Name: preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis
Uploaded: 2021-03-20T13:30:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

Vi vil gerne takke alle medlemmer af Translational Medicine på AstraZeneca Oncology Research and Early Development for deres feedback på protokollen, især Hedley Carr, Tammie Yeh og Nathan Standifer for rådgivning om plasma forberedelse til ctDNA analyse, om PBMC isolation, og PBMC cryopreservation og immunophenotyping, hhv.

Informeret patientsamtykke og fuld overholdelse af relevante nationale etiske krav i hver jurisdiktion, f.eks. Sørg for at have fuldt dokumenteret etisk godkendelse, før du begynder noget arbejde på materiale afledt af mennesker. Blod, der anvendes til optimering af denne protokol, blev forsynet med passende samtykke fra Volunteers Advancing Medicine Panel (VAMP) (etisk reference 16/EE/0459, undersøgelse CRF494, sub study 001), der drives af NIHR Cambridge Clinical Research Facility, Cambridge, Det Forenede Kongerige, i henhold til en leveringsaftale om humane biologiske prøver med National Institute for Health Research (NIHR) Cambridge Biomedical Research Centre. AstraZeneca Biobank i Storbritannien er godkendt af Human Tissue Authority (licens nr. 12109) og har National Research Ethics Service Committee (NREC) Approval as a Research Tissue Bank (RTB) (REC No 17/NW/0207).
1. Generel vejledning i forberedelse
BEMÆRK: Alt arbejde med ikke-fastgjort humant materiale såsom blod, plasma og PBMC'er i denne protokol skal fungere under forudsætning af, at disse materialer kan bære potentielt infektiøse stoffer og derfor skal udføres under passende biosikkerhedsforanstaltninger. For patienter, der er blevet testet som negative for kendte patogener, må du ikke antage, at prøverne er ikke-infektiøse, og derfor skal der stadig anvendes passende sikkerhedsforanstaltninger. Affaldsprodukter, der produceres af disse materialer, bør behandles med de samme biosikkerhedsforanstaltninger og bortskaffes i overensstemmelse med lokale regler.
<ol><li>Vælg mellem de to typer mononukleare celleforberedelsesrør, der bruger enten natriumcitrat eller natrium heparin som antikoaguleringsmidler. For mange downstream-applikationer kan disse to antikoaguleringsmidler anvendes i flæng, men begge antikoaguleringsmidler bør testes, før de vælger en til forsøget.</li>
	<li>Etiket 1 8 mL mononukleart celleforberedelsesrør, der skal anvendes til blodopsamling med patientens kodede ID. Hold rørene ved stuetemperatur (18-25 °C).</li>
	<li>1x PBS opbevares ved stuetemperatur (18-25 °C). Brug 30 mL pr. præparat.</li>
	<li>Sørg for, at rør til separate plasmaprøver og kryotatoriet til PBMC-prøven er nøjagtigt mærket med entydige identifikatorer som angivet i det relevante afsnit i laboratoriemanualen.</li>
	<li>Hvis PBMC'er skal anvendes til overvågning af fosforerede proteiner, skal PBS tilsættes fosfatasehæmmere: 5 mL PBS blandes med 50 μL fosfatasehæmmercocktail 2 + 50 μL fosfatasehæmmercocktail 3. Forbered frisk og holde på is indtil brug.</li>
	<li>Hvis PBMCs skal kryopreserveres, skal der tilberedes 1 mL fryseblanding pr. prøve ved at blande 90% FBS + 10% DMSO.</li>
</ol>2. PBMC-samling (figur 1A)
<ol><li>Der trækkes 8 mL blod ind i det mononukleare celleforberedelsesrør ved hjælp af den standardteknik, som fabrikanten har beskrevet. Vend røret forsigtigt 8 til 10 gange for at blande antikoagulant tilsætningsstoffet med blod. Ryst ikke for at undgå hæmolyse. Optag det tidspunkt, hvor blodet blev trukket.</li>
	<li>Efter opsamlingen opbevares røret oprejst ved stuetemperatur indtil centrifugering. Behandl prøverne så hurtigt som muligt, helst inden for en time efter denne blodopsamling, men senest 4 timers efter indsamling. Registrer timingen, når du starter behandlingen af blodet.</li>
	<li>Umiddelbart før centrifugation remix blodprøven ved forsigtigt at vende røret 8 til 10 gange mere.</li>
	<li>Rør-/blodprøverørene centrifuges i en vandret rotor (svinghoved) ved 1.500 – 1.800 x g i 30 minutter ved stuetemperatur (18-25 °C). Sørg for, at alle rør er afbalanceret korrekt.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig01.jpg"> Figur 1: Generel oversigt over protokollen og repræsentative billeder af centrifuge. (A)Skematisk oversigt over protokollen for udarbejdelse af PBMCs og plasma. *Hvis der er tidsbegrænsninger, kan trin 2.4 forkortes til 20 min., og trin 3.3 til 3.6 kan fjernes. ** Tag en aliquot at tælle celler, hvis det kræves. 2 ekstra centrifugeringstrin, der kræves til ctDNA-analyse/metabolomics (B) billede af en sving-out hoved rotorcentrifuge sat til trin 2.4. (C) Billede af rotoren, som omfatter to spande, der indeholder adaptere til spin mononuklear celle forberedelse rør. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
BEMÆRK: x g (også kaldet RCF, relative centrifugalenheder) og RPM (omdrejninger pr. minut) er forskellige enheder. Sørg for at indstille centrifuge til x g (RCF). Brug onlineberegneren (se Materialetabel) til konverteringen. Hvis der kun er en rotor med fast vinkel til rådighed, skal du udføre dette trin i 10 minutter ved 1.500 – 1.800 x g.
<ol start="5"><li>Efter centrifugering skal du kontrollere tilstedeværelsen af et mørkt rødt lag under barrieren (der hovedsagelig indeholder røde blodlegemer) og 2 lag over barrieren. Det øverste lag er plasmaet (stråfarvet), og det hvide lag nedenunder er den buffy frakke, der indeholder PBMCs. Disse lag kan let skelnes, når du ser røret mod en mørk / sort baggrund.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig02.jpg"> Figur 2: Rør til at isolere PBMCs. (A) Billede af rørene før centrifugering (trin 2.4), enten tom (venstre) eller indeholdende blod (højre). (B) Vellykket adskillelse af PBMC-laget efter centrifugering (trin 2.5). (C) Billede af PBMC-laget efter centrifugering og en smule plasma tilbage for at sikre, at alle PBMC-pc'er indsamles (trin 2.7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
BEMÆRK: Hvis disse lag ikke er synlige, indikerer dette sandsynligvis en fejl i opsætningen af centrifugeringsenhederne. Sørg for, at den rigtige centrifugeadapter bruges, og at den korrekte "x g" er indstillet. Gentag trin 2.4.
<ol start="6"><li>Umiddelbart efter centrifugering skal du bruge en serologisk pipette til at overføre ca. halvdelen af plasmaet til et mærket konisk centrifugerør i 15 mL størrelse med hætte, samtidig med at PBMC-laget (ca. 4-5 mL) ikke forstyrres. Opbevar midlertidigt dette rør med plasma på vådis, der skal bruges senere i trin 4. Sæt til side for nu.</li>
	<li>Saml hele PBMC-laget med en Pasteur-pipette ved at placere pipetten i cellernes lag og overføre til et andet konisk centrifugerør i 15 mL størrelse med hætte. Det er acceptabelt også at tage en lille mængde plasma, hvis det er nødvendigt, for helt at få alt PBMC-laget. Lydstyrken er normalt 1-2 mL. Fortsæt straks med trin 3 nedenfor.</li>
</ol>3. PBMC vasketrin
BEMÆRK: Formålet med vasketrinnene er at fortynde og fjerne restplader og plasma fra PBMC-pelletslen. Alle centrifugeringstrin skal udføres ved stuetemperatur (18-25 °C).
<ol><li>Tilsæt stuetemperatur PBS til PBMC-røret for at bringe lydstyrken til 15 mL. Gør røret hætte. Bland celler ved forsigtigt at vende røret 5 gange.</li>
	<li>Centrifuge i 15 min ved 300 x g. Bemærk, at dette er en meget blidere centrifugering end den oprindelige centrifugering.</li>
