Name: preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis
Uploaded: 2021-03-20T13:30:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

ברצוננו להודות לכל חברי הרפואה התרגום ב AstraZeneca מחקר אונקולוגי ופיתוח מוקדם על המשוב שלהם על הפרוטוקול, במיוחד הדלי קאר, תמי יה ונתן Standifer עבור ייעוץ על הכנת פלזמה לניתוח ctDNA, על בידוד PBMC, ו PBMC cryopreservation ו immunophenotyping, בהתאמה.

כל המחברים הם או היו עובדים ובעלי מניות של AstraZeneca. VM היא עובדת בחברת אקרטה פארמה, המחזיקה במניות אסטרה-זנקה וגילעד מדעים.

תכשירים באיכות גבוהה של מחשבים אישיים ופלזמה שניתן להכין בצורה איתנה ושחזורית באתרי ניסויים קליניים הם לא יסולא בפז כדי ליידע את הניסוי הקליני היקפי חיזוי פרמקודינמי סמן ביולוגי נקודות קצה. כאן סיפקנו פרוטוקול קצר וברור המטפל בצעדים הבעייתיים בדרך כלל שהיו עד כה פגיעים לשגיאות ביצוע במסגרת ניסוי קליני. עם זאת, ניתן למטב את הפרוטוקול עוד יותר כדי לעמוד בדרישות ספציפיות, כגון אילוצי זמן באתר הקליני או סוג של ניתוחים במורד הזרם (ראה קובץ משלים).
למטרה זו, הראינו כיצד לבודד הן PBMCs ופלזמה מדם שלם באמצעות צינורות הכנת תאים mononuclear לייצר כדורי PBMC קפואים פלזמה קפואה מתאים למגוון של ניתוחים במורד הזרם. הפנינו את תשומת הלב לצעדי פרוטוקול קריטיים במיוחד הכוללים צנטריפוגה וזיהוי של שכבת PBMC בשלב 2.5, וכדורי PBMC בשלבים 3.3 ו- 3.6. מבחינה היסטורית, כאשר אתרים קליניים לעתים קרובות השתבשו הוא בהגדרת הצנטריפוגה ליחידות הנכונות (מבלבל ערך RCF או x g עם ערך סל"ד), עיכוב העיבוד של דגימות דם, טמפרטורה ונוכחות של כמויות גדולות של PBS מעל גלולת התא הקפוא. ברוב רוטורים צנטריפוגה בטעות הזנת ערך x g כהגדרת סל"ד יגרום משמעותית תחת צנטריפוגה עם שכבת PBMC מוגדרת או נעדרת וכתוצאה מכך, ופוטנציאל השמטת PBMC בשוגג במהלך שלבי שטיפה עקב גלולות תאים לא יעילים. עם זאת, קיימת אפשרות כי שכבת PBMC אינה גלויה למרות השימוש בהגדרות הצנטריפוגה הנכונות ומתאם רוטור אם המטופל פיתח לויקופניה. מצב זה יכול להשפיע על חולים שנרשמו לניסויים אונקולוגיים בגלל כימותרפיה או הקרנות ויש לקחת בחשבון. נקודה קריטית נוספת שהובהרה בפרוטוקול היא כי דגימות חייבות להיות מעובדות בתוך 1-2 שעות מן תיקו הדם כדי להקטין את האפשרות של המוליטיזה להשפיע לרעה על הפרוטוקול. יתר על כן, השאיפה לעבד את הדגימות בשעה הראשונה של בדיקת הדם מפחיתה את השונות ex vivo, אשר יכולה להיות השפעה רבה על קריאות פרמקוקינטיקה ועל סמנים ביולוגיים המושפעים משימור דם או מסלולי איתות פעילים, כגון