Name: oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy
Uploaded: 2020-02-05T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No. 21771103, 21977047), Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı (Grant No) tarafından desteklenmiştir. BK20160639) ve Jiangsu Eyaleti Shuangchuang Programı.

1. Protein üretimi
<ol><li>
Gen klonu
	<ol>
<li>Satın alma genleri ilgi protein için kodlama (POI): Ubiquitin, Rubredoxin (RD)51, selüloz bağlayıcı modül (CBM), dockerin-X etki alanı (XDoc) ve Ruminococcus flavefaciencegelen uyum , tütün etch virüs (TEV) protease, elastin-likepeptids (ELP).</li>
		<li>Polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirin ve farklı protein parçalarından geni yeniden birleştirmek için üç restriksiyonsindirim enzim sistemi Ba...

Enzimatik biyosentez ve poliproteinimmobilizasyonu için bir protokol tanımladık ve afm tabanlı SMFS tarafından poliprotein tasarımını doğruladık. Bu metodoloji, poliprotein mühendisliği ve immobilizasyon4,6,52, 53,54,55,56,57,58,...

Sentetik polimerler ile karşılaştırıldığında, doğal çok etki alanı proteinleri iyi kontrollü bir sayı ve subdomains1türü ile tek düze bir yapıya sahip. Bu özellik genellikle gelişmiş biyolojik fonksiyon ve kararlılık yol açar2,3. Sistein bazlı disülfür bağı bağlantısı ve rekombinantDNA teknolojisi gibi birçok yaklaşım, birden fazla etki alanı4,5,6,7ile böyle bir polimerize protein oluşturmak için geliştirilmiştir. Ancak, eski yöntem her zaman rasgele ve kontrolsüz bir dizi sonuçlanır, ve ikincisi toksik ve büyük boyutlu proteinlerin aşırı ekspresyonu ve kofaktör ve diğer hassas enzimler ile karmaşık protein saflaştırılması için zorluk da dahil olmak üzere diğer sorunlara yol açar.
Bu zorluğu aşmak için, protein monomerini polimer/poliprotein için adım adım bir şekilde bir protein ligaz OaAEP1 ile proteaz TEV8,9ile birleştiren enzimatik bir yöntem geliştiriyoruz. OaAEP1 sıkı ve etkili bir endopeptidazdır. N-terminus Gly-Leu kalıntısı (GL) ise iki protein Kovalent Olarak Asn-Gly-Leu dizisi (NGL) OaAEP1 tarafından iki termini ile 30 dakikadan daha az ve c-terminus NGL kalıntıları10ise bağlanabilir. Ancak, OaAEP1'in sadece protein monomerini bağlamak için kullanılması, sistein bazlı kaplin yöntemi gibi kontrolsüz bir diziye sahip bir protein polimerine yol açar. Bu nedenle, protein ünitesinin N-terminus'unu çıkarılabilir bir TEV proteaz alanı ve enlyfq/G-L-POI olarak bir lösin kalıntısı ile tasarlıyoruz. TEV bölünmesinden önce, N-terminali OaAEP1 ligasyonuna katılmaz. Ve daha sonra N-terminus gl artıkları, hangi daha fazla OaAEP1 ligasyon ile uyumludur, TEV bölünme sonra maruz kalır. Böylece, nispeten iyi kontrol edilen bir dizi ile poliproteinin sıralı enzimatik biyosentez yöntemini elde ettik.
Burada, adım adım enzimatik sentez yöntemimiz, sekans kontrollü ve kontrolsüz dahil olmak üzere poliprotein numune hazırlamada ve özellikle karmaşık sistem için tek moleküllü çalışmalar için protein immobilizasyonunda kullanılabilir. metalloprotein.
Ayrıca, AFM tabanlı SMFS deneyleri bize tek molekül düzeyinde protein polimer inşaat ve istikrar onaylamak için izin verir. AFM, optik cıvık ve manyetik cıvık da dahil olmak üzere tek moleküllü kuvvet spektroskopisi, biyomolekülü mekanik olarak manipüle etmek ve stabilitelerini ölçmek için nanoteknolojide genel bir araçtır11,12,13,14,15,16,17,18,19,20. Tek moleküllü AFM yaygın protein çalışmasında kullanılmıştır (un)katlama21,22,23,24,25, reseptör-ligandetkileşimininmukavemet ölçümü 26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35, inorganik kimyasal bağ20,36,37,38,39,40,41,42,43 ve metal-ligand bond metalloprotein44,45,46,47,48,49,50 . Burada, tek moleküllü AFM, sentezlenen poliprotein dizisini ilgili protein açılma sinyaline göre doğrulamak için kullanılır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>iron (III) chloride hexahydrate</td>
			<td>Energy chemical</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc chloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>100.00%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>calcium chloride hydrate</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td>99.9965% crystalline aggregate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Bio Xtra, &#8805;99.0%, crystalline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(3-Aminopropyl) triethoxysilane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>&#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>90%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Macklin</td>
			<td></td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5,5&#39;-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genes</td>
			<td>Genscript</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanowizard 4 AFM</td>
			<td>JPK Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MLCT cantilever</td>
			<td>Bruker Corp</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mono Q 5/50 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKTA FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip</td>
			<td>Sail Brand</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avanti JXN-30 Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Image System</td>
			<td>Tanon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oaaep1-mediated enzymatic synthesis and immobilization of polymerized protein for single-molecule force spectroscopy