	<li>Visualiser pellet ved at se røret mod en mørk / sort baggrund. Supernatanten fjernes ved vakuumsugning eller med en pipette (Figur 3A). Supernatanten kasseres, så der efterlades et volumen på ca. 500 μL over den hvidlige farvede PBMC pellet.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig03.jpg"> Figur 3: PBMC pellets. (A)Pellet opnået ved første vasktrin 3.3. (B) Pellet isoleret i den anden vask (trin 3.7). (C) Pellet med højt hæmolyseniveau fremstillet af blod, der er behandlet senere end 4 timer fra blodudtrækningen isoleret i den anden vask (trin 3.6). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<ol start="4"><li>Genbrug cellepillen ved forsigtigt at pipette op og ned i det resterende supernatant.</li>
	<li>Tilsæt yderligere 1x PBS for at bringe lydstyrken til 10 mL. Gør røret hætte. Bland cellerne ved at vende røret forsigtigt 5x. Hvis celletælling er påkrævet i undersøgelsesprotokollen, skal du gå til trin 3.5.1, hvis det ikke er nødvendigt, gå direkte til trin 3.6.<ol>
<li>Tag en 40 μL aliquot af de re-suspenderede celler og bland med 40 μL trypan blå. Tæl de levedygtige celler ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatisk celletæller.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suspensionen centrifuges fra trin 3.5 i 10 min ved 300 x g. Fjern så meget supernatant som det med rimelighed er muligt uden at forstyrre cellepillen.</li>
	<li>Fjern og kassér forsigtigt eventuelle resterende supernatanter over cellepillen ved pipetter ved hjælp af en fin spids Pasteur pipette eller en mikropipette uden at forstyrre cellepillen. Efterlad lidt eller ingen væske over pellet efter at have afsluttet dette trin. Hvis slutpunktet for denne protokol er en PBMC-pellet, skal du gå til trin 3.8. hvis slutpunktet er kryopreserverede PBMCs gå til trin 3.10.</li>
	<li>Der tilsættes 50 μL ny PBS (eller den supplerede PBS, der er udarbejdet i trin 1.5, hvis det er relevant for dit slutpunkt) til pelletlen og pipetten forsigtigt op og ned ved hjælp af en mikropipette for homogent at genbruge alle cellerne. Hele celleaffjedringen overføres til en mærket 1,5 mL kryoovial og anbringes straks på vådis, indtil prøverne fryses.</li>
	<li>De mærkede prøver fryses ved at anbringe dem i flydende nitrogen eller direkte i tøris. Celler kan også fryses ved -80 °C fryser ved hjælp af cellefrysningskasser. I dette tilfælde skal kasserne forelægges helt i -80 °C, før der tilsættes cellerørene. Registrer det tidspunkt, hvor cellepiller blev frosset. Når cellerne fryser, opbevares ved -80 °C, sendes det frosset på tøris.</li>
	<li>For at kryopreservere pbmc'erne kan du eventuelt suspendere pelleten igen i 1 mL af fryseblandingen (trin 1.6) og overføre til et mærket kryovial. Fortsæt som beskrevet i trin 3.9, men i dette tilfælde er det kun acceptabelt at bruge cellefrysningskasser til at fryse prøverne ned. Overførsel til flydende nitrogen til forsendelse og opbevaring efter at have været i fryseboksen i mindst 24 timer.</li>
</ol>4. Trin i plasmaforberedelse (figur 1A)
<ol><li>Efter -80 °C opbevaring af PBMC pellets, nu forberede plasma aliquot, der blev midlertidigt opbevaret på vådis i trin 2.6. Udfør følgende centrifugeringstrin for at tydeliggøre plasmaet, hvis formålet med prøven er ctDNA-analyse, ellers skal du gå direkte til trin 4.2.<ol>
<li>Plasmaet centrifuges i 10 minutter ved 1.600 - 2.000 x g ved 4 – 8 °C i en rotor med fast vinkel (eller 15 minutter i en sving-out rotor).</li>
		<li>Rør forsigtigt plasma-supernatanten af, pas på ikke at forstyrre nogen pellet og overføre til et nyt 15 mL rør. Kasser røret, der indeholder det pelleterede materiale.</li>
		<li>Plasmaet centrifuges i 10 minutter ved 1.600 - 2.000 x g ved 4 – 8 °C i en rotor med fast vinkel (eller 15 minutter i en sving-out rotor).</li>
		<li>Overfør forsigtigt plasma-supernatanten til et nyt 15 mL rør, og sørg for ikke at forstyrre noget pelleteret materiale. Kasser røret, der indeholder det pelleterede materiale. BEMÆRK: Hvis der ikke er en kølet centrifuge til rådighed, skal cellerne holdes på is i 5 minutter mellem hvert spin eller centrifugeprøver i et kølerum.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plasma overføres i 1 mL aliquots til 5 friske 2 mL mikrorør. Brug færre end 5 hætteglas, hvis der ikke er nok plasma til at fylde 5 hætteglas med 1 mL aliquots, og det forventes, at det sidste hætteglas vil indeholde mindre end 1 mL plasma. Hvis der er mere end 5 mL plasma, skal resten kasseres. Registrer det samlede plasmavolumen i hvert rør.</li>
	<li>Plasmaets aliquots fryses straks oprejst ved opbevaring af dem ved -80 °C.</li>
</ol>5. Prøveforsendelse
<ol><li>Send både PBMC pellets og plasmaprøver på tøris.</li>
	<li>Sørg for, at prøven ikke optøs før og under forsendelsen. Der skal pakkes tilstrækkelig tøris sammen med prøverne til at sikre, at de forbliver frosne under hele forsendelsesprocessen under hensyntagen til eventuelle forsinkelser, der kan opstå under transporten.</li>
</ol>6. Bestråling af fuldblod og analyse af DDR's biomarkører (figur 4A)
BEMÆRK: Dette er en ex vivo behandling, som ikke vil være påkrævet i de fleste tilfælde i klinikken, men disse eksperimenter er en værdifuld sonderende strategi for at finde egnede kliniske biomarkører. Blodprøver bør behandles så hurtigt som muligt ved indsamlingen for at sikre de bedste resultater.
<ol><li>Varm røntgenskabet op. Mærke tre 15 mL rør som henholdsvis 0, 0,2 og 7 Gy.</li>
	<li>Tag tre mononukleare celleforberedelsesrør, der indeholder friskt trukket blod fra et enkelt individ, og efter forsigtigt at have vendt rørene 8 til 10 gange overfører blodet til de tre 15 mL rør.</li>
	<li>0,2 Gy-røret anbringes i røntgenskabet, døren lukkes, og 0,2 Gy-dosis påføres røret ved at vælge hyldenummer og dosis. Påfør 7 Gy strålingsdosis på 7 Gy-røret ved at justere den dosis, der er valgt i kabinettet.</li>
	<li>De tre rør inkuberes ved 37 °C i en time.</li>
	<li>Blodet overføres tilbage til mononuklear celleforberedelsesrørene, og PBMC-forberedelsesprotokollen udføres som for en klinisk indstilling fra trin 2.4 til trin 3.8.</li>
	<li>Der tilsættes et volumen lysisbuffer suppleret med protease- og fosfatasehæmmere svarende til cellepelletvolumen (i dette tilfælde 70 μL RIPA-buffer) til hver af cellepillerne, pipetter op og ned og inkuberes på is i 10 min. Udsmykke prøverne, hvis der findes en sonikator (3 cyklusser, 30 s ON / 30 s OFF, 4 °C), alternativt sprøjte prøverne for at bryde nukleinsyrerne for at eliminere viskositet i prøven.</li>
	<li>Prøverne centrifuges i 10 minutter ved ≥ 15.000 x gved 4 °C. Hvert supernatant overføres til et nyt 1,5 mL rør, vurderes kvalitativt hæmolyseniveauet (visuel inspektion) og proteinkoncentrationen måles ved hjælp af enhver foretrukken metode.</li>
	<li>Der blandes 40 μg lysat i alt med prøvebelastningsbuffer, der indeholder SDS og prøvereducerende middel. Kog prøver i 5 minutter i en varmeblok.</li>
	<li>20 μg af hver prøve pr. vognbane indlæses i to eksemplarer i en 4-12% bis-tris proteingel og køre en SDS-PAGE.</li>
	<li>Efter adskillelse overføres proteinerne til en nitrocellulosemembran ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt system (20 V, 10 min) og blokeres med 5 % mælk i TBST.</li>
	<li>Membranen skæres i de relevante molekylære størrelser, og der inkuberes med de primære antistoffer natten over ved 4 °C (se Materialetabel for antistoffer og fortyndinger).</li>
	<li>Fjern de primære antistoffer og vask membranerne 3 gange med TBST i 5 minutter ved stuetemperatur. Inkuber med DE HRP-konjugerede sekundære antistoffer i 45 minutter ved stuetemperatur.</li>
	<li>Vask 3 gange med TBST i 5 min.</li>
	<li>Påfør ECL-reagenset, og analysér de billeder, der er opnået i forhold til HRP-signalet.</li>
</ol>