המקרה המוצג באיור 4. עיכובים בעיבוד מדגם יכול להיות גם השפעה מזיקה בכדאיות התא אם התאים הולכים להיות cryopreserved34. גורם נוסף שיכול להשפיע הן על התשואה והן על זיהום תאי הדם האדומים הוא טמפרטורת האחסון והצנטריפוגה, אשר יש לשמור בטמפרטורת החדר (18-25 מעלות צלזיוס). טמפרטורות נמוכות יותר להגדיל את הצפיפות של מדיום שיפוע צפיפות, וכתוצאה מכך רמה גבוהה יותר של תא דם אדום זיהום גרנולוציטים כמו תאים אלה אינם צוברים גם כן. מצד שני, טמפרטורות גבוהות יותר להוביל PBMCs לכודים בין אריתרוציטים מצטברים, ומכאן להפחית את התשואה של ההכנה15,27,28. ולבסוף, זה חיוני כי לא יותר מ 50-100 μL של נוזל נמצאים עם גלולה התא cryovial, כמו זה משפיע לרעה על הריכוז של כל ליזלת חלבון המתקבל בעיבוד במורד הזרם של ההכנות האלה PBMC. עודף של נוזל יהיה overdilute דגימות, המוביל lysates עם ריכוז חלבון נמוך מאוד לא מתאים לניתוח סמנים ביולוגיים. בנוסף, שימור כל שינוי לאחר התרגום ייפגע, וגם יעילות התמוגה תצומצם מאוד.
צינורות הכנת תאים Mononuclear נבחרו כפי שהם מציעים את הדרך הפשוטה ביותר לבודד הן PBMCs ופלזמה בתיקו דם אחד לניסויים קליניים עם, מניסיוננו, רבייה מעולה. עיבוד הדם אינו דורש מפעילים מיומנים מאוד, והשימוש בצינור יחיד מסיר את הצורך בדילול הדם והעברתו לצינור אחר, ומפחית את הסיכון לסכנה; מקצר את הפרוטוקול עקב ביצוע שלבי הצנטריפוגה עם בלמים מופעלים; וכל ריאגנטים נמצאים בצינור, אשר מפחית את השונות. מניסיוננו, יתרונות אלה עולים על העלות הגבוהה יותר של צינורות אלה בהשוואה לשיטות קלאסיות אחרות המרכיבות רק את השימוש באמצעי הפרדת שיפוע צפיפות27,28 (£ 410 לכל 60 יחידות בעוד לימפופראפ בינוני עבור 66 50-mL ההכנות הוא £ 215). הם זמינים בשני סוגים של נוגדי קרישה, הפרין וציטראט, שניהם דומים בשמירה על פונקציונליות של PBMCsמבודדים 35, ולכן, הבחירה של נוגד קרישה אחד על פני השני יהיה מבוסס על השפעה אפשרית של הפרין או ציטראט במחקרים סמן ביולוגי במורד הזרם. אמנם הוכח כי צינורות EDTA לספק את התשואה הגבוהה ביותר בידוד PBMC לעומת הפרין או ציטראט13, היתרון של קלות השימוש של צינור אחד בלבד מניפולציה מאוזן שיקול זה. אם ציטוקינים הולכים להיות מנותחים נוגדי קרישה יכול להיות השפעה של רמות זוהה בפלזמה, ולכן שני נוגדי קרישה צריך להיבדק לפני בחירת אחד לניסוי הקליני36. אם הפלזמה הולכת לשמש למחקרים metabolomics, באמצעות הפרין כמו נוגד קרישה יהיה מועדף37. לכן, הנקודה היחידה שנותרה למשתמש הקצה או מדען תרגום ניסוי קליני היא אם ציטראט או הפרין יהיה מתאים יותר למטרות שלהם לאחר עלויות הוערכו.