Kimyasal ve biyo-konjugasyon teknikleri son yıllarda hızla geliştirilmiş ve protein polimerlerinin oluşturulmasına olanak sağlar. Ancak, kontrollü bir protein polimerizasyon süreci her zaman bir meydan okumadır. Burada, polimerize proteini adım adım rasyonel olarak kontrol edilen bir dizide oluşturmak için enzimatik bir metodoloji geliştirdik. Bu yöntemde, bir protein monomer C-terminus OaAEP1 kullanarak protein çekimi için NGL(Oldenlandia affinis asparaginyl endopeptidases) 1) N-terminus bir dekolte TEV iken (tütün etch virüs) dekolte sitesi artı bir L (ENLYFQ / GL) geçici N-terminal koruma için. Sonuç olarak, OaAEP1 bir seferde sadece bir protein monomer eklemek başardı, ve sonra TEV proteaz NH2-Gly-Leu ortaya çıkarmak için Q ve G arasındaki N-terminus cleaved. Sonra birim sonraki OaAEP1 ligasyon için hazırdır. Tasarlanmış poliprotein atomik kuvvet mikroskobu tabanlı tek moleküllü kuvvet spektroskopisi (AFM-SMFS) kullanılarak bireysel protein etki alanı açılarak incelenir. Bu nedenle, bu çalışma poliprotein mühendisliği ve immobilizasyon için yararlı bir strateji sağlar.

OaAEP1 ligasyonu ile komşu proteinler arasında tanıtılan NGL artıkları polimerdeki protein monomer stabilitesini etkilemez, zira açılma kuvveti (<Fu>) ve kontur uzunluğu artış (<ΔLc>) önceki çalışmayla karşılaştırılabilir(Şekil 1). Rubredoksin proteininin arınma sonucu Şekil 2'degösterilmiştir. TEV dekoltesi sonrası proteini kanıtlamak için aşağıdaki OaAEP1 ligasyonu ile uyumlu durarak protein polimerini kont...

Watch this Scientific Journal Video about OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy at JoVE.com

OaAEP1-Mediated Enzymatic Synthesis and Immobilization of Polymerized Protein for Single-Molecule Force Spectroscopy

Burada, protein monomerini kontrollü bir dizi ile protein polimeri oluşturan enzimler tarafından biraraya getirmek ve tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışmaları için yüzeyde hareketsiz hale getirmek için bir protokol sokuyoruz.

OaAEP1-Tek Moleküllü Kuvvet Spektroskopisi İçin Polimerize Proteinin Aracılı Enzimatik Sentezi ve Immobilizasyonu

Chemical and bio-conjugation techniques have been developed rapidly in recent years and allow the building of protein polymers. However, a controlled ...