Alle forfatterne er eller var ansatte og aktionærer i AstraZeneca. VM er ansat i Acerta Pharma, ejer aktier i AstraZeneca og Gilead Sciences.

Præparater af høj kvalitet af PBMCs og plasma, der kan fremstilles robust og reproducerbart på kliniske forsøgssteder, er uvurderlige for at informere om perifere prædiktive og farmakodynamiske translationelle biomarkørslutpunkter. Her har vi leveret en kort, klar protokol, der adresserer de typisk problematiske trin, der hidtil har været sårbare over for udførelsesfejl i et klinisk forsøg. Protokollen kan dog optimeres yderligere, så den opfylder specifikke krav, f.eks. 
Til dette formål har vi vist, hvordan man isolerer både PBMCs og plasma fra fuldblod ved hjælp af mononukleare celleforberedelsesrør til fremstilling af frosne PBMC pellets og frosset plasma, der er egnet til en række downstream-analyser. Vi har gjort opmærksom på særligt kritiske protokoltrin, der involverer centrifugering og identifikation af PBMC-laget i trin 2.5, og PBMC-pellets i trin 3.3 og 3.6. Historisk set, hvor kliniske steder ofte er gået galt, er at indstille centrifuge til de korrekte enheder (forvirrende en RCF eller x g værdi med en RPM-værdi), forsinke behandlingen af blodprøver, temperatur og tilstedeværelsen af store mængder PBS over den frosne celle pellet. I de fleste centrifuge rotorer fejlagtigt ind i en x g værdi som en RPM indstilling vil resultere i betydelig under-centrifugering med en deraf følgende dårligt defineret eller fraværende PBMC lag, og potentielle utilsigtet PBMC kassering under vask trin på grund af ineffektive celle pelleting. Der er dog en mulighed for, at et PBMC-lag ikke er synligt på trods af brug af de rigtige centrifugeringsindstillinger og rotoradapter, hvis patienten har udviklet leukopeni. Denne betingelse kan påvirke patienter indskrevet i onkologi forsøg på grund af kemoterapi eller strålebehandling og bør overvejes. Et andet kritisk punkt, der er blevet gjort klart i protokollen, er, at prøver skal behandles inden for 1-2 timer fra blodudtrækningen for at mindske muligheden for hæmolyse, der påvirker protokollen negativt. Hvis prøverne behandles i løbet af den første time af blodprøveudtrækningen, reduceres desuden variabiliteten ex vivo, hvilket kan have stor indflydelse på udlæsninger af farmakokinetik og på biomarkører, der påvirkes af blodbevarelse eller aktive signalveje, som f.eks. Forsinkelser i prøvebehandlingen kan også have en skadelig virkning på cellegabiliteten , hvis cellerne skal kryopreserveres34. En anden faktor, der kan påvirke både udbyttet og forureningen af røde blodlegemer, er opbevarings- og centrifugeringstemperaturen, som skal opbevares ved stuetemperatur (18-25 °C). Lavere temperaturer øger tætheden af densiteten gradient medium, hvilket resulterer i en højere grad af røde blodlegemer og granulocyt forurening, da disse celler ikke aggregere så godt. På den anden side fører højere temperaturer til PBMCs fanget mellem aggregerede erythrocytter, hvilket reducerer udbyttet afpræparatet 15,27,28. Og endelig er det afgørende, at der ikke er mere end 50-100 μL væske til stede med cellepillen i kryoglen, da dette påvirker koncentrationen af proteinlysater, der opnås i downstream-behandling af disse PBMC-præparater, negativt. Et overskud af væske vil overdilute prøver, hvilket fører til lysater med meget lav proteinkoncentration, der ikke er egnet til biomarkøranalyse. Derudover vil bevarelsen af eventuelle ændringer efter oversættelse blive forringet, og lysisens effektivitet vil også blive stærkt reduceret.
Mononukleare celleforberedelsesrør blev valgt, da de tilbyder den mest enkle måde at isolere både PBMCs og plasma i en enkelt blodprøve til kliniske forsøg med, efter vores erfaring, fremragende reproducerbarhed. Blodbehandlingen kræver ikke højtuddannede operatører, og brugen af et enkelt rør fjerner behovet for at fortynde blodet og dets overførsel til et andet rør, hvilket reducerer farerisikoen; forkorter protokollen på grund af centrifugeringstrinnene med bremser på og alle reagenser er i røret, hvilket reducerer variationen. Det er vores erfaring, at disse fordele opvejer de højere omkostninger ved disse rør sammenlignet med andre klassiske metoder, der kun omfatter brugen af et tæthedsgradientadskillelsesmedium27,28 (£ 410 pr. 60 enheder, mens lymfoprep medium til 66 50-mL præparater er £ 215). De fås i to typer antikoagulanter, heparin og citrat, som begge er sammenlignelige med hensyn til at opretholde funktionaliteten af de isolerede PBMCs35, og derfor vil valget af et antikoagulant i forhold til det andet være baseret på heparinens eller citrats mulige indflydelse i downstream-biomarkørundersøgelserne. Selv om det har vist sig, at EDTA-rør giver det højeste PBMC-isolationsudbytte sammenlignet med heparin eller citrat13, opvejer fordelen ved brugervenlighed af manipulation udelukkende dette forhold. Hvis cytokiner skal analyseres, kan antikoaguleringsmidler have en effekt af de niveauer, der påvises i plasma, hvorfor begge antikoaguleringsmidler bør testes, før der vælges en til det kliniske forsøg36. Hvis plasmaet skal bruges til metabolomics undersøgelser, ville det være foretrukket at bruge heparin som antikoagulant37. Derfor er det eneste punkt tilbage til slutbrugeren eller klinisk forsøg translational videnskabsmand er, om citrat eller heparin vil være mere passende til deres formål, når omkostningerne er blevet vurderet.
Mens fordelene ved at bruge celleforberedelsesrør er talrige sammenlignet med de begrænsninger, de udgør (højere omkostninger og tilgængelighed af et begrænset udvalg af antikoaguleringsmidler), kan den vigtigste begrænsning af brugen af PBMCs eller plasma til at opnå PD-biomarkører i kliniske forsøg, især i onkologi, ikke være relateret til isolationsmetoden. Bortset fra hæmatologiske kræftformer, hvor tumor er direkte udtaget fra perifere blod, for andre kræft indikationer plasma og PBMCs er surrogat væv, som ikke nødvendigvis efterligner den primære tumor. Perifert væv deler muligvis ikke genomet og epigenomet med den primære tumor, derfor er den perifere analyse af biomarkører, der er afhængige af en bestemt tumormutation, hovedsageligt begrænset til ctDNA-analyse (fra plasma) eller CTC'er (ved efterfølgende sortering af PBMC-laget). Hertil kommer, signalering kaskader kørsel eller bidrage til tumor spredning kan ikke være så aktiv i perifere blod. Denne udfordring kan overvindes ved at anvende biomarkøropdagelsesmetoder rettet mod blod8 til at identificere alternative biomarkører eller kobling af ex vivo-behandlinger til isolering af plasma38- og PBMC-præparater26.
I den nuværende protokol kan frosne PBMC pellets let behandles uden for det kliniske sted for at give proteinlysater, som kan evalueres ved hjælp af vestlige blotting- eller ELISA-teknikker. Der er også fremlagt alternative metoder til at anvende PBMCs til at aktivereIHC-metoder( Supplementary File ). Derudover har vi også detaljeret beskrevet muligheden for kryopræserverende PBMCs (se Supplerende Fil) til immuncelleovervågning, en relevant applikation i onkologi, med immun checkpoint-hæmmere og ADC'er, der i stigende grad testes i kliniske forsøg. Vurderingen af immunfunktioner som ADCC16 og immunophenotyping er applikationer, der er kompatible med kryopreserverede PBMCs isoleret fra mononukleare celleforberedelsesrør15. Der er en advarsel om kryopræservering, da det kan fremme nedregulering af visse overflade- og interne markører og kan forringe visse cellefunktioner, men PBMC cryopreservation er den eneste mulige måde at udføre disse assays på grund af tidsbegrænsninger ved håndtering af prøver fra flere kliniske steder til behandling i eksternelaboratorier 14,15, og disse skadelige virkninger kan i høj grad overvindes ved gode optøningsmetoder og hvileperioder39.
Afslutningsvis vil protokollen her tillade pålidelig forberedelse af PBMCs og plasmaprøver i enhver klinisk institution med fælles udstyr og materialer, således at translationelle slutpunkter fra perifert blod kan aktiveres robust i globale kliniske forsøg.
Endelig demonstrerer vi, hvordan analysen af PBMC lysater mekanisk kan informere reaktionen på DNA-skadelige stoffer ved at vise en dosisafhængig postoversættelsesændring af vigtige DDR-faktorer, som kan bruges til at hjælpe med at forme klinisk udvikling. Fremadrettet gennemførelse af metoder, der er mere kvantitative end vestlig blotting (f.eks. massespektrometri40) og kræver mindre inputmateriale (såsom kapillær vestlig blotting og ELISA), vil bidrage til at flytte disse prækliniske resultater i retning af en mere robust, systematisk evaluering af PBMC-patientprøver.