בעוד היתרונות של שימוש בצינורות הכנת תאים הם רבים בהשוואה למגבלות שהם מציבים (עלות גבוהה יותר וזמינות של מגוון מוגבל של נוגדי קרישה), המגבלה העיקרית של השימוש ב- PBMCs או פלזמה כדי להשיג סמנים ביולוגיים PD בניסויים קליניים, במיוחד באונקולוגיה, יכול להיות קשור לשיטת הבידוד. למעט סרטן המטולוגי, שבו הגידול נדגם ישירות מדם היקפי, עבור אינדיקציות סרטן אחרות פלזמה ומחשבים אישיים הם רקמות פונדקאיות אשר לא בהכרח לחקות את הגידול העיקרי. רקמה היקפית לא יכול לחלוק את הגנום ואת האפיגנום עם הגידול העיקרי, ולכן, הניתוח ההיקפי של סמנים ביולוגיים התלויים מוטציה גידול ספציפי מוגבל בעיקר ניתוח ctDNA (מפלזמה) או CTCs (על ידי מיון הבא של שכבת PBMC). בנוסף, איתות מפלים נהיגה או תרומה התפשטות הגידול לא יכול להיות פעיל כמו בדם היקפי. אתגר זה ניתן להתגבר על ידי החלת גישות גילוי סמנים ביולוגיים מיקודדם 8 כדי לזהות סמנים ביולוגיים חלופיים או צימוד ex vivo טיפולים לבידוד שלפלזמה 38 ו PBMC הכנות26.
בפרוטוקול הנוכחי כדורי PBMC קפואים ניתן לעבד בקלות את האתר הקליני לתת ליזדיטים חלבון אשר ניתן להעריך על ידי סופג המערבי או טכניקות ELISA. שיטות חלופיות לשימוש במחשבי PCMCs כדי להפוך שיטות IHC לזמינות הוצגו גם הן (קובץ משלים). בנוסף, פירטנו גם את האפשרות של cryopreserving PBMCs (ראה קובץ משלים)לניטור תאים חיסוניים, יישום רלוונטי באונקולוגיה, עם מעכבי נקודת ביקורת חיסונית ו- ADCs נבדק יותר ויותר בניסויים קליניים. ההערכה של פונקציות החיסון כגון ADCC16 ו immunophenotyping הם יישומים התואמים PBMCs cryopreserved מבודד מצינורות הכנת תאים מונונוקולריים15. יש אזהרה על cryopreservation, כפי שהוא יכול לקדם את הרגולציה כלפי מטה של משטח מסוימים סמנים פנימיים ועלול לפגוע בתפקודי תא מסוימים, אולם PBMC cryopreservation היא הדרך האפשרית היחידה לבצע מבחנים אלה בשל אילוצי זמן בעת טיפול דגימות מאתריםקליניים מרובים לעיבוד במעבדות חיצוניות14,15, ואת ההשפעות המזיקות האלה ניתן להתגבר במידה רבה על ידי שיטות הפשרה טובה
לסיכום, הפרוטוקול הניתן כאן יאפשר הכנה מהימנה של מחשבים אישיים ודגימות פלזמה בכל מוסד קליני עם ציוד וחומרים משותפים, כך שנקודות קצה תרגומיות מדם היקפי יוכלו להיות מופעלות באופן חזק בניסויים קליניים גלובליים.
לבסוף, אנו מדגימים כיצד הניתוח של ליסטים PBMC יכול ליידע באופן מכני את התגובה לסוכנים מזיקים לדנ"א על ידי הצגת שינוי פוסט-תרגום תלוי מינון של גורמי DDR מרכזיים, אשר ניתן להשתמש בהם כדי לעזור לעצב את ההתפתחות הקלינית. צופה פני לעתיד, יישום של שיטות כי הם כמותיים יותר מאשר כתמים מערביים (למשל, ספקטרומטריית מסה40) ודורשים פחות חומר קלט (כגון נימי המערבי סופג ELISA) יעזור להעביר את התוצאות הפרה-קוליניות האלה לקראת חזק יותר, הערכה שיטתית יותר של דגימות חולה PBMC.

