Name: preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis
Uploaded: 2021-03-20T13:30:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

نود أن نشكر جميع أعضاء الطب التحويلي في AstraZeneca أبحاث الأورام والتنمية المبكرة لردود فعلهم على البروتوكول ، وخاصة هيدلي كار ، تامي يه وناثان ستانديفر للحصول على المشورة بشأن إعداد البلازما لتحليل CTDNA ، على عزل PBMC ، و PBMC التبريد و cryopenotyping ، على التوالي.

جميع المؤلفين هم أو كانوا موظفين وأصحاب حصة في AstraZeneca. VM هو موظف في أسيرتا فارما، وتمتلك أسهم في استرازينيكا وجيلياد للعلوم.

إن الاستعدادات عالية الجودة ل PBMCs والبلازما التي يمكن إعدادها بقوة واستنساخ في مواقع التجارب السريرية لا تقدر بثمن لإعلام نقاط النهاية التوقعية المحيطية والديناميكية الدوائية للعلامات الحيوية. هنا قدمنا بروتوكولا قصيرا وواضحا يعالج الخطوات الإشكالية عادة التي كانت حتى الآن عرضة اخطاء التنفيذ في بيئة التجارب السريرية. ومع ذلك، يمكن تحسين البروتوكول بشكل أكبر لتلبية متطلبات محددة، مثل القيود الزمنية في الموقع السريري أو نوع التحليلات النهائية (انظر الملف التكميلي).
ولهذا الغرض، أظهرنا كيفية عزل كل من مركبات PBMCs والبلازما عن الدم الكامل باستخدام أنابيب إعداد الخلايا أحادية النووية لإنتاج حبيبات PBMC المجمدة والبلازما المجمدة المناسبة لمجموعة متنوعة من التحليلات المصب. وقد استرعينا الانتباه إلى الخطوات البروتوكولية الحاسمة بشكل خاص التي تنطوي على الطرد المركزي وتحديد طبقة PBMC في الخطوة 2.5، والكريات PBMC في الخطوتين 3.3 و 3.6. تاريخيا، حيث المواقع السريرية قد ذهب في كثير من الأحيان الخطأ هو في وضع الطرد المركزي إلى الوحدات الصحيحة (الخلط بين RCF أو x قيمة ز مع قيمة RPM)، وتأخير معالجة عينات الدم ودرجة الحرارة ووجود كميات كبيرة من برنامج تلفزيوني فوق بيليه الخلية المجمدة. في معظم الدوارات الطرد المركزي إدخال خطأ قيمة x ز كإعداد دورة في الدقيقة سيؤدي إلى انخفاض كبير في الطرد المركزي مع طبقة PBMC الناتجة سيئة التحديد أو غائبة، والتخلص من PBMC غير مقصودة المحتملة أثناء خطوات الغسيل بسبب الكريات الخلية غير فعالة. ومع ذلك ، هناك احتمال أن طبقة PBMC غير مرئية على الرغم من استخدام إعدادات الطرد المركزي الصحيحة ومحول الدوار إذا كان المريض قد أصيب بلوكوبيا. يمكن أن تؤثر هذه الحالة على المرضى المسجلين في تجارب الأورام بسبب العلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي ويجب النظر فيها. نقطة حرجة أخرى تم توضيحها في البروتوكول هي أنه يجب معالجة العينات في غضون 1-2 ساعة من سحب الدم لتقليل إمكانية أن يحدث انحلال الدم تأثيرا سلبيا على البروتوكول. وعلاوة على ذلك، تهدف إلى معالجة العينات خلال الساعة الأولى من سحب الدم يقلل من تقلب الجسم الحي السابق، والتي يمكن أن يكون لها تأثير كبير في قراءات الدوائية وعلى المؤشرات الحيوية المتضررة من الحفاظ على الدم أو مسارات الإشارات النشطة، مثل الحالة المبينة في الشكل 4. التأخير في معالجة العينات يمكن أن يكون لها أيضا تأثير ضار في صلاحية الخلية إذا كانت الخلايا ستكون cryopreserved34. وثمة عامل آخر يمكن أن يؤثر على كل من الغلة وتلوث خلايا الدم الحمراء هو درجة حرارة التخزين والطرد المركزي، والتي ينبغي الاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). انخفاض درجات الحرارة زيادة كثافة متوسطة الانحدار الكثافة، مما يؤدي إلى درجة أعلى من خلايا الدم الحمراء وتلوث الحبيبيات وهذه الخلايا لا تتجمع كذلك. من ناحية أخرى، يؤدي ارتفاع درجات الحرارة إلى PBMCs المحاصرين بين الكريات الحمراء المجمعة، وبالتالي تقليل العائد من إعداد15،27،28. وأخيرا، من المهم أن لا يوجد أكثر من 50-100 ميكرولتر من السائل مع بيليه الخلية في cryovial، لأن هذا يؤثر سلبا على تركيز أي lysates البروتين التي تم الحصول عليها في معالجة المصب من هذه الاستعدادات PBMC. فائض من السائل سوف تفرط عينات, مما يؤدي إلى lysates مع تركيز البروتين منخفضة جدا غير مناسبة لتحليل العلامات الحيوية. وبالإضافة إلى ذلك، سيعيق الحفاظ على أي تعديلات بعد الترجمة، كما ستنخفض كفاءة التحلل إلى حد كبير.