Drug udvikling har til formål at levere nye terapeutiske adressering uopfyldte medicinske behov og mere målrettet, personlig medicin. Flere lægemiddelmekanismer er under aktiv undersøgelse, herunder enzymatisk hæmning såsom kinase1, protease2eller poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) hæmmere3, proteinnedbrydning4, terapeutiske antistoffer5og antistofkonjugerede lægemidler (ADCs)6, blandt mange andre. Et eksempel på bestræbelserne på at opnå bedre behandlinger i onkologi er brugen af kinase-hæmmere med det formål at stoppe de signalkaskader, der holder kræftcellerne breder sig1,7. Måling af de niveauer af substratphoosphorylation, der er specifikke for disse kinaser , er den bedste farmakodynamiske biomarkør til at kvantificere virkningsmekanismen for disse hæmmere8. Andre lægemidler kan modulere ekspressionen af et givet protein, og i så fald er det altafgørende at kunne kvantificere ændringerne i koncentrationen af deres målprotein i længderetningen under hele behandlingsforløbet. Uafhængigt af et lægemiddels eller en patologis karakteristika er evaluering af biomarkører med henblik på at fastslå forholdet mellem lægemidler og målmodulation den bedste praksis i den tidlige kliniske udvikling og gør det muligt at bestemme en sikker og tolereret farmakologisk aktiv dosis/tidsplan9.
Mens der i onkologi klinisk udvikling, biomarkør analyse i biopsier kan være den bedste ramme for at etablere bevis for mekanismen for et lægemiddel, antallet af tilgængelige biopsier i et forsøg er normalt ret begrænset10,11. Alternativt er perifere blodprøver meget værdifulde for kliniske forsøg, fordi de involverer en minimalt invasiv procedure, er hurtige og nemme at opnå, hvilket letter langsgående analyse, er billigere end biopsier og giver enorme oplysninger til realtidsovervågning af resultatet af en behandling. En yderligere fordel ved at vurdere PD biomarkører i perifert blod er evnen til at bruge biosample til også at kvantificere PK tillader nøjagtighed i fastsættelsen PK / PD kvantitative relationer og efterfølgende PK / PD modellering12,13. Perifere blodmononukleare celler (PBMCs) fra fuldblod kan isoleres for at studere proteinmarkører, som oplever enten ændringer i deres udtryksniveau eller i deres postoversættelsesændringer. Derudover kan PBMCs bruges til immunophenotyping formål14,15,immunfunktionalitet assays såsom vurdering af antistof-afhængige cellulære cytotoksicitet (ADCC)16 og epigenetisk analyse gennem RNA isolation. Ligeledes kan plasma fra fuldblod bruges til at kvantificere cytokiner til at karakterisere en patients immunologiske reaktion, til at udføre metaboliske undersøgelser og også til at isolere og sekvensere cirkulerende tumor-DNA (ctDNA) til overvågning af sygdomsklonale udvikling under udvælgelse fra det terapeutiske middel, hvilket ofte giver et mekanistisk grundlag for behandlingsresistens17,18,19, der muliggør udvikling af efterfølgende generationer af terapeutiske20. Endelig giver isolering af cirkulerende tumorceller (CTC' er) fra perifert blod mulighed for evaluering af sygdomsprogression ved langsgående optælling, DNA/RNA-sekventering og proteinbiomarkøranalyse21. Selv om denne isolation er forenelig med den protokol, der er beskrevet heri22, gør den lave forekomst af CTC'er i mange kræfttyper og tidlige stadier af sygdommen brugen af specialiserede rør mere egnet til at minimere CTC-nedbrydning23.
I de senere år har brugen af flydende biopsier forbedret de oplysninger, der er opnået i kliniske forsøg, og PBMC-samlinger er inkluderet i mange undersøgelser for at overvåge målengagement og bevis for mekanisme enten direkte i tumorceller for nogle typer hæmatologiske maligniteter eller på PBMCs selv som PD surrogater af tumorceller24,25,26. Udarbejdelsen af prøver af høj kvalitet har en positiv indvirkning på bestemmelsen af den sikreste og mest effektive behandling af en given patologi, men det er vores erfaring, at kvaliteten af PBMC-præparater fra forskellige kliniske steder har været udsat for stor variation i kvalitet, hvilket resulterer i prøver, der ikke er egnede til downstream-analyse. Dette har påvirket mængden af PD-data, der kan indsamles fra disse undersøgelser.
Her beskriver vi i detaljer en let at følge protokol, der viser, hvordan man effektivt isolerer både PBMCs og plasmaprøver fra en enkelt blodprøve i kliniske omgivelser. Protokollen er baseret på instruktioner fra producenten af de mononukleare celleforberedelsesrør, som indeholder ændringer, hvor erfaringer fra den virkelige verden har fremhævet vanskeligheder med protokoludførelse som rapporteret af kliniske steder, såsom centrifugeringsproblemer, behandlingsforsinkelser og prøveoverførsel til kryovials. Der findes alternative kommercielt tilgængelige metoder til anvendelse af mononukleare celleforberedelsesrør baseret på massefyldegradientseparation ved hjælp af polysaccharidopløsninger med eller uden en barriere, der adskiller opløsningen fra blodet27. Hvis det relevante kliniske sted allerede er godt erfarent i disse alternative metoder, kan denne protokol accepteres erstattet med disse. I sådanne tilfælde kan to faktorer tages i betragtning: Nogle alternative metoder kræver overførsel af fuldblod fra et opsamlingsrør til et separat præparatrør, hvor en yderligere overførsel af humant primært biologisk materiale kan udgøre en let øget sikkerhedsrisiko, og hvor vellykkede metoder uden barrierer, der adskiller blodet fra polysaccharidopløsningen, afhænger af kritiske trin såsom lagdeling af blodprøven på det tæthedsgradientmedium, der kræver udvikling af et raffineret niveau af teknisk ekspertise, der ikke altid findes i et hospitalslaboratorium. De ovennævnte punkter til trods for , den samlede levedygtighed og celle opsving er sammenlignelige mellem disse teknikker15,28. Valget af metoden er derfor noget afhængigt af forudgående teknisk erfaring, men i vores hænder kan mononukleare celleforberedelsesrør bruges med succes i en bred klinisk sammenhæng og er vores ellers vores anbefaling.
Mens et af slutpunkterne i denne protokol er at producere PBMC-pellets til videre behandling i lysater, kan andre endelige anvendelser af PBMC-samlingen implementeres, såsom isolering af nukleinsyrer eller produktion af PBMC-udstrygninger eller PBMC-blokke, der er egnede til immunohistochemistry (IHC) metoder. Det er vigtigt, da hver biosample taget fra patienter repræsenterer en invasiv procedure på mindst et vist niveau, maksimerer denne protokol det nyttige materiale fra hver prøve ved også at isolere plasma, som kan bruges til cytokinanalyser, metabolomiske undersøgelser eller ctDNA-sekventering.
Analysen af perifere biomarkører i onkologiske forsøg er en af de mange anvendelser af PBMC lysater. Et eksempel er evalueringen af DNA-skaderesponsen (DDR) i behandlinger som kemoterapi, strålebehandling eller brug af hæmmere af enzymer, der er involveret iDDR,såsom phosphatidylinositol-3 kinase-relaterede kinases (PIKKs)7 og PARPs3,13. Formålet med disse behandlinger er at øge DNA-skader i formerende celler, som genererer høj toksicitet i celler med nedsat DDR mekanismer og celle cyklus checkpoints, såsom kræftceller. Her præsenterer vi et eksempel med en undersøgelse af DDR biomarkører i perifert blod udsat for røntgenstråler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial</td>
			<td>Nalgene, ThermoFisher</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td>To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0990</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical sterile propylene centrifuge tube</td>
			<td>Nunc, ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tube sterile, with attached cap</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3463</td>
			<td>For plasma aliquoting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td>Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Tween 20 Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28360</td>
			<td>Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter or haemocytometer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>We use Countess device and slides but could be other methods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable micropipette allowing 50 &#181;L measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>362761, 362753</td>
			<td>There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-freezing box</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation unit converter</td>
			<td>LabTools</td>
			<td></td>
			<td>http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL horseradish peroxidase substrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>34075</td>
			<td>Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron MultiFocus X-ray cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics</td>
			<td></td>
			<td>To irradiate blood. Other models/makers are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>102706</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-018</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel doc imaging system</td>
			<td>SYNGENE</td>
			<td></td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>This is an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen/dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To flash-freeze samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marvel dried skimmed milk</td>
			<td>Premier Foods</td>
			<td></td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips for range 1-200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>This is an example, cast your own or use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0009</td>
			<td>This is an example.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>This is usually provided in the clinical kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2128</td>
			<td>1:1000 dilution in 5% milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti &#947;H2AX</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2577, lot 11</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS1981 ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81292</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS635 RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 14223</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32420</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 3427, lot 2</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>R0278-50ML</td>
			<td>For cell lysis. This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060010</td>
			<td>Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-030</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4101, 4051</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is for the automated cell counter listed above.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To keep plasma samples and lysates cold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis

Analyse af biomarkører i perifert blod bliver stadig vigtigere i kliniske forsøg for at etablere bevis for mekanisme til at evaluere virkningerne af behandlingen, og hjælpe guide dosis og tidsplan indstilling af terapeutiske. Fra en enkelt blodprøve kan perifere mononukleare blodceller isoleres og behandles for at analysere og kvantificere proteinmarkører, og plasmaprøver kan bruges til analyse af cirkulerende tumor-DNA, cytokiner og plasmametabolomik. Langsgående prøver fra en behandling giver oplysninger om udviklingen af en given proteinmarkør, patientens mutationsstatus og immunologiske landskab. Dette kan kun opnås, hvis behandlingen af det perifere blod udføres effektivt på kliniske steder, og prøverne bevares korrekt fra seng til bænk. Her præsenterer vi en optimeret generel formål protokol, der kan gennemføres på kliniske steder for at opnå PBMC pellets og plasma prøver i multi-center kliniske forsøg, der vil gøre det muligt for kliniske fagfolk på hospitalet laboratorier med succes at levere prøver af høj kvalitet, uanset deres niveau af teknisk ekspertise. Der præsenteres også alternative protokolvariationer, der er optimeret til mere specifikke downstream-analysemetoder. Vi anvender denne protokol til at studere proteinbiomarkører mod DNA-skaderespons (DDR) på røntgenbestrålet blod for at demonstrere egnetheden af tilgangen i onkologiindstillinger, hvor DDR-lægemidler og / eller strålebehandling er blevet praktiseret såvel som i prækliniske stadier, hvor mekanistisk hypotesetest er påkrævet.