Enzimatik yöntemimiz protein oligomerini kontrollü sayıda polimerizasyon derecesi ile kullanmaktadır. Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi çalışması nın yanı sıra protein bazlı malzeme yapımı için mükemmel bir örneklem hazırlığıdır. Yöntemimiz hedef proteine sistein getirmez.Sistein protein için en önemli fonksiyonel kalıntılardan biri olduğu için polimerize madde proteini veya enzimlerinin oluşturulmasını kolaylaştırır. Prosedürü gösteren ler, yibing Deng ve Shengchao Shi, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencileri olacaklar. Başlamak için, bir kabın içinde ultrasaf su 40 mililitre potasyum kromat 20 gram eritin.Yavaş yavaş potasyum dikromat çözeltisi konsantre sülfürik asit 360 mililitre ekleyin ve yavaşça karıştırmak için bir cam çubuk kullanın. Kromik asit bir cam kapak kayma yerleştirin ve 30 dakika boyunca 80 santigrat derecede bir fırına aktarın. Coverslip'i su yla temizleyin ve ardından mutlak etil alkolü temizleyin ve bir azot akışı ile kapağı kurulayın.Coverslip'i oda sıcaklığında bir saat boyunca hacim APTES toluen çözeltisi ile %1 hacimde batırın ve ışıktan koruyun. Coverslip'i önce toluen ile yıkayın, sonra mutlak etil alkol le yıkayın ve kapağı bir nitrojen akışı ile kurulayın. Coverslip'i 80 derecede 15 dakika kuluçkaya yatırın ve oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın.DMSO çözeltisine mililitre Sulfo-SMCC başına 200 mikrolitre lik bir miligram eklemek için bir pipet kullanın. Bir saat sonra, artık Sulfo-SMCC kaldırmak için önce DMSO ve daha sonra mutlak etil alkol ile kapakları yıkayın. Bir azot deresi altında kapak kayma kuru.Pipet 60 mikrolitre 200 mikromolar GL-ELP-50 cys-protein çözeltisi üzerine fonksiyonel coverslip üzerine ve yaklaşık üç saat boyunca 25 santigrat derecede kuluçka. Bundan sonra, reaksiyona girilmemiş GL-ELP-50-cys kaldırmak için ultra saf su ile coverslip yıkayın. İşlevselleştirilmiş kantilever yüzeyini hazırlamak için, önce kantileverleri kromik asitle batırın ve 80 derecede 10 dakika boyunca temizleyin.Asidi temizlemek için su ve mutlak etil alkol kullanın. Bir saat boyunca plastik bir tüp kapağı amino salinizasyon gerçekleştirmek için hacim APTES toluen çözeltisi ile% 1 hacimli kantilever batırın. Mutlak etil alkol ile cantilever durulayın ve sonra 15 dakika boyunca 80 derece santigrat de kantilever pişirin.Bir saat boyunca Sulfo-SMCC çözeltisi içinde kantilever batırın ve sonra mutlak etil alkol ile cantilever durulayın. Cys-ELP-50-NGL'yi yüzeye bağlamak için, cys-ELP-50-NGL'deki kantileverleri Sulfo-SMCC'nin maleimid grubuyla 1,5 saat batırın. Daha sonra reaksiyona yanmamış kis-ELP-50-NGL'yi ultra saf su ile kantilever üzerinde yıkayın.Daha sonra, 200 nanomolar OaAEP1 ile 50 mikromolar GL-CBM-XDockerin protein çözeltisi 200 mikrolitre içeren bir çözelti de işlevsel leştirilmiş bir kantilite batırın ve 20 ila 30 dakika için 25 derece santigrat yerleştirin. Daha sonra tepkiverilmemiş proteini temizlemek için AFM tamponu kullanın. AFM deneyi öncesinde reaksiyona girmemiş artık proteini yıkamak çok önemlidir, çünkü bir kohesin-dockerin çiftleri oluşturacak ve yüzeyde yeni protein almak için kantili blok.