تم اختيار أنابيب إعداد الخلايا أحادية النووية لأنها توفر الطريقة الأكثر مباشرة لعزل كل من PBMCs والبلازما في سحب دم واحد للتجارب السريرية مع، في تجربتنا، استنساخ ممتازة. معالجة الدم لا تتطلب مشغلين مدربين تدريبا عاليا، واستخدام أنبوب واحد يزيل الحاجة إلى تمييع الدم ونقله إلى أنبوب مختلف، وخفض خطر الإصابة؛ تقصير البروتوكول بسبب تنفيذ خطوات الطرد المركزي مع الفرامل على؛ وجميع الكواشف موجودة في الأنبوب، مما يقلل من التغير. في تجربتنا، وهذه الفوائد تفوق ارتفاع تكلفة هذه الأنابيب بالمقارنة مع غيرها من الأساليب الكلاسيكية التي تتألف فقط من استخدام متوسط الفصل الانحدار الكثافة27،28 (£ 410 لكل 60 وحدة في حين أن المتوسطة lymphoprep ل66 50 مل الاستعدادات هو £ 215). وهي متوفرة في نوعين من مضادات التخثر، الهيبارين والسيترات، وكلاهما قابل للمقارنة في الحفاظ على وظائف PBMCs معزولة35،وبالتالي، فإن اختيار واحد مضاد للتخثر على الآخر سوف يستند إلى التأثير المحتمل للهبارين أو سيترات في دراسات العلامات الحيوية المصب. في حين أنه قد ثبت أن أنابيب EDTA توفير أعلى إنتاجية العزل PBMC مقارنة مع الهيبارين أو سيترات13، والاستفادة من سهولة استخدام واحد أنبوب فقط التلاعب يوازن هذا الاعتبار. إذا السيتوكينات سوف يتم تحليل المضادة للتخثر يمكن أن يكون لها تأثير على المستويات التي تم الكشف عنها في البلازما, وبالتالي ينبغي اختبار كل من مضادات التخثر قبل اختيار واحد للتجربة السريرية36. إذا البلازما سوف تستخدم لدراسات الأيض, استخدام الهيبارين كما مضادات التخثر سيكون المفضل37. ولذلك، فإن النقطة الوحيدة المتبقية للمستخدم النهائي أو عالم ترجمة التجارب السريرية هي ما إذا كان سيترات أو الهيبارين سيكون أكثر ملاءمة لأغراضهم بمجرد تقييم التكاليف.
في حين أن فوائد استخدام أنابيب إعداد الخلايا عديدة مقارنة بالقيود التي تشكلها (ارتفاع تكلفة وتوافر مجموعة محدودة من مضادات التخثر) ، فإن القيد الرئيسي لاستخدام PBMCs أو البلازما للحصول على المؤشرات الحيوية PD في التجارب السريرية ، وخاصة في علم الأورام ، يمكن أن لا يكون له علاقة بطريقة العزل. باستثناء سرطانات الدم، حيث يتم أخذ عينات مباشرة من الورم من الدم المحيطي، لمؤشرات السرطان الأخرى البلازما و PBMCs هي الأنسجة البديلة التي لا تحاكي بالضرورة الورم الأساسي. قد لا تشارك الأنسجة الطرفية الجينوم والظهارة مع الورم الأساسي ، لذلك ، يقتصر التحليل المحيطي للمؤشرات الحيوية التي تعتمد على طفرة ورم محددة بشكل رئيسي على تحليل ctDNA (من البلازما) أو CTCs (عن طريق الفرز اللاحق لطبقة PBMC). بالإضافة إلى ذلك، قد لا تكون السلاسل المتتالية التي تقود أو تساهم في انتشار الورم نشطة في الدم المحيطي. ويمكن التغلب على هذا التحدي من خلال تطبيق نهج اكتشاف العلامات الحيوية التي تستهدف الدم8 لتحديد المؤشرات الحيوية البديلة أو اقتران علاجات الجسم الحي السابق لعزل البلازما38 والاستعدادات PBMC26.
في البروتوكول الحالي يمكن معالجة الكريات PBMC المجمدة بسهولة قبالة الموقع السريري لإعطاء lysates البروتين التي يمكن تقييمها عن طريق النشاف الغربية أو تقنيات ELISA. كما عرضت أساليب بديلة لاستخدام PBMCs لتمكين أساليب IHC(ملف تكميلي). بالإضافة إلى ذلك ، قمنا أيضا بتفصيل إمكانية حفظ التبريد PBMCs (انظر الملف التكميلي)لمراقبة الخلايا المناعية ، وهو تطبيق ذي صلة في علم الأورام ، مع مثبطات نقاط التفتيش المناعية ومركبات ADCs التي تم اختبارها بشكل متزايد في التجارب السريرية. تقييم وظائف المناعة مثل ADCC16 والمناعة هي تطبيقات متوافقة مع PBMCs المبردة معزولة عن أنابيب إعداد الخلايا أحادية النواة15. هناك تحذير بشأن cryopreservation ، كما يمكن أن تعزز أسفل التنظيم من بعض العلامات السطحية والداخلية ، وربما يضعف وظائف الخلايا معينة ، ولكن PBMC cryopreservation هو السبيل الوحيد الممكن لتنفيذ هذه المقايسات بسبب ضيق الوقت عند التعامل مع عينات من مواقع سريرية متعددة لمعالجة في مختبرات خارجية14،15، وهذه الآثار الضارة يمكن التغلب عليها إلى حد كبير من خلال طرق ذوبان جيدة وفترات الراحة39.
وفي الختام، سيسمح البروتوكول المقدم هنا بالتحضير الموثوق به ل PBMCs وعينات البلازما في أي مؤسسة سريرية مزودة بمعدات ومواد مشتركة بحيث يمكن تمكين نقاط النهاية التحويلية من الدم المحيطي بقوة في التجارب السريرية العالمية.
وأخيرا، فإننا نظهر كيف يمكن لتحليل lysates PBMC أن يرشد آليا الاستجابة للعوامل الضارة بالحمض النووي من خلال إظهار تعديل ما بعد الترجمة المعتمد على الجرعة لعوامل DDR الرئيسية ، والتي يمكن استخدامها للمساعدة في تشكيل التطور السريري. ومن شأن تنفيذ أساليب أكثر كمية من النشاف الغربي (مثل قياس الطيف الكتلي40)ويتطلب مواد مدخلات أقل (مثل النشاف الغربي الشعري و ELISA) أن يساعد على تحريك هذه النتائج قبل السريرية نحو تقييم أكثر قوة ومنهجية لعينات المرضى PBMC.