For at forbedre kvaliteten af PBMC-præparater i vores kliniske forsøg har vi genereret en protokol med koncise, klare trin, der kan følges af hospitalslaboratoriefolk, uafhængigt af deres molekylærbiologiske baggrund og laboratoriefærdigheder. Vi har tilpasset producentens protokol, der indeholder ændringer på de trin, hvor udførelsesproblemer er blevet identificeret eller rapporteret fra kliniske steder, der er involveret i forskellige multicenter kliniske forsøg. Protokollen kan dog optimeres yderligere til at opfylde specifikke krav, f.eks. Vi demonstrerer, at DDR kan analyseres i PBMCs ved at se på specifikke biomarkører på DNA-skader genereret af stråling.
De mest almindelige forespørgsler, vi har modtaget fra kliniske steder, vedrører centrifugeringstrinnene, som direkte påvirker at kunne isolere PBMC'er og opnå den endelige PBMC-pellet. Brug af den passende type sving-out hoved rotor centrifuge (Figur 1B, C) er nøglen til succes for protokollen. Men når der kun er en fastvinklet rotorcentrifuge tilgængelig på det kliniske sted, foreslår vi, at du udfører trin 2.4 i en fastvinklet rotor ved samme RCF som for en sving-out hovedrotor, men kun i 10 minutter. Dette sikrer, at et PBMC-lag adskilles fra plasmaet (se figur 2B,C). Mens lagdeling blod på en densitet gradient adskillelse medium kræver en bremse-off centrifugering, blod i mononukleare celle forberedelse rør kan centrifuged med bremser på grund af tilstedeværelsen af en gel barriere i røret, der sikrer bevarelsen af PBMC lag adskilt fra de tættere blodkomponenter27,28.
Mindst 4 mL ikke-fortyndet plasma af høj kvalitet blev fremstillet ved centrifugering af blod i 8 mL-rørformatet, hvilket kunne præciseres yderligere for dets anvendelse i specialiserede analyser såsom ctDNA-sekventering eller metabolomics-undersøgelser29,30 (valgfrit trin 4.1.1-4.1.4). Mængden af isolerede PBMCs, størrelsen af pellets og hæmolyse eller røde blodlegemer forurening har været andre bekymringer, der kommer fra kliniske steder og erfaring med at analysere prøver. Antallet af celler opnået fra 8 mL blod var variabelt afhængigt af patient- og sygdomsindstillingen, men generelt er den opnåede pellet lille i størrelse og af en gennemsigtig / hvid farve (Figur 3A, B). På grund af disse egenskaber er det vigtigt at visualisere pellet mod en mørk baggrund for at undgå dens utilsigtede aspiration under vasketrinnene (2.5 og 3.3). Nogle gange kan pellets have en vis rød farve på grund af forurening af røde blodlegemer (Figur 3C), og dette har en negativ effekt på kvaliteten af præparatet. For at undgå at miste små pellets som dem, der er vist i figur 3, lettes overførsel af PBMC-pellet til et kryovial ved trin 3.7, hvor PBMC-pelletpen genbruges i 50 μL PBS.
Det typiske udbytte ved brug af disse rør og blod fra raske individer varierer mellem 7 til 21 x 106 celler til 8 mL og en cellegendannelse mellem 70 og 80%, som det er vores erfaring, og som det tidligere er blevet vist27,28. Dette afhænger af både de enkelte celleantal og operatoren, og det kan sammenlignes med de cellenumre og cellegendannelsesværdier , der opnås ved hjælp af andre metoder ved hjælp af massefyldegradient (herunder systemer, der anvender rør med en adskillelsesbarriere)15,27,28. Et illustrativt eksempel på variationen i antallet af PBMCs isoleret med denne metode afhængigt af sygdomsindstilling er analysen af PBMC-markører hos kronisk lymfocytisk leukæmi (CLL) patienter. Antallet af celler, der blev genvundet fra et mononukleart celleforberedelsesrør på 8 mL ved anvendelsen af denne protokol, varierede fra 1,62 x 104 til 1,99 x 109 i 45 prøver fra 7 patienter i undersøgelse NCT0332827331 (Tabel 1). En beslægtet parameter er proteinkoncentrationen af PBMC lysater opnået ved denne metode, og dette afhænger af antallet af isolerede celler og effektiviteten af proteinekstraktionen. De cellepiller, der blev lyset i afsnit 6, blev genereret med RIPA-buffer og sonikering (trin 6.6). Resuspensionen af cellepillerne i samme volumen lysisbuffer resulterer normalt i en række koncentrationer fra 3 til 10 mg/mL, og i dette særlige eksempel var lysatkoncentrationerne henholdsvis 6,8, 8,3 og 8,6 mg/mL for henholdsvis 0, 0,2 og 7 Gy. Dette udsættes dog for en høj variation, når der modtages prøver fra kliniske steder, der ikke er optimalt forberedt, patientens sygdom og tilstedeværelsen af hæmoglobin fra kontaminering af røde blodlegemer. F.eks. skal meget små pellets genbruges i en mængde lysisbuffer, der er større end cellepillevolumenet, for at muliggøre både måling af proteinkoncentration og downstream-biomarkøranalyse, hvilket resulterer i mere fortyndede prøver. Hvis en prøvekoncentration er under 1 mg/mL, kan dette i så fald udgøre en udfordring at udføre assays som vestlig skamplet på grund af denne høje fortyndingsfaktor. I de tidligere nævnte CLL-prøver varierede mængden af lysisbuffer, der blev tilsat til genbrug af cellepiller, derimod fra 50 til 500 μL, og proteinkoncentrationen varierede fra 1,62 til 19,77 mg/mL (tabel 1).
Når prøver frembyder kontaminering af røde blodlegemer eller hæmolyse (Figur 3C), bliver proteinkoncentrationen af PBMC-lysatet overvurderet på grund af inddragelsen af hæmoglobin fra erythrocytterne. Dette er grunden til, at man bør foretage en visuel inspektion og anmærkning af sådanne prøver, som beskrevet i trin 6.7 i protokollen. Overbelastningsprøven kan kompensere for tilstedeværelsen af hæmoglobin, når der udføres biomarkøranalyse, for så vidt som en belastningskontrol er inkluderet i analysen. Andre mere kvantitative metoder til måling af hæmolyse kunne gennemføres, såsom måling af absorbans ved 414 nm32.
DDR blev analyseret i PBMCs opnået efter denne kliniske protokol. For at illustrere en situation, der efterligner DNA-skadelige kliniske behandlinger såsom strålebehandling eller kemoterapi, blev fuldblod fra raske frivillige ex vivo udsat for røntgenstråling (Figur 4A). Ioniserende stråling (IR) såsom røntgenstråler fremkalder forskellige typer dna-skader, herunder DNA dobbeltstrengsbrud (DSB'er). DNA-skade sensing af disse læsioner aktiverer PIKKs såsom ataksi-telangiectasia muteret (ATM), ATM og Rad3-relaterede (ATR) og DNA-afhængige protein kinase (DNA-PK), som engagerer DNA reparation mekanismer som homolog rekombination (HR) eller ikke-homologe ende sammenføjning (NHEJ). Aktivering af ATM ved tilstedeværelsen af DSB sker ved, at det rekrutteres til skadesteder af MRN-komplekset (MRE11-RAD50-NBS1), hvilket forårsager ATM-autophosphorylering ved flere restkoncentrationer, herunder Ser1981. Til gengæld aktiveres ATM fosforrylater komponenterne i MRN-komplekset og andre proteiner såsom histonevariant H2AX på Ser139 (hvor pSer139-H2AX også er kendt som γH2AX) for at fremme en strukturel ændring i chromatin, der spænder fra DSB, hvilket letter rekrutteringen af andre DDR-faktorer33. PBMCs reagerer på ioniserende stråling på trods af deres lave spredningshastighed, og massespektrometrimetoder har gjort det muligt at kvantificere opreguleringen af fosforilaterede Ser635 på RAD50 fra ATM. Denne fosforylering reduceres i nærværelse af ATM-hæmmere, og RAD50 pS635 er blevet yderligere valideret som en farmakodynamisk biomarkør til kliniske ATM-hæmmerbehandlinger hos tumorer ved immunohistochemistry8. For at vurdere PBMC'ernes reaktion på stråling blev blod fra raske frivillige udsat