İlgi-NGL'nin ligasyon ünitesi cohesin-T-L-proteinini coverslip yüzeyinde hareketsiz hale getirilen GL-ELP-50'ye bağlamak için, kapak kaymasına 15 mikrolitre OaAEP1 ekleyin ve 30 dakika kuluçkaya yatırın. Tepkimeyen proteinleri temizlemek için 15 ila 20 mililitre AFM tamponu kullanın. TEV tanıma yerindeki protein ünitesini 25 santigrat derecede bir saat süreyle cleave için 100 mikrolitre TEV proteaz ekleyin.Daha sonra artık proteinleri temizlemek için 15 ila 20 mililitre AFM tampon kullanın. İlgi-NGL'nin ligasyon ünitesi cohesin-T-L-proteinini OaAEP1 ile GL-ubiquitin-NGL camına 30 dakika bağlayın. Cam yüzey üzerine kurulacak GL-ubiquitin-NGL protein yapılacına bağlı olarak, poliprotein hazırlama adımlarını n1 kez tekrarlayın.Protein polimerinde kohesin-TEV-L-ubiquitin-n-NGL cam olarak rezerv kohesin için son TEV bölünme reaksiyonu atlayın. AFM sıvı odasına 10 milimolar kalsiyum klorür ve beş milimolar askorbik asit ile bir mililitre AFM tampon ekleyin. Deneme için işlevselleştirilmiş AFM sondasının D ucunu seçin.Sondayı AFM arabelleğine batırın. Kantili, yüzeyden saniyede 400 nanometre sabit bir hızda geri çek. Bu arada, kuvvet uzatma eğrisini 4,000 hertz'lik bir örnek lem hızında kaydedin.Her denemeden önce afm arabelleğindeki kantiliye doğru bir yay sabiti K değeri yle kalibre etmek için eşitlik teoremini kullanın. Kohesin-dockerin çiftini oluşturmak için kohesin ile işlevselleştirilmiş protein birikintisi yüzeyine dockerin ile işlevselleştirilmiş kantilever ucunu takın. Ardından JPK veri işleme yazılımını açın ve karakteristik testere dişi benzeri desen ve yüksek kopma kuvvetiyle kuvvet uzatma eğrisi seçin.Bu çalışmada, OaAEP1 ligasyonu ile komşu proteinler arasında tanıtılan NGL artıkları, açılma kuvveti ve kontra uzunluktaartış olarak ifade edilen polimerdeki protein monomer stabilitesini etkilememiş ve önceki çalışmaile karşılaştırılabilir kalıntılar ortaya konmuştur. Ferrik form rubredoxin saflaştırılması tipik UV-görselleştirilmiş emilim zirveleri sundu 495 nanometre ve 575 nanometre çinko formu vermedi.OaAEP1 ve saf OaAEP1 ile veya olmadan yarık GL-ubiquitin ve cohesin-TEV-L-ubiquitin ligasyon karışımı da gösterilmiştir. Başarılı peptid eki için aktif Sulfo-SMCC ile yüzeyi işlevselleştirmek çok önemlidir. Burada polimerize protein oluşturmak için yeni bir yöntem sağlar.Araştırmacıların tek moleküllü kuvvet spektroskopisi kullanarak karmaşık protein sistemini incelemelerini kolaylaştırır. Kromik asit güçlü aşındırıcı ve asidiktir. Hazırlarken ve işlerken dikkatli olun.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Hızlı Bir adım enzimatik sentezi ve Trehaloz Analoglarının All-sulu Arıtma

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Single-molecule Manipulation of G-quadruplexes by Magnetic Tweezers

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Non-canonical nucleic acid secondary structure G-quadruplexes (G4) are involved in diverse cellular processes, such as DNA replication, transcription, RNA ...

Using Three-color Single-molecule FRET to Study the Correlation of Protein Interactions

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Single-molecule F&#246;rster resonance energy transfer (smFRET) has become a widely used biophysical technique to study the dynamics of biomolecules. For ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

Single Molecule Fluorescence Energy Transfer Study of Ribosome Protein Synthesis

Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması

The ribosome is a large ribonucleoprotein complex that assembles proteins processively along mRNA templates. The diameter of the ribosome is approximately ...