פיתוח תרופות נועד לספק טיפולים חדשים המטפלים בצרכים רפואיים בלתי מעורערים ורפואה ממוקדת ומותאם אישית יותר. מנגנוני תרופות מרובים נמצאים תחת חקירה פעילה כולל עיכוב אנזימטי כגון קינאז1, פרוטאז2, או פולי (ADP-ריבוז) מעכבי פולימראז (PARP)3, משפילי חלבון4, נוגדנים טיפוליים5, ותרופות הקשורות לנוגדנים (ADCs) 6 ,ביןרבים אחרים. דוגמה למאמצים להשיג טיפולים טובים יותר באונקולוגיה היא השימוש במעכבי קינאז במטרה לעצור את מפל האיתות השומר על תאים סרטניים מתרבים1,7. מדידת רמות זרחון מצע ספציפי קינאזים אלה הוא הסמן הביולוגי הפרמקודינמי הטוב ביותר לכמת את מנגנון הפעולה של מעכבים אלה8. תרופות אחרות עשויות לווסת את הביטוי של חלבון נתון, ובמקרה זה היכולת לכמת את השינויים בריכוז חלבון היעד שלהם לאורך כל הטיפול היא בעלת חשיבות עליונה. לכן, ללא תלות במאפיינים של תרופה או פתולוגיה, הערכה של סמנים ביולוגיים כדי להקים את הפרמקוקינטיקה (PK)/ פרמקודינמיקה (PD) הקשר בין חשיפה לתרופות אפנון היעד הוא הנוהג הטוב ביותר בפיתוח קליני מוקדם ומאפשר קביעת מינון בטוח וסובלני פרמקולוגי פעיל / לוח זמנים9.
בעוד בפיתוח קליני אונקולוגי, ניתוח סמנים ביולוגיים ביופסיות עשוי להיות ההגדרה הטובה ביותר כדי להקים הוכחה של מנגנון של תרופה, מספר הביופסיות הזמינות בניסוי הוא בדרך כלל מוגבל למדי10,11. לחלופין, דגימות דם היקפיות הן בעלות ערך רב לניסויים קליניים משום שהן כרוכות בהליך זעיר פולשני, מהירות וקלות להשגת ניתוח אורך מקל, זולות יותר מביופסיות ומספקות מידע עצום לניטור בזמן אמת של תוצאות הטיפול. יתרון נוסף להערכת סמנים ביולוגיים PD בדם היקפי היא היכולת להשתמש בביו-סמפל גם לכמת PK המאפשר דיוק בקביעת יחסים כמותיים PK / PD ומידול PK / PD הבאים12,13. תאים מונו-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) מדם שלם יכולים להיות מבודדים כדי לחקור סמני חלבון, אשר חווים שינויים ברמת הביטוי שלהם או בשינויים שלאחר התרגום שלהם. בנוסף, PCBMCs יכול לשמש למטרות אימונופנוטיפינג14,15, בדיקות פונקציונליות החיסון כגון הערכת cytotoxicity הסלולר תלויי נוגדנים (ADCC)16 וניתוח אפיגנטי באמצעות בידוד RNA. כמו כן, פלזמה מדם שלם יכולה לשמש לכימות ציטוקינים כדי לאפיין את התגובה החיסונית של המטופל, לבצע מחקרים מטבוליים, וגם לבודד ולרצף במחזור DNA הגידול (ctDNA) לניטור האבולוציה שיבוט של המחלה תחת הבחירה של הסוכן הטיפולי, לעתים קרובות מתן בסיס מכני להתנגדות לטיפול17,18,19 המאפשר התפתחות של הדורות הבאים של טיפולים20. לבסוף, בידוד של תאים סרטניים במחזור (CTCs) מדם היקפי מאפשר הערכה של התקדמות המחלה על ידי ספירה אורך, רצף DNA / RNA וניתוח סמן ביולוגי חלבון21. למרות בידוד זה תואם את הפרוטוקול המתוארבזאת 22, השפע הנמוך של CTCs בסוגי סרטן רבים בשלבים מוקדמים של המחלה עושה את השימוש בצינורות מיוחדים מתאים יותר למזעור השפלה CTC23.