for forskellige IR-doser, og der blev indsamlet prøver efter en inkubation på 1 time ved 37 °C (figur 4A). Til dette formål blev blod overført til plastrør for at undgå at reducere udbyttet af PBMC-isolationen på grund af høj temperatur (trin 6.2). Vi analyserede, hvordan ATM blev aktiveret ikke kun ved at se på den tidligere rapporterede RAD50 pS635, men også ATM pS1981 og γH2AX. I de tre undersøgte tilfælde blev der observeret en stigning i disse ændringer efter oversættelsen ved højere IR-doser (figur 4B). Interessant nok var fosforyleringen af ATM og RAD50 betydelig ved den lave dosis på 0,2 Gy, hvilket tyder på, at disse postoversættelsesændringer kan være feasibly afhørt som PD biomarkører til behandlinger, der involverer generering af DNA-DSBs med et godt dynamisk område, ikke kun i tumorprøver, men i perifert blod. Dette gør det muligt at overvåge PD-respons på behandlingen ved at erhverve langsgående prøver gennem behandlingsforløbet. Timingen fra blodudtrækningen til behandlingen af prøverne er afgørende for at sikre, at disse signalkaskader stadig er aktive, da forsinkelser i behandlingen vil påvirke kinetik af sådanne kaskader, og man kan gå glip af fosforyleringshændelserne, der anvendes som fosforikere.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig04.jpg"> Figur 4: PBMC'er, der er isoleret fra ex vivo-bestrålet blod efter den nuværende kliniske protokol, viser biomarkører for at informere om omfanget af de DNA-skader, der forårsages af behandlingen. (A)Skematisk oversigt over protokollen om udarbejdelse af PBMCs og analyse af DDR ved bestråling af fuldblods. *2 ekstra centrifugeringstrin, der kræves til ctDNA-analyse/metabolomik. (B) Vestlige skamplet viser dosis-afhængige opregulering af DDR fosfor-biomarkører i PBMCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Prøve</td>
			<td>Antal PBMCs/ 8 mL blod</td>
			<td>Suppleret RIPA-buffervolumen (μL)</td>
			<td>Endelig koncentration (mg/mL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.1</td>
			<td>39100000</td>
			<td>70</td>
			<td>12.16</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.2</td>
			<td>97400000</td>
			<td>100</td>
			<td>4.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.3</td>
			<td>233000000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.4</td>
			<td>316000000</td>
			<td>150</td>
			<td>16.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.5</td>
			<td>387000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.60</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.6</td>
			<td>459000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.71</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.7</td>
			<td>414000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.8</td>
			<td>253000000</td>
			<td>150</td>
			<td>14.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>A.9</td>
			<td>509000000</td>
			<td>300</td>
			<td>10.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.1</td>
			<td>15200000</td>
			<td>70</td>
			<td>2.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.2</td>
			<td>10500000</td>
			<td>50</td>
			<td>4.59</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.3</td>
			<td>13200000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.4</td>
			<td>34800000</td>
			<td>100</td>
			<td>10.41</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.5</td>
			<td>1620000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.6</td>
			<td>70200000</td>
			<td>100</td>
			<td>9.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.7</td>
			<td>65400000</td>
			<td>100</td>
			<td>12.10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.8</td>
			<td>91100000</td>
			<td>150</td>
			<td>11.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.1</td>
			<td>6330000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.2</td>
			<td>4400000</td>
			<td>150</td>
			<td>19.77</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.3</td>
			<td>68000000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.4</td>
			<td>35100000</td>
			<td>50</td>
			<td>9.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.5</td>
			<td>35400000</td>
			<td>70</td>
			<td>10.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.6</td>
			<td>99200000</td>
			<td>100</td>
			<td>16.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.1</td>
			<td>402000000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.23</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.2</td>
			<td>826000000</td>
			<td>300</td>
			<td>16.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.3</td>
			<td>1990000000</td>
			<td>300</td>
			<td>14.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.4</td>
			<td>1000000000</td>
			<td>300</td>
			<td>18.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.5</td>
			<td>1160000000</td>
			<td>400</td>
			<td>16.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>D.6</td>
			<td>806000000</td>
			<td>400</td>
			<td>19.40</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.1</td>
			<td>302000000</td>
			<td>300</td>
			<td>13.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.2</td>
			<td>990000000</td>
			<td>500</td>
			<td>19.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.3</td>
			<td>1200000000</td>
			<td>400</td>
			<td>17.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.1</td>
			<td>4010000</td>
			<td>50</td>
			<td>1.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.2</td>
			<td>5170000</td>
			<td>50</td>
			<td>2.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.3</td>
			<td>2810000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.4</td>
			<td>3700000</td>
			<td>75</td>
			<td>3.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.5</td>
			<td>3460000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.6</td>
			<td>7060000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.32</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.1</td>
			<td>60700000</td>
			<td>70</td>
			<td>6.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.2</td>
			<td>82100000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.3</td>
			<td>30500000</td>
			<td>70</td>
			<td>8.28</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.4</td>
			<td>134000000</td>
			<td>100</td>
			<td>15.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.5</td>
			<td>91900000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.6</td>
			<td>372000000</td>
			<td>150</td>
			<td>15.88</td>
		</tr>
<tr>
<td>G.7</td>
			<td>574000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.01</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">PBMC-langtidsprøver svarende til 7 patienter</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Cellenummer og proteinkoncentration af PBMC-pellets fra kroniske lymfocytiske leukæmipatienter (CLL). Dataene i denne tabel svarer til 45 PBMC-prøver fra 7 CLL-patienter, der deltog i undersøgelse NCT03328273 indsamlet i mononukleare celleforberedelsesrør. Disse er originale data genereret ved hjælp af prøver fra den citerede undersøgelse31.
Supplerende fil: Alternative protokolindstillinger. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60776/SupplementaryFile_July2020.docx" target="_blank">Klik her for at hente denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

