Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (Grant No. 21771103, 21977047), Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (Grant No. BK20160639) och Shuangchuang Program i Jiangsu-provinsen.

1. Proteinproduktion
<ol><li>
Genklon
	<ol>
<li>Köp gener kodning för protein av intresse (POI): Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, cellulosa-bindande modul (CBM), dockerin-X domän (XDoc) och sammanhållning från Ruminococcus flavefacience, tobak etsvirus (TEV) proteas, elastin-liknande polypeptider (ELPs).</li>
		<li>Utför polymeraskedjereaktion och använd tre-begränsning matsmältningsenzym system BamHI-BglII-KpnI för att kombinera genen ...

Vi har beskrivit ett protokoll för enzymatisk biosyntes och immobilisering av polyprotein och verifierat polyproteindesign av AFM-baserade SMFS. Denna metod ger en ny metod för att bygga protein-polymer i en utformad sekvens, som kompletterar tidigare metoder för polyprotein teknik och immobilisering4,6,52,53,54,55,</...

Jämfört med syntetiska polymerer har naturliga multidomänproteiner en enhetlig struktur med ett välkontrollerat antal och typ av underdomäner1. Denna funktion leder vanligtvis till förbättrad biologisk funktion och stabilitet2,3. Många metoder, såsom cysteinbaserad disulfidbindningskoppling och rekombinant DNA-teknik, har utvecklats för att bygga ett sådant polymeriserat protein med flera domäner4,5,6,7. Emellertid resulterar den tidigare metoden alltid i en slumpmässig och okontrollerad sekvens, och den senare leder till andra problem, inklusive svårigheten för överuttryck av giftiga och stora proteiner och rening av komplext protein med kofaktor och andra känsliga enzymer.
För att möta denna utmaning utvecklar vi en enzymatisk metod som konjugerar proteinmonomer tillsammans för polymer/polyprotein på ett stegvis sätt med hjälp av en proteinligase OaAEP1 i kombination med en proteas TEV8,9. OaAEP1 är en strikt och effektiv endopeptidas. Två proteiner kan kopplas samman kovalent som Asn-Gly-Leu-sekvens (NGL) genom två termini av OaAEP1 på mindre än 30 min om N-ändstationen är Gly-Leu-resterna(GL) och den andra som C-ändstationen är NGL-rester10. Emellertid leder användningen av OaAEP1 endast för att länka proteinmonomer till en proteinpolymer med en okontrollerad sekvens som cysteinbaserad kopplingsmetod. Därför designar vi N-ändstationen för proteinenheten med en löstagbar TEV-proteasplats plus en lucinrester som ENLYFQ/G-L-POI. Innan TEV klyvning, N-terminalen skulle inte delta i OaAEP1 ligering. Och sedan GL rester vid N-ändstation, som är förenliga med ytterligare OaAEP1 ligering, utsätts efter TEV klyvning. Således har vi uppnått en sekventiell enzymatisk biosyntesmetod av polyprotein med en relativt välkontrollerad sekvens.
Här kan vår stegvisa enzymatiska syntesmetod användas i polyproteinprovberedning, inklusive sekvensstyrd och okontrollerad, och proteinimmobilisering för enmolekylsstudier också, särskilt för det komplexa systemet som metalloprotein.
Dessutom tillåter AFM-baserade SMFS-experiment oss att bekräfta proteinpolymerkonstruktion och stabilitet på enmolekylsnivå. Enmolekylkraftspektroskopi, inklusive AFM, optisktweezer och magnetisktweezer, är ett allmänt verktyg inom nanoteknik för att manipulera biomolekylen mekaniskt och mäta deras stabilitet11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. AFM med en molekyl har använts i stor utsträckning vid studiet av protein (un)vikning21,22,23,24,25, styrkemätning av receptor-ligand interaktion26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, oorganisk kemisk bindning20,36,37,38,39,40,41,42,43 och metall-ligan och bindning i metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Här används enmolekylsAFM för att verifiera den syntetiserade polyproteinsekvensen baserat på motsvarande proteinpågående signal.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