يهدف تطوير الأدوية إلى تقديم علاجات جديدة تلبي الاحتياجات الطبية غير الملباة والطب الشخصي الأكثر استهدافا. آليات المخدرات متعددة قيد التحقيق النشط بما في ذلك تثبيط الأنزيمية مثل كيناز1، بروتياز2، أو بولي (ADP - الريبوز) بوليمرات (PARP)مثبطات 3، البروتين المتدهورات4، الأجسام المضادة العلاجية5، والأدوية المضادة المترافقة (ADCs)6، من بين أمور أخرى كثيرة. ومن الأمثلة على الجهود المبذولة للحصول على علاجات أفضل في علم الأورام هو استخدام مثبطات كيناز بهدف وقف الشلالات الإشارات التي تحافظ على الخلايا السرطانية تتكاثر1،7. قياس مستويات الفوسفور الركيزة محددة لتلك kinases هو أفضل العلامات الحيوية الدوائية لتحديد آلية عمل هذه مثبطات8. أدوية أخرى قد تعدل التعبير عن بروتين معين، وفي هذه الحالة أن تكون قادرة على تحديد التغيرات في تركيز البروتين المستهدف طوليا طوال مسار العلاج أمر بالغ الأهمية. لذلك ، بغض النظر عن خصائص الدواء أو علم الأمراض ، فإن تقييم المؤشرات الحيوية لإنشاء علاقة الدوائية (PK) / الديناميكا الدوائية (PD) بين التعرض للأدوية وتعديل الهدف هو أفضل ممارسة في التطوير السريري المبكر ويمكن من تحديد جرعة نشطة صيدليا آمنة ومتسامحة / الجدول9.
بينما في التطور السريري للأورام ، قد يكون تحليل العلامات الحيوية في الخزعات أفضل إعداد لإنشاء دليل على آلية الدواء ، فإن عدد الخزعات المتاحة في التجربة عادة ما يكون محدودا جدا10،11. بدلا من ذلك، عينات الدم الطرفية هي قيمة للغاية للتجارب السريرية لأنها تنطوي على إجراء طفيفة التوغل، وسريعة وسهلة للحصول على تسهيل التحليل الطولي، وأقل تكلفة من الخزعات وتوفير معلومات واسعة لرصد في الوقت الحقيقي لنتيجة العلاج. فائدة إضافية لتقييم المؤشرات الحيوية PD في الدم المحيطي هو القدرة على استخدام biosample لتحديد أيضا PK السماح بدقة في تحديد العلاقات الكمية PK / PD والنمذجة PK / PD اللاحقة12،13. يمكن عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النوى (PBMCs) من الدم كله لدراسة علامات البروتين ، والتي تواجه إما تغييرات في مستوى التعبير أو في تعديلاتها بعد الترجمة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام PBMCs لأغراض السمية المناعية14،15، اختبارات وظائف المناعة مثل تقييم السمية الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCC)16 والتحليل اللاجيني من خلال عزل الحمض النووي الريبي. وبالمثل ، يمكن استخدام البلازما من الدم كله لتحديد السيتوكينات لتوصيف الاستجابة المناعية للمريض ، وإجراء دراسات التمثيل الغذائي ، وكذلك لعزل وتسلسل الحمض النووي للورم المتداول (ctDNA) لرصد التطور اللاستنساخي للمرض قيد الاختيار من العامل العلاجي ، مما يوفر في كثير من الأحيان أساسا ميكانيكيا لمقاومة العلاج17و18و19 مما يتيح تطوير الأجيال اللاحقة من العلاجات20. وأخيرا، عزل الخلايا السرطانية المتداولة (CTCs) من الدم المحيطي يسمح لتقييم تطور المرض عن طريق التعداد الطولي، تسلسل الحمض النووي / الحمض النووي الريبي وتحليل البروتين والعلامات الحيوية21. على الرغم من أن هذه العزلة متوافقة مع البروتوكول الموصوف هنا22، فإن انخفاض وفرة CTCs في العديد من أنواع السرطان والمراحل المبكرة من المرض يجعل استخدام أنابيب متخصصة أكثر ملاءمة لتقليل تدهور CTC23.
في السنوات الأخيرة، وقد أدى استخدام الخزعات السائلة تحسين المعلومات التي تم الحصول عليها في التجارب السريرية ومجموعات PBMC وقد أدرجت في العديد من الدراسات لرصد المشاركة المستهدفة وإثبات آلية إما مباشرة في الخلايا السرطانية لبعض أنواع الأورام الخبيثة الدموية، أو على PBMCs أنفسهم كبدائل PD من الخلايا السرطانية24،25،26. إن إعداد عينات عالية الجودة يؤثر بشكل إيجابي على تحديد العلاج الأكثر أمانا وفعالية لأمراض معينة ، ولكن في تجربتنا ، تعرضت جودة استعدادات PBMC التي تم الحصول عليها من مواقع سريرية مختلفة لتباين واسع في الجودة مما أدى إلى عينات غير مناسبة لغرض تحليل المصب. وقد أثر ذلك على كمية بيانات شرطة الولايات المتحدة التي يمكن جمعها من تلك الدراسات.
هنا نحن نصف بالتفصيل بروتوكول سهلة لمتابعة التي تبين كيفية عزل بكفاءة كل من PBMCs وعينات البلازما من سحب الدم واحد في بيئة سريرية. ويستند البروتوكول إلى التعليمات التي قدمتها الشركة المصنعة لأنابيب إعداد الخلايا النووية الأحادية، والتي تتضمن تعديلات حيث سلطت تجربة العالم الحقيقي الضوء على الصعوبات في تنفيذ البروتوكول كما ذكرت المواقع السريرية، مثل قضايا الطرد المركزي، وتأخيرات المعالجة ونقل العينات إلى المبردات. هناك طرق بديلة متاحة تجاريا لاستخدام أنابيب إعداد الخلايا أحادية النووية على أساس فصل تدرج الكثافة باستخدام حلول البوليساكريد مع أو بدون حاجز يفصل المحلول عن الدم27. إذا كان الموقع السريري ذي الصلة بالفعل من ذوي الخبرة الجيدة في هذه المنهجيات البديلة ، يمكن استبدال هذا البروتوكول بشكل مقبول بهذه. في مثل هذه الحالات، يمكن النظر في عاملين: تتطلب بعض الطرق البديلة نقل الدم الكامل من أنبوب تجميع إلى أنبوب إعداد منفصل حيث قد يمثل نقل إضافي للمواد البيولوجية الأولية البشرية خطرا متزايدا قليلا على السلامة، ويعتمد نجاح الطرق التي لا تحتوي على حواجز تفصل الدم عن محلول البوليساكريد على خطوات حاسمة مثل طبقات عينة الدم على متوسط تدرج الكثافة الذي يتطلب تطوير مستوى مكرر من الخبرة التقنية التي لا توجد دائما في بيئة مختبر المستشفى. على الرغم من النقاط المذكورة أعلاه ، فإن الجدوى العامة واستعادة الخلايا قابلة للمقارنة بين هذه التقنيات15،28. ولذلك، فإن اختيار المنهجية يعتمد إلى حد ما على الخبرة التقنية السابقة، ولكن في أيدينا، يمكن استخدام أنابيب إعداد الخلايا أحادية النووية بنجاح في سياق سريري واسع وهي توصيتنا، بخلاف ذلك.
