escleable (virus de grabado de tabaco) sitio más una L (ENLYFQ/GL) para la protección temporal N-terminal. En consecuencia, OaAEP1 fue capaz de añadir sólo un monómero proteico a la vez, y luego la proteasa TEV cortó el N-terminus entre Q y G para exponer el NH2-Gly-Leu. Entonces la unidad está lista para la próxima ligadura OaAEP1. La poliproteína de ingeniería se examina mediante el desarrollo de un dominio de proteína individual utilizando espectroscopia de fuerza de una sola molécula basada en microscopía de fuerza atómica (AFM-SMFS). Por lo tanto, este estudio proporciona una estrategia útil para la ingeniería de poliproteínas y la inmovilización.

Los residuos NGL introducidos entre proteínas adyacentes por la ligadura OaAEP1 no afectarán a la estabilidad del monómero de proteína en el polímero, ya que la fuerza de despliegue (<Fu>) y el incremento de la longitud del contorno (<Lc>) es comparable con el estudio anterior(Figura 1). El resultado purificador de la proteína rubredoxina se muestra en la Figura 2. Para probar la proteína después de la escisión TEV es compatible co...

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OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Aquí, presentamos un protocolo para conjugar monómero proteico por enzimas formando polímero proteico con una secuencia controlada e inmovilizarlo en la superficie para estudios de espectroscopia de fuerza de una sola molécula.

Síntesis enzimática mediada por OaAEP1 e inmovilización de proteína polimerizada para espectroscopia de fuerza de una sola molécula