Kemiska och biokonjugationstekniker har utvecklats snabbt under de senaste åren och möjliggöra byggande av proteinpolymerer. En kontrollerad proteinpolymeriseringsprocess är dock alltid en utmaning. Här har vi utvecklat en enzymatisk metod för att konstruera polymererat protein steg för steg i en rationellt kontrollerad sekvens. I denna metod är C-ändstationen för en proteinmonomer NGL för proteinkonjugering med OaAEP1 (Oldenlandia affinis asparaginylendopeptidaser) 1) medan N-ändstationen var en cleavable TEV (tobak etsvirus) klyvning webbplats plus en L (ENLYFQ/GL) för tillfällig N-terminal skydd. Därför kunde OaAEP1 lägga till endast en proteinmonomer i taget, och sedan TEV proteask klynade N-ändstationen mellan Q och G för att exponera NH2-Gly-Leu. Då är enheten klar för nästa OaAEP1 ligering. Det konstruerade polyproteinet undersöks genom att utveckla enskilda proteindomän med hjälp av atomkraftmikroskopibaserad enmolekylkraftspektroskopi (AFM-SMFS). Därför ger denna studie en användbar strategi för polyprotein teknik och immobilisering.

De NGL-rester som införs mellan angränsande proteiner genom OaAEP1 ligering påverkar inte proteinmonomerstabiliteten i polymeren som den pågående kraften (<Fu>) och konturlängdsökningen (<ΔLc>) är jämförbar med den tidigare studien(figur 1). Reningsresultatet av rubredoxinproteinet visas i figur 2. För att bevisa proteinet efter TEV klyvning är kompatibel med följande OaAEP1 ligering att konstruera proteinpolymer med en kontro...

Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Här presenterar vi ett protokoll för att konjugera proteinmonomer av enzymer som bildar proteinpolymer med en kontrollerad sekvens och immobilisera den på ytan för enmolekylkraft spektroskopi studier.

OaAEP1-medierad enzymatisk syntes och immobilisering av polymeriserat protein för enmolekylkraftsspektroskopi