في حين أن إحدى نقاط النهاية لهذا البروتوكول هي إنتاج حبيبات PBMC لمزيد من المعالجة في الليسات ، يمكن تنفيذ التطبيقات النهائية الأخرى لجمع PBMC ، مثل عزل الأحماض النووية ، أو إنتاج لطاخات PBMC أو كتل PBMC المناسبة لأساليب الكيمياء المناعية (IHC). الأهم من ذلك، لأن كل biosample مأخوذة من المرضى يمثل إجراء الغازية على مستوى ما على الأقل، وهذا البروتوكول يزيد من المواد المفيدة من كل عينة عن طريق عزل البلازما أيضا والتي يمكن استخدامها لتحليل السيتوكين، والدراسات الأيضية أو تسلسل ctDNA.
تحليل المؤشرات الحيوية الطرفية في تجارب الأورام هو واحد من العديد من تطبيقات lysates PBMC. ومن الأمثلة على ذلك تقييم الاستجابة للضرر الحمض النووي (DDR) في علاجات مثل العلاج الكيميائي, العلاج الإشعاعي أو استخدام مثبطات الإنزيمات المشاركة في DDR مثل فوسفاتيدلينوستول-3 كيناز ذات الصلة كيناز (PIKKs)7 وPARPs3,13. والهدف من هذه العلاجات هو زيادة تلف الحمض النووي في الخلايا المنتشرة، مما يولد سمية عالية في الخلايا ذات آليات DDR الضعيفة ونقاط التفتيش لدورة الخلايا، مثل الخلايا السرطانية. هنا نقدم مثالا مع دراسة المؤشرات الحيوية DDR في الدم المحيطي تخضع للأشعة السينية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial</td>
			<td>Nalgene, ThermoFisher</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td>To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0990</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical sterile propylene centrifuge tube</td>
			<td>Nunc, ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tube sterile, with attached cap</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3463</td>
			<td>For plasma aliquoting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td>Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Tween 20 Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28360</td>
			<td>Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter or haemocytometer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>We use Countess device and slides but could be other methods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable micropipette allowing 50 &#181;L measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>362761, 362753</td>
			<td>There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-freezing box</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation unit converter</td>
			<td>LabTools</td>
			<td></td>
			<td>http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL horseradish peroxidase substrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>34075</td>
			<td>Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron MultiFocus X-ray cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics</td>
			<td></td>
			<td>To irradiate blood. Other models/makers are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>102706</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-018</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel doc imaging system</td>
			<td>SYNGENE</td>
			<td></td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>This is an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen/dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To flash-freeze samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marvel dried skimmed milk</td>
			<td>Premier Foods</td>
			<td></td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips for range 1-200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>This is an example, cast your own or use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0009</td>
			<td>This is an example.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>This is usually provided in the clinical kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2128</td>
			<td>1:1000 dilution in 5% milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti &#947;H2AX</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2577, lot 11</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS1981 ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81292</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS635 RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 14223</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32420</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 3427, lot 2</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>R0278-50ML</td>
			<td>For cell lysis. This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060010</td>
			<td>Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-030</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4101, 4051</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is for the automated cell counter listed above.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To keep plasma samples and lysates cold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis

تحليل المؤشرات الحيوية في الدم المحيطي أصبحت ذات أهمية متزايدة في التجارب السريرية لإنشاء دليل على آلية لتقييم آثار العلاج، والمساعدة في توجيه الجرعة ووضع الجدول الزمني للعلاجات. من سحب الدم واحد، يمكن عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النووية ومعالجتها لتحليل وقياس علامات البروتين، ويمكن استخدام عينات البلازما لتحليل الحمض النووي الورم المتداولة، السيتوكينات، ونواتج الأيض البلازما. توفر العينات الطولية من العلاج معلومات عن تطور علامة بروتين معينة ، وحالة الطفرة والمناظر الطبيعية المناعية للمريض. ولا يمكن تحقيق ذلك إلا إذا تم تجهيز الدم المحيطي بشكل فعال في المواقع السريرية وتم الحفاظ على العينات بشكل صحيح من السرير إلى المقعد. هنا، نقدم بروتوكولا محسنا للأغراض العامة يمكن تنفيذه في المواقع السريرية للحصول على حبيبات PBMC وعينات البلازما في التجارب السريرية متعددة المراكز، والتي ستمكن المهنيين السريريين في مختبرات المستشفيات من تقديم عينات عالية الجودة بنجاح، بغض النظر عن مستوى خبرتهم التقنية. كما يتم تقديم اختلافات بروتوكول بديلة محسنة لطرق تحليلية أكثر تحديدا في المرحلة النهائية. نحن نطبق هذا البروتوكول لدراسة المؤشرات الحيوية البروتين ضد الاستجابة لأضرار الحمض النووي (DDR) على الدم المشع بالأشعة السينية لإثبات مدى ملاءمة النهج في إعدادات الأورام حيث تم ممارسة أدوية DDR و / أو العلاج الإشعاعي وكذلك في المراحل قبل السريرية حيث يلزم اختبار الفرضية الميكانيكية.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