Denne protokol beskriver klinisk implementerbar forberedelse af PBMC- og plasmabiossampler af høj kvalitet på det kliniske forsøgssted, der kan bruges til translationel biomarkøranalyse.

Forberedelse af perifere blod mononukleare celle pellets og plasma fra en enkelt blod draw på kliniske forsøg steder for Biomarkør Analyse

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

PBMC- og plasmaprøver er ligetil at erhverve og meget informative i den tidlige kliniske udvikling. Denne robuste protokol minimerer den præanalysevariation, der introduceres på kliniske steder. Denne protokol er hurtig og nem, hvilket kræver grundlæggende laboratorieudstyr og minimal operatørekspertise til at behandle blodet til PBMCs og plasma.Det er kompatibelt med travle laboratoriedage på hospitaler. Downstream-analyse af blodkomponenter som følge af denne protokol kan informere farmakokinetiske og farmakodynamiske relationer, planlægning af lægemiddeldosis og bevis for målengagement og give indsigt i lægemiddelmekanismer til handling, der understøtter både realtids- og indadvendt analyse. Vi bruger denne protokol til onkologi undersøgelser, specielt til at analysere DNA-skader respons mekanismer.Materialer, der indsamles af denne protokol, kan dog være relevante på tværs af mange sygdomsområder og flere terapeutiske modaliteter. Efter at have modtaget otte milliliter donorblod pr. prøve skal du registrere det tidspunkt, hvor blodet blev trukket, og forsigtigt vende hvert rør otte til 10 gange, før de overførte de antikoagulerende behandlede blodprøver til hvert af rørene mærket til stråling. For kliniske prøver, centrifuge rørene lige efter invertere dem.Placer de 0,2 grå rør i et forvarmet røntgenskab, luk døren og påfør en 0,2 grå dosis på rørene. Udskift de bestrålede lavdosisrør med de syv grå rør, og juster dosis, så der påføres en syvgrå strålingsdosis på højdosisbestrålingsprøverne. Efter at begge prøver er blevet bestrålet, inkuberes alle tre rør ved 37 grader Celsius i en time.Prøverne overføres til celleforberedelsesrør, før cellerne adskilles med højhastigheds centrifugering, og enhederne skal indstilles som x g eller tilsvarende RCF. Efter centrifugationen kan du se rørene på en mørk baggrund for at identificere plasmaet, røde blodlegemer og buffy coat lag. Ved hjælp af en serologisk pipette overføres ca. halvdelen af plasmaet til en mærket 15 milliliter konisk centrifuge uden at forstyrre det buffy lag og opbevare plasmarøret på vådis.Brug derefter en græspipette til at overføre hele PBMC, der indeholder buffy coat-lag, til et nyt 15 milliliter rør og tilsæt rumtemperatur PBS til PBMC til et endeligt volumen på 15 milliliter pr. Prøve. Bland forsigtigt cellerne ved inversion fem gange og opsaml cellerne ved centrifugering ved en lavere hastighed, og sørg for at kontrollere centrifugeringsenhederne. Aspirat alle, men de sidste 500 mikroliter af supernatant uden at forstyrre pellets.Tilsæt frisk PBS til et sidste volumen på 10 milliliter til hvert rør og resuspend ved forsigtigt at vende rørene. Brug 40 mikroliter aliquots af cellerne til optælling. Efter optælling, indsamle cellerne med en anden centrifugering og fjerne så meget supernatant som muligt uden at forstyrre pellets.For at opbevare PBMC til senere behandling, genbruges pellets i 50 mikroliter af friske PBS per prøve med blid pipetting og overføre hver hele celle suspension i en mærket 1,5 milliliter kryokin på våd is. Derefter flash fryse cellerne ved den foretrukne metode og placere dem i en frysning boks på minus 80 grader. Registrer det tidspunkt, hvor cellerne blev frosset.Alternativt kan pellets genbruges i en milliliter eller frysning blanding pr prøve og overføre celle suspensioner til individuelle mærket cryovials. Derefter placeres rørene og forkølede frysekasser til minus 80 grader Celsius opbevaring. For at fryse plasmaet tilsættes op til en milliliter aliquots partier af plasmaet til op til hver af fem to milliliter mikrorør uden at forstyrre den resterende pellet og registrere den samlede mængde plasma i hvert rør.Derefter straks fryse plasma aliquots i en oprejst orientering i en minus 80 grader Celsius fryser. Til western blot-analyse af prøverne blev pelletlen i hvert rør ophældt med en passende mængde lysisbuffer suppleret med protease- og fosfatasehæmmere svarende til cellepillevolumenet med blid pipettering og inkuber celleprøverne i 10 minutter på is. Ved afslutningen af inkubationen overføres prøverne til 1,5 milliliterrør og sonikeres dem med tre 30 sekunder på 30 sekunder fra cyklusser ved fire grader Celsius.Prøverne udtages ved centrifugering, og supernatanterne overføres til nye 1,5 milliliterrør. Bland derefter 40 mikrogram pr. prøve med læssebuffer, og kog prøverne i fem minutter. Indlæs 20 mikrogram af hver prøve pr. vognbane i dubletter i en 4-12%Bis-Tris proteingel og kør en SDS-PAGE.Antallet af celler opnået fra otte milliliter blod varierer afhængigt af patienten og sygdom indstilling. Generelt er cellepillen lille i størrelse og gennemsigtig hvid i farve. Nogle gange kan pellets have en vis forurening af røde blodlegemer, hvilket har en negativ indvirkning på kvaliteten af præparatet.Et typisk udbytte fra en kronisk lymfocytisk leukæmipatient, der bruger denne protokol, varierer fra 1,62 gange 10 til den fjerde til 1,99 gange 10 til de niende celler pr. otte milliliter mononuklear celleforberedelse med en endelig proteinkoncentration på mellem 1,62 og 19,77 milligram pr. milliliter. I denne repræsentative analyse af tre patientprøver blev der observeret en stigning i ændringer efter oversættelsen ved højere ioniserende strålingsdoser. Interessant, fosforylering af ataksi-telangiectasia muteret og RAD50 var betydelig ved den lave dosis på 0,2 grå, hvilket tyder på disse post-translationelle ændringer kan feasibly forhørt som farmakodynamiske biomarkører til behandlinger, der involverer generering af DNA dobbelt streng pauser med en god dynamikområde i tumor, samt perifere blodprøver.For et optimalt prøvepræparat skal blodet behandles inden for en time efter indsamling ved stuetemperatur, centrifuge prøverne korrekt og se røret mod den mørke baggrund for at kunne skelne den buffy frakke.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

Hurtig Fraktionering og Isolering af fuldblod Komponenter i prøver fra en EF-baserede indstilling

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

Orthotopisk Implantation og perifert immuncelle Overvågning i II-45 Syngene Rat mesotheliom Model

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

I Vitro Assays at vurdere blod-hjerne barriere mesh-lignende fartøj dannelse og afbrydelse

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System

Gentagne blod samling fra hale vene af ikke-bedøvede rotter med et vakuum blod indsamlingssystem

Blood can be collected from rats in a number of sampling locations. For instance, the tail vein is a superior location for blood sampling. However, the ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Rutine Screening metode for mikropartikler i trombocyttal transfusioner

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

Kvantitativ analyse af cellulære sammensætning i avancerede aterosklerotiske læsioner af glat muskel celle afstamning sporingen mus

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

Samtidige flow Cytometrisk karakterisering af flere celletyper hentet fra mus hjerne/rygmarv gennem forskellige homogenisering metoder

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

Overvågning af PD-1-Blokerende antistoffer bundet til T-celler afledt af en dråbe perifert blod

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Evaluation of a Point-of-Care Testing Analyzer for Measuring Peripheral Blood Leukocytes

Evaluering af en Point-of-Care testanalysator til måling af perifere blodleukocytter

White blood cell (WBC) is an important indicator of inflammation in the body, and it can help distinguish between bacterial and viral infections. At ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

Gentagen blodprøvetagning fra den subklaviske vene hos bevidst rotte

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...