בשנים האחרונות, השימוש בביופסיות נוזליות שיפר את המידע שהושג בניסויים קליניים ואוסף PBMC נכלל במחקרים רבים כדי לפקח על מעורבות היעד והוכחת מנגנון או ישירות בתאי הגידול עבור סוגים מסוימים של ממאירויות המטולוגיות, או על המחשבים עצמם כפונדקאי PD של תאים סרטניים24,25,26. הכנת דגימות באיכות גבוהה משפיעה באופן חיובי על קביעת הטיפול הבטוח והיעיל ביותר לפתולוגיה נתונה אך מניסיוננו, איכות ההכנות של PBMC המתקבלות מאתרים קליניים שונים נתונה לשונות רחבה באיכות וכתוצאה מכך דגימות שאינן מתאימות לצורך ניתוח במורד הזרם. זה השפיע על כמות נתוני PD שניתן לאסוף ממחקרים אלה.
כאן אנו מתארים בפירוט פרוטוקול קל למעקב שמראה כיצד לבודד ביעילות הן PBMCs ודגימות פלזמה מתיקו דם יחיד בסביבה קלינית. הפרוטוקול מבוסס על ההוראות שמספק היצרן של צינורות הכנת התאים המונו-גרעיניים, המשלבים שינויים שבהם הניסיון בעולם האמיתי הדגיש קשיים בביצוע פרוטוקולים כפי שדווחו על ידי אתרים קליניים, כגון בעיות צנטריפוגה, עיכובים בעיבוד והעברת מדגם לקריוביאלים. ישנן שיטות זמינות מסחרית חלופיות לשימוש בצינורות הכנת תאים מונונוקולריים המבוססים על הפרדת שיפוע צפיפות באמצעות פתרונות פוליסכריד עם או בלי מחסום המפריד בין הפתרון לדם27. אם האתר הקליני הרלוונטי כבר מנוסה היטב במתודולוגיות חלופיות אלה, ניתן להחליף פרוטוקול זה באופן מקובל במתודולוגיות אלה. במקרים כאלה, ניתן לשקול שני גורמים: כמה שיטות חלופיות דורשות העברת דם שלם מצינור איסוף לצינור הכנה נפרד שבו העברה נוספת של חומר ביולוגי ראשוני אנושי עשויה להוות סיכון בטיחותי מוגבר במקצת, והצלחת שיטות ללא מחסומים המפרידים בין הדם לתמיסת הפוליסכריד מסתמכת על צעדים קריטיים כגון שכבות דגימת הדם על מדיום הדרגתי צפיפות הדורש פיתוח של רמה מעודנת של מומחיות טכנית לא תמיד נמצא במעבדה בבית החולים. למרות הנקודות לעיל, הכדאיות הכוללת והתאוששות התאים דומות בין טכניקות אלה15,28. הבחירה במתודולוגיה תלויה במידת מה בניסיון הטכני הקודם, אך בידינו ניתן להשתמש בהצלחה בצינורות הכנת תאים מונונוקולריים בהקשר קליני רחב והם ההמלצה שלנו, אחרת.
בעוד נקודת קצה אחת של פרוטוקול זה היא לייצר כדורי PBMC לעיבוד נוסף לתוך lysates, יישומים סופיים אחרים של אוסף PBMC יכול להיות מיושם, כגון בידוד של חומצות גרעין, או לייצר כתמי PBMC או בלוקים PBMC מתאים immunohistochemistry (IHC) שיטות. חשוב לציין, מאז כל biosample נלקח מהחולים מייצג הליך פולשני ברמה מסוימת לפחות, פרוטוקול זה ממקסם את החומר השימושי מכל מדגם על ידי גם בידוד פלזמה אשר ניתן להשתמש בהם עבור ניתוחי ציטוקינים, מחקרים מטבולומיים או רצף ctDNA.