يفصل هذا البروتوكول التحضير القابل للتنفيذ سريريا ل PBMC والعينات الحيوية للبلازما عالية الجودة في موقع التجارب السريرية التي يمكن استخدامها لتحليل العلامات الحيوية المترجمة.

إعداد الكريات الخلايا أحادية النووية الدم المحيطي والبلازما من سحب الدم واحد في مواقع التجارب السريرية لتحليل العلامات الحيوية

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

PBMC وعينات البلازما واضحة للحصول على وغنية بالمعلومات للغاية في التنمية السريرية في وقت مبكر. يقلل هذا البروتوكول القوي من التغير قبل التحليل الذي تم إدخاله في المواقع السريرية. هذا البروتوكول سريع وسهل، ويتطلب معدات مختبر أساسية وخبرة المشغل الحد الأدنى لمعالجة الدم في PBMCs والبلازما.وهو متوافق مع أيام المختبر المزدحمة في المستشفيات. تحليل المصب لمكونات الدم الناتجة عن هذا البروتوكول يمكن أن تسترشد العلاقات الدوائية والدوائية، وجدولة جرعة الدواء وإثبات المشاركة المستهدفة وتقديم رؤى في آليات العمل المخدرات، ودعم كل من التحليل في الوقت الحقيقي والاستبطاني. نحن نستخدم هذا البروتوكول لدراسات الأورام، وتحديدا لتحليل آليات الاستجابة لأضرار الحمض النووي.ومع ذلك، يمكن أن تكون المواد التي يجمعها هذا البروتوكول ذات صلة في العديد من مجالات المرض والطرائق العلاجية المتعددة. بعد تلقي ثمانية ملليلترات من دم المتبرع لكل عينة ، سجل الوقت الذي تم فيه سحب الدم وعكس كل أنبوب بلطف ثماني إلى عشر مرات قبل نقل عينات الدم المعالجة المضادة للتخثر إلى كل أنبوب من الأنابيب المسماة بالإشعاع. بالنسبة للعينات السريرية، تقوم بالطرد المركزي من الأنابيب مباشرة بعد قلبها.ضع الأنابيب الرمادية 0.2 في خزانة الأشعة السينية الدافئة مسبقا ، أغلق الباب وطبق جرعة رمادية 0.2 على الأنابيب. استبدل الأنابيب المشععة ذات الجرعة المنخفضة بالأنابيب الرمادية السبعة وضبط الجرعة لتطبيق جرعة إشعاعية رمادية سبعة على عينات الإشعاع عالية الجرعة. بعد أن يتم تشعيع كلتا العينتين، احتضان جميع الأنابيب الثلاثة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.نقل العينات إلى أنابيب إعداد الخلية قبل فصل الخلايا مع الطرد المركزي عالي السرعة، مع التأكد من تعيين وحدات x ز أو ما يعادلها RCF. بعد الطرد المركزي، عرض الأنابيب على خلفية مظلمة لتحديد البلازما وخلايا الدم الحمراء وطبقات معطف برتقالي. باستخدام ماصة مصلية، نقل ما يقرب من نصف البلازما إلى جهاز طرد مركزي مخروطي مخروطي 15 ملليلتر دون إزعاج طبقة معطف بافي وتخزين أنبوب البلازما على الجليد الرطب.ثم استخدم ماصة المراعي لنقل PBMC بأكملها التي تحتوي على طبقة معطف برتقالي إلى أنبوب جديد 15 ملليلتر وإضافة درجة حرارة الغرفة PBS إلى PBMC إلى حجم نهائي قدره 15 ملليلتر لكل عينة. اخلط الخلايا برفق عن طريق الانعكاس خمس مرات وجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة أقل ، مع التأكد من التحقق من وحدات الطرد المركزي. يستنشق جميع ما عدا آخر 500 ميكرولتر من supernatant دون إزعاج الكريات.إضافة برنامج تلفزيوني جديد إلى حجم النهائي من 10 ملليلتر لكل أنبوب وإعادة الإنفاق عن طريق عكس بلطف الأنابيب. استخدام 40 ميكرولتر aliquots من الخلايا للعد. بعد العد، وجمع الخلايا مع جهاز طرد مركزي آخر وإزالة أكبر قدر ممكن من supernatant دون إزعاج الكريات.