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Vår enzymatiska metod använder protein oligomer med ett kontrollerat antal polymerisationsgrad. Det är en perfekt provberedning för enmolekylkraftsspektroskopistudie samt proteinbaserad materialkonstruktion. Vår metod introducerar inte cystein till målproteinet.Eftersom cystein är en av de viktigaste funktionella rester för protein, underlättar det byggandet av polymeriserad materia protein eller enzymer. Demonstrera förfarandet kommer att Yibing Deng och Shengchao Shi, grad studenter från mitt laboratorium. Till att börja, lös 20 gram kaliumkromat i 40 milliliter ultrarent vatten i en bägare.Tillsätt långsamt 360 milliliter koncentrerad svavelsyra till kaliumdikromatlösningen och använd en glasstav för att röra om försiktigt. Placera en glasöverdrag i kromsyran och överför den till en ugn vid 80 grader Celsius i 30 minuter. Rengör täckslip med vatten och sedan absolut etylalkohol och torka täckslip med en ström av kväve.Sänk täcket ned helt i 1 volymvolymsvolym APTES-toluenlösning i en timme i rumstemperatur samtidigt som de skyddas mot ljus. Tvätta täcket med toluen först och sedan med absolut etylalkohol och torka täcksläppet med en ström av kväve. Inkubera täckplattan vid 80 grader Celsius i 15 minuter och låt den svalna till rumstemperatur.Använd en pipett för att lägga till 200 mikroliter på ett milligram per milliliter Sulfo-SMCC i DMSO-lösning mellan två immobiliserade täckslipar och inkubera i en timme skyddad från ljus. Efter en timme, tvätta täcken med DMSO först och sedan med absolut etylalkohol för att avlägsna kvarvarande Sulfo-SMCC. Torka täckskydd under en ström av kväve.Pipett 60 mikroliter av 200 mikromolar GL-ELP-50 cys-proteinlösning på en funktionaliserad täckslip och inkubera vid 25 grader Celsius i cirka tre timmar. Därefter tvättar du täckplattan med ultrarent vatten för att avlägsna de oredigerade GL-ELP-50-cys. För att förbereda funktionaliserad cantilever yta, först sänka ner kantilvers i kromsyra och rengör cantilevers vid 80 grader Celsius i 10 minuter.Använd vatten och absolut etylalkohol för att tvätta bort syran. Sänk ned fribärande med 1 volymvolym volymvolym APTES-toluenlösning för att utföra aminosaltning i en plaströrslocka i en timme. Skölj cantilever med absolut etylalkohol och sedan baka cantilever på 80 grader Celsius i 15 minuter.Sänk ned fribärande i Sulfo-SMCC-lösning i en timme och skölj sedan fribärande med absolut etylalkohol. För att länka cys-ELP-50-NGL till ytan, sänk ned kantilversna i cys-ELP-50-NGL med maleimidegruppen av Sulfo-SMCC i 1,5 timmar. Tvätta sedan bort den oreagerade cys-ELP-50-NGL på cantilever av ultrarent vatten.Därefter sänk en funktionaliserad cantilever i en lösning som innehåller 200 mikroliter av 50 mikromolar GL-CBM-XDockerin proteinlösning med 200 nanomolar OaAEP1 och placera dem på 25 grader Celsius i 20 till 30 minuter. Använd sedan AFM buffert för att tvätta bort oreagerat protein. Det är viktigt att tvätta bort oreagerade restprotein innan AFM experiment eftersom det kommer att bilda en cohesin-dockerin par och blocket cantilever att ta upp nytt protein på ytan.För att länka ligeringsenheten cohesin-T-L-protein av intresse-NGL till GL-ELP-50 immobiliserade på täckplattan ytan, tillsätt 15 mikroliter av OaAEP1 på täckplattan och låt den inkubera i 30 minuter. Använd 15 till 20 milliliter AFM-buffert för att tvätta bort eventuella oreagerade proteiner. Tillsätt 100 mikroliter av TEV-proteas för att klyva proteinenheten vid TEV-igenkänningsstället i en timme vid 25 grader Celsius.Använd sedan 15 till 20 milliliter AFM-buffert för att tvätta bort kvarvarande proteiner. Länka ligeringsenheten cohesin-T-L-protein av intresse-NGL till GL-ubiquitin-NGL glaset av OaAEP1 i 30 minuter. Beroende på proteinkonstruktioner GL-ubiquitin-NGL som ska byggas på glasytan, upprepa polyproteinberedningsstegen n1 gånger.Utelämna den sista TEV klyvning reaktion att reservera cohesin på proteinet polymer som cohesin-TEV-L-ubiquitin-n-NGL glas. Tillsätt en milliliter AFM-buffert med 10 millimolar kalciumklorid och fem millimolar askorbinsyra till AFM-vätskekammaren. Välj D-spetsen för den funktionaliserade AFM-sonden för experimentet.Sänk ner sonden i AFM-bufferten. Dra tillbaka cantilever med en konstant hastighet på 400 nanometer per sekund från ytan. Under tiden, registrera kraft förlängningskurvan vid en provhastighet på 4, 000 hertz.Använd ekproparttionsteorem för att kalibrera fribärande i AFM-buffert med ett exakt fjäderkonstant K-värde före varje experiment. Fäst den cantilever spetsen functionalized med dockerin till proteinet deponerade ytan functionalized med cohesin att bilda cohesin-dockerin paret. Öppna sedan JPK databehandling programvara och välj kraft förlängningskurva med den karakteristiska sawtooth-liknande mönster och en hög avskildhet kraft.I denna studie påverkade de NGL-rester som infördes mellan intilliggande proteiner av OaAEP1-ligering inte proteinmonommerstabiliteten i polymeren uttryckt som den utspelande kraften och kontralängdssteget var jämförbart med tidigare studie. Rening av ferric form rubredoxin presenteras typiska UV-visualiserade absorption toppar på 495 nanometer och 575 nanometer medan zink form inte. SDS-sida gel resultaten av den stegvisa matsmältningen och ligering visar kohesive TEV-L-ubiquitin, resultatet protein blandning av TEV klyvning, ren GFP-TEV-proteas och renat produkt GL-ubiquitin.Den klyvda GL-ubiquitin och cohesin-TEV-L-ubiquitin ligation blandningen med eller utan OaAEP1 och ren OaAEP1 visas också. Det är avgörande att funktionalisera ytan med aktiv Sulfo-SMCC för framgångsrikt peptid fastsättning. Här ger vi en ny metod för att bygga polymeriserat protein.Det underlättar forskare att studera komplexa proteinsystem med hjälp av enmolekylkraftspektroskopi. Kromsyra är starkt frätande och sur. Var försiktig när du förbereder och hanterar det.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Snabb ett steg Enzymatisk syntes och All-vatten Rening av trehalos analoger

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Hög precision FRET vid en-molekylnivå för biomolekylstrukturbestämning

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi av enda proteinmolekyler genom en Atomic Force Mikroskop

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

Singel-molekyl Manipulation av G-quadruplexes av magnetisk pincett

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Använda tre färger singel-molekyl bandet att studera korrelationen av proteininteraktioner

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

En fluorescens fluktuation spektroskopi haltbestämning av Protein-Protein interaktioner på Cell-Cell kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Encellsanalys av transkriptionellt aktiva alleler med enmolekylig FISK

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Enmolekyl fluorescens energiöverföringsstudie av ribosomproteinsyntes

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...