הניתוח של סמנים ביולוגיים היקפיים בניסויים אונקולוגיים הוא אחד היישומים הרבים של ליטסטים PBMC. דוגמה אחת היא הערכה של תגובת נזק DNA (DDR) בטיפולים כגון כימותרפיה, הקרנות או שימוש במעכבי אנזימים המעורבים ב- DDR כגון phosphatidylinositol-3 קינאז הקשורות קינאז (PIKKs)7 ו PARPs3,13. מטרת טיפולים אלה היא להגדיל את נזקי הדנ"א בתאים המתרבים, מה שיוצר רעילות גבוהה בתאים עם מנגנוני DDR לקויים ומחסומים מחזור התא, כגון תאים סרטניים. כאן אנו מציגים דוגמה עם מחקר של סמנים ביולוגיים DDR בדם היקפי נתון צילומי רנטגן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial</td>
			<td>Nalgene, ThermoFisher</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td>To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0990</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical sterile propylene centrifuge tube</td>
			<td>Nunc, ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tube sterile, with attached cap</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3463</td>
			<td>For plasma aliquoting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td>Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Tween 20 Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28360</td>
			<td>Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter or haemocytometer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>We use Countess device and slides but could be other methods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable micropipette allowing 50 &#181;L measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>362761, 362753</td>
			<td>There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-freezing box</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation unit converter</td>
			<td>LabTools</td>
			<td></td>
			<td>http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL horseradish peroxidase substrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>34075</td>
			<td>Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron MultiFocus X-ray cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics</td>
			<td></td>
			<td>To irradiate blood. Other models/makers are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>102706</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-018</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel doc imaging system</td>
			<td>SYNGENE</td>
			<td></td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>This is an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen/dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To flash-freeze samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marvel dried skimmed milk</td>
			<td>Premier Foods</td>
			<td></td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips for range 1-200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>This is an example, cast your own or use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0009</td>
			<td>This is an example.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>This is usually provided in the clinical kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2128</td>
			<td>1:1000 dilution in 5% milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti &#947;H2AX</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2577, lot 11</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS1981 ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81292</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS635 RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 14223</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32420</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 3427, lot 2</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>R0278-50ML</td>
			<td>For cell lysis. This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060010</td>
			<td>Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-030</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4101, 4051</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is for the automated cell counter listed above.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To keep plasma samples and lysates cold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis

ניתוח של סמנים ביולוגיים בדם היקפי הופך להיות חשוב יותר ויותר בניסויים קליניים כדי להקים הוכחה של מנגנון כדי להעריך את ההשפעות של הטיפול, ולעזור להנחות את המינון ואת הגדרת לוח הזמנים של טיפולים. מהגרלת דם אחת, ניתן לבודד ולעבד תאים מונונוקאריים בדם היקפי כדי לנתח ולכמת סמני חלבון, ודגימות פלזמה יכולות לשמש לניתוח דנ"א גידולי במחזור, ציטוקינים ומטבולומי פלזמה. דגימות אורך מטיפול מספקות מידע על האבולוציה של סמן חלבון נתון, מצב המוטציה והנוף החיסוני של המטופל. זה יכול להיות מושגת רק אם העיבוד של הדם ההיקפי מתבצע ביעילות באתרים קליניים ודגימות נשמרים כראוי מן המיטה לספסל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ממוטב לשימוש כללי שניתן ליישם באתרים קליניים להשגת כדורי PBMC ודגימות פלזמה בניסויים קליניים רב מרכזיים, שיאפשר לאנשי מקצוע קליניים במעבדות בית החולים לספק בהצלחה דגימות באיכות גבוהה, ללא קשר לרמת המומחיות הטכנית שלהם. וריאציות פרוטוקול חלופיות מוצגות גם הן הממוטבות לשיטות אנליטיות ספציפיות יותר במורד הזרם. אנו מיישמים פרוטוקול זה לחקר סמנים ביולוגיים של חלבונים נגד תגובת נזקי DNA (DDR) על דם מוקרן ברנטגן כדי להדגים את התאמת הגישה בהגדרות אונקולוגיות שבהן תרגלו תרופות DDR ו/או הקרנות, כמו גם בשלבים פרה-קליניים שבהם נדרשת בדיקת השערה מכנית.