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Nuestro método enzimático utiliza oligómero de proteínas con un número controlado de grado de polimerización. Es una preparación de muestra perfecta para el estudio de espectroscopia de fuerza de una sola molécula, así como para la construcción de materiales a base de proteínas. Nuestro método no introduce cisteína en la proteína diana.Debido a que la cisteína es uno de los residuos funcionales más importantes para la proteína, facilita la construcción de proteínas o enzimas de materia polimerizada. Demostrando el procedimiento serán Yibing Deng y Shengchao Shi, estudiantes de posgrado de mi laboratorio. Para empezar, disolver 20 gramos de cromato de potasio en 40 mililitros de agua ultrapura en un vaso de precipitados.Agregue lentamente 360 mililitros de ácido sulfúrico concentrado a la solución de dicromato de potasio y utilice una varilla de vidrio para agitar suavemente. Coloque un cubreobjetos de vidrio en el ácido cromático y transfiéralo a un horno a 80 grados Centígrados durante 30 minutos. Limpie el cubreobjetos con agua y luego alcohol etílico absoluto y seque el cubreobjetos con una corriente de nitrógeno.Sumerja completamente el cubreobjetos en una solución de tolueno APTES de 1% de volumen durante una hora a temperatura ambiente mientras las protege de la luz. Lavar el cubreobjetos con tolueno primero y luego con alcohol etílico absoluto y secar el cubreobjetos con una corriente de nitrógeno. Incubar el cubreobjetos a 80 grados celsius durante 15 minutos y luego dejar que se enfríe a temperatura ambiente.Utilice una pipeta para añadir 200 microlitros de un miligramo por mililitro Sulfo-SMCC en solución DMSO entre dos cubreobjetos inmovilizados e incubar durante una hora protegida de la luz. Después de una hora, lave primero los cubreobjetos con DMSO y luego con alcohol etílico absoluto para eliminar el Sulfo-SMCC residual. Seque el cubreobjetos bajo una corriente de nitrógeno.Pipetear 60 microlitros de 200 micromolares GL-ELP-50 cys-protein solución en un cubrelip funcionalizado e incubar a 25 grados Celsius durante unas tres horas. Después de eso, lave el cubreobjetos con agua ultrapura para eliminar el GL-ELP-50-cys no reaccionado. Para preparar la superficie voladiza funcionalizada, primero sumerja los voladizos en ácido cromático y limpie los voladizos a 80 grados Celsius durante 10 minutos.Use agua y alcohol etílico absoluto para lavar el ácido. Sumergir el voladizo con una solución de tolueno APTES de 1% de volumen para realizar una salinización amino en una tapa de tubo de plástico durante una hora. Enjuague el voladizo con alcohol etílico absoluto y luego hornee el voladizo a 80 grados Celsius durante 15 minutos.Sumerja el voladizo en la solución Sulfo-SMCC durante una hora y luego enjuague el voladizo con alcohol etílico absoluto. Para vincular el cys-ELP-50-NGL a la superficie, sumerja los voladizos en el cys-ELP-50-NGL con el grupo de maleimidos de Sulfo-SMCC durante 1,5 horas. A continuación, lave el cys-ELP-50-NGL no reaccionado en el voladizo por agua ultrapura.A continuación, sumerja un voladizo funcionalizado en una solución que contenga 200 microlitros de 50 micromolares de solución proteica GL-CBM-XDockerin con 200 nanomolares OaAEP1 y colóquelos a 25 grados Celsius durante 20 a 30 minutos. A continuación, utilice el tampón AFM para lavar la proteína no reaccionada. Es fundamental lavar la proteína residual no reaccionada antes del experimento AFM porque formará un par de cohesina-dockerína y bloqueará el voladizo para tomar nueva proteína en la superficie.Para vincular la unidad de ligadura cohesin-T-L-protein de interest-NGL con el GL-ELP-50 inmovilizado en la superficie del cubreobjetos, añadir 15 microlitros de OaAEP1 en la cubierta y dejar que se incuba durante 30 minutos. Utilice de 15 a 20 mililitros de tampón AFM para lavar las proteínas no reaccionadas. Añadir 100 microlitros de TEV proteasa para cortar la unidad de proteínas en el sitio de reconocimiento TEV durante una hora a 25 grados centígrados.Luego usa de 15 a 20 mililitros de tampón AFM para lavar las proteínas residuales. Enlace la unidad de ligadura cohesina-T-L-proteína de interés-NGL al vidrio GL-ubiquitina-NGL de OaAEP1 durante 30 minutos. Dependiendo de las construcciones proteicas GL-ubiquitina-NGL que se construirá sobre la superficie de vidrio, repita los pasos de preparación de poliproteína n1 veces.Omita la última reacción de escote teví para reservar cohesina en el polímero proteico como vidrio cohesina-TEV-L-ubiquitina-n-NGL. Añadir un mililitro de tampón AFM con 10 cloruros de calcio mili evolucionadores y cinco milimolares ascórbicos a la cámara de fluido AFM. Elija la punta D de la sonda AFM funcionalizada para el experimento.Sumerja la sonda en el búfer AFM. Retirar el voladizo a una velocidad constante de 400 nanómetros por segundo de la superficie. Mientras tanto, registre la curva de extensión de fuerza a una frecuencia de muestreo de 4.000 hercios.Utilice el teorema de la equiparción para calibrar el voladizo en búfer AFM con un valor K constante de resorte preciso antes de cada experimento. Fije la punta en voladizo funcionalizada con dockerin a la superficie depositada funcionalizada con cohesina para formar el par de cohesina-dockerin. A continuación, abra el software de procesamiento de datos JPK y seleccione la curva de extensión de fuerza con el patrón característico de corte de sierra y una fuerza de desprendimiento alta.En este estudio, los residuos de NGL introducidos entre proteínas adyacentes por ligadura OaAEP1 no afectaron a la estabilidad del monómero proteico en el polímero expresado ya que la fuerza de desdoblamiento y el incremento de contra-longitud fue comparable con el estudio anterior. La purificación de rubredox de forma férrica presentó picos típicos de absorción visualizados por UV en 495 nanómetros y 575 nanómetros, mientras que la forma de zinc no.También se muestran la mezcla de ligadura de GL-ubiquitina y cohesina-TEV-L-ubiquitina con o sin OaAEP1 y OaAEP1 puro. Es fundamental funcionalizar la superficie con Sulfo-SMCC activo para una fijación de péptidos con éxito. Aquí proporcionamos un nuevo método para construir proteína polimerizada.Facilita a los investigadores estudiar el complejo sistema de proteínas utilizando espectroscopia de fuerza de una sola molécula. El ácido cromático es fuertemente corrosivo y ácido. Tenga cuidado cuando se prepare y maneje.

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