لتخزين PBMC للمعالجة في وقت لاحق، resuspend الكريات في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني الطازجة لكل عينة مع pipetting لطيف ونقل كل تعليق الخلية بأكملها إلى 1.5 ملليلتر المبردة المسمى على الجليد الرطب. ثم فلاش تجميد الخلايا من الطريقة المفضلة ووضعها في مربع تجميد في ناقص 80 درجة. سجل الوقت الذي تم فيه تجميد الخلايا.بدلا من ذلك، إعادة إنفاق الكريات في خليط واحد ملليلتر أو تجميد لكل عينة ونقل تعليق الخلية إلى cryovials المسمى الفردية. ثم وضع الأنابيب وصناديق التجميد المبردة مسبقا لتخزين ناقص 80 درجة مئوية. لتجميد البلازما، إضافة ما يصل إلى واحد ملليلتر aliquots الكثير من البلازما إلى ما يصل إلى كل من خمسة اثنين من الأنابيب الدقيقة ملليلتر دون إزعاج بيليه المتبقية وتسجيل الحجم الإجمالي للبلازما في كل أنبوب.ثم، تجميد على الفور aliquots البلازما في اتجاه تستقيم في الفريزر ناقص 80 درجة مئوية. لتحليل لطخة الغربية من العينات، resuspend بيليه في كل أنبوب مع حجم مناسب من العازلة تحلل تكملها مثبطات البروتيز والفوسفاتاز مساوية لتلك التي من حجم بيليه الخلية مع pipetting لطيف واحتضان عينات الخلية لمدة 10 دقائق على الجليد. في نهاية الحضانة، نقل العينات إلى أنابيب 1.5 ملليلتر وسونيكاتيه لهم مع ثلاث 30 ثانية على 30 ثانية من دورات في أربع درجات مئوية.جمع العينات عن طريق الطرد المركزي ونقل الناطورات إلى أنابيب جديدة 1.5 ملليلتر. ثم، مزيج 40 ميكروغرام لكل عينة مع تحميل العازلة وغلي العينات لمدة خمس دقائق. تحميل 20 ميكروغرام من كل عينة لكل حارة في تكرار في هلام البروتين بيس تريس 4-12٪وتشغيل SDS-PAGE.يختلف عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من ثمانية ملليلترات من الدم وفقا لإعداد المريض والمرض. بشكل عام، بيليه الخلية صغيرة الحجم وشفافة بيضاء اللون. في بعض الأحيان الكريات يمكن أن يكون لها بعض تلوث خلايا الدم الحمراء، مما له تأثير سلبي على نوعية التحضير.يختلف العائد النموذجي من مريض سرطان الدم الليمفاوي المزمن باستخدام هذا البروتوكول من 1.62 مرة 10 إلى الرابع إلى 1.99 مرة 10 إلى الخلايا التاسعة لكل ثمانية ملليلتر من إعداد الخلايا أحادية النوى مع تركيز بروتين نهائي يتراوح بين 1.62 إلى 19.77 ملليغرام لكل ملليلتر. وفي هذا التحليل التمثيلي لثلاث عينات من المرضى، لوحظت زيادة في التعديلات اللاحقة للترجمة بجرعات إشعاعية مؤينة أعلى. ومن المثير للاهتمام أن فوسفور الترنح -telangiectasia تحور وRAD50 كان كبيرا في جرعة منخفضة من 0.2 الرمادية، مما يشير إلى أن هذه التعديلات بعد الترجمية قد يكون من الممكن استجوابها كعلامات بيولوجية دوائية للعلاجات التي تنطوي على توليد فواصل حبلا مزدوجة الحمض النووي مع مجموعة ديناميكية جيدة في الورم، فضلا عن عينات الدم المحيطية.لإعداد عينة الأمثل، معالجة الدم في غضون ساعة واحدة من جمع في درجة حرارة الغرفة، الطرد المركزي العينات بشكل صحيح، وعرض أنبوب على خلفية مظلمة لتكون قادرة على التمييز بين معطف برتقالي.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