כדי לשפר את איכות ההכנות PBMC בניסויים הקליניים שלנו, יצרנו פרוטוקול עם צעדים תמציתיים וברורים שניתן לעקוב אחריהם על ידי אנשי מעבדה בבית החולים, ללא תלות ברקע הביולוגיה המולקולרית שלהם וכישורי מעבדה. התאמנו את פרוטוקול היצרן המשלב שינויים בשלבים שבהם בעיות ביצוע זוהו או דווחו מאתרים קליניים המעורבים בניסויים קליניים מרובי מרכזים שונים. עם זאת, ניתן למטב את הפרוטוקול עוד יותר כדי לעמוד בדרישות ספציפיות, כגון אילוצי זמן באתר הקליני או סוג של ניתוחים במורד הזרם (ראה קובץ משלים). אנו מראים כי DDR ניתן לנתח PBMCs על ידי התבוננות סמנים ביולוגיים ספציפיים על נזק DNA שנוצר על ידי קרינה.
השאילתות הנפוצות ביותר שקיבלנו מאתרים קליניים מתייחסות לשלבי הצנטריפוגה, אשר משפיעים ישירות על היכולת לבודד בהצלחה מחשבים אישיים ולהשיג את גלולת PBMC הסופית. שימוש בסוג המתאים של צנטריפוגת רוטור ראש מתנדנדת (איור 1B,C)הוא המפתח להצלחת הפרוטוקול. עם זאת, כאשר רק צנטריפוגה רוטור בזווית קבועה זמין באתר הקליני, אנו ממליצים לבצע שלב 2.4 ברוטור בזווית קבועה באותו RCF כמו רוטור ראש מתנדנד אבל רק 10 דקות. פעולה זו מבטיחה ששכבת PBMC מופרדת מהפלזמה (ראו איור 2B,C). בעוד שכבת דם על מדיום הפרדה הדרגתית צפיפות דורש צנטריפוגה בלם, דם בצינורות הכנת תא מונונוקלר יכול להיות צנטריפוגה עם בלמים על בשל נוכחות של מחסום ג'ל בצינור המבטיח שימור של שכבת PBMC מופרד מרכיבי הדם צפופים27,28.
לפחות 4 מ"ל של איכות גבוהה, פלזמה לא מדוללת התקבלו צנטריפוגה של דם בפורמט צינור 8 מ"ל, אשר ניתן להבהיר עוד יותר לשימוש שלה בניתוחים מיוחדים כגון רצף ctDNA או מחקרים metabolomics29,30 (צעדים אופציונליים 4.1.1-4.1.4). כמות המחשבים המבודדים, גודל הכדורים והמוליזה או זיהום תאי הדם האדומים היו חששות אחרים שהגיעו מאתרים קליניים וניסיון בניתוח דגימות. מספר התאים שהתקבלו מדם של 8 מ"ל היה משתנה בהתאם למטופל ולהגדרת המחלה, אך באופן כללי גלולת הכדור המתקבלת קטנה בגודלה, ובצבע שקוף/לבן (איור 3A,B). בשל מאפיינים אלה, חשוב לדמיין את גלולה על רקע כהה, כדי למנוע את שאיפתה בשוגג במהלך שלבי לשטוף (2.5 ו 3.3). לפעמים כדורי יכול להיות קצת צבע אדום עקב זיהום תאי הדם האדומים (איור 3C), ויש לזה השפעה שלילית על איכות ההכנה. כדי למנוע אובדן כדורים קטנים כגון אלה המוצגים באיור 3, העברת גלולת PBMC ל cryovial הוא הקל על ידי שלב 3.7 שבו גלולה PBMC הוא respended ב 50 μL של PBS.