التقطير السريع وعزل مكونات الدم الكامل في عينات تم الحصول عليها من إعداد المجتمعية

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

مثلي زرع والأجهزة الطرفية المناعي رصد خلية في نموذج II-45 مسانج الجرذ ورم الظهارة المتوسطة

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

في مقايسات المختبر لتقييم الحاجز الدموي الدماغي تشبه تشكيل سفينة وتشوه

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System

وكرر جمع الدم من الوريد الذيل من الفئران غير تخديره مع نظام لجمع دم فراغ

Blood can be collected from rats in a number of sampling locations. For instance, the tail vein is a superior location for blood sampling. However, the ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

روتين فحص الطريقة المجهرية الدقيقة في عمليات نقل الدم الصفيحات

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

التحليل الكمي لتكوينها الخلوي في الآفات تصلب الشرايين المتقدمة للعضلات الملساء خلية تتبع النسب الفئران

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

توصيف التدفق الخلوي المتزامن لأنواع الخلايا المتعددة التي تم استردادها من الدماغ/الحبل الشوكي من خلال أساليب تجانس مختلفه

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

رصد PD-1-حظر الأجسام المضادة ملزمة الخلايا التائية المستمدة من قطرة من الدم المحيطي

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Evaluation of a Point-of-Care Testing Analyzer for Measuring Peripheral Blood Leukocytes

تقييم محلل اختبار نقطة الرعاية لقياس الكريات البيض في الدم المحيطي

White blood cell (WBC) is an important indicator of inflammation in the body, and it can help distinguish between bacterial and viral infections. At ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

أخذ عينات الدم المتكررة من الوريد تحت الترقوة للفأر الواعي

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...