התשואה האופיינית בעת שימוש בצינורות אלה ודם מאנשים בריאים נע בין 7 ל 21 x 106 תאים עבור 8 מ"ל, והתאוששות תאים בין 70 ל 80% כפי שהוא הניסיון שלנו וכפי שהוא הוכח בעבר27,28. זה תלוי הן בספירת התאים הבודדים והן באופרטור והוא דומה למספרי התאים וערכי שחזור התאים המתקבלים בשיטות אחרות באמצעות שיפוע צפיפות (כולל מערכות המשתמשות בצינורות עם מחסום הפרדה)15,27,28. דוגמה הממחישה את השונות במספר המחשבים המבודדים בשיטה זו בהתאם להגדרת המחלה היא ניתוח סמני PBMC בחולי לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL). מספר התאים התאושש מצינור הכנת תאים מונונוקולרי 8 מ"ל בעת החלת פרוטוקול זה השתנה מ 1.62 x 104 ל 1.99 x 109 ב 45 דגימות שהתקבלו 7 חולים במחקר NCT0332827331 (טבלה 1). פרמטר קשור הוא ריכוז החלבון של lysates PBMC המתקבל על ידי שיטה זו, וזה תלוי במספר התאים מבודדים ואת היעילות של מיצוי החלבון. כדורי התא lysed בסעיף 6 נוצרו עם מאגר RIPA sonication (שלב 6.6). ההשעיה מחדש של כדורי התא באותו נפח של מאגר תמוגה בדרך כלל תוצאות בטווח של ריכוזים מ 3 עד 10 מ"ג / מ"ל, ובדוגמה זו במיוחד ריכוזי lysate היו 6.8, 8.3 ו 8.6 מ"ג / מ"ל עבור 0, 0.2 ו 7 Gy, בהתאמה. עם זאת, זה נתון שונות גבוהה בעת קבלת דגימות מאתרים קליניים שלא הוכנו בצורה אופטימלית, מחלת החולה, ואת נוכחותו של המוגלובין מזיהום תאי דם אדומים. לדוגמה, כדורי קטן מאוד צריך להיות בשימוש חוזר בנפח של מאגר תמוגה גדול יותר מאשר נפח גלולה התא כדי לאפשר הן מדידת ריכוז חלבון ניתוח סמן ביולוגי במורד הזרם, וכתוצאה מכך דגימות מדוללות יותר. במקרה כזה, אם ריכוז מדגם הוא מתחת 1 מ"ג / מ"ל זה יכול להוות אתגר לבצע מבחנים כמו כתם מערבי בשל גורם דילול גבוה זה. לעומת זאת, בדגימות CLL שהוזכרו קודם לכן, נפח מאגר התמוגה שנוסף לשימוש חוזר כדורי התא נע בין 50 ל 500 μL, וריכוז החלבון משתרע מ 1.62 עד 19.77 מ"ג / מ"ל (טבלה 1).
כאשר דגימות מציגות זיהום או המוליזה של תאי דם אדומים (איור 3C), ריכוז החלבון של ליסט PBMC הופך להערכת יתר עקב הכללת המוגלובין מהאריתרוציטים. זו הסיבה מדוע יש לבצע בדיקה חזותית וביאור של דגימות כאלה, כמתואר בשלב 6.7 של הפרוטוקול. דגימת טעינה עודפת יכולה לפצות על נוכחות המוגלובין בעת ביצוע ניתוח סמנים ביולוגיים ככל בקרת טעינה כלולה בבחינה. שיטות כמותיות אחרות למדידת המוליטיזה יכולות להיות מיושמות, כגון מדידת ספיגה ב 414 ננומטר32.
DDR נותח PBMCs שהושגו בעקבות פרוטוקול קליני זה. כדי להמחיש מצב המחקה טיפולים קליניים מזיקים DNA כגון הקרנות או כימותרפיה, דם שלם של מתנדבים בריאים היה ex vivo נתון קרינת רנטגן (איור 4A). קרינה מייננת (IR) כגון צילומי רנטגן גורמת לסוגים שונים של נזק לדנ"א, כולל שברי גדילים כפולים (DSB) של DNA. חישת נזקי DNA של נגעים אלה מפעילה PIKKs כגון אטקסיה-telangiectasia מוטציה (כספומט), כספומט Rad3 הקשורים (ATR) ו קינאז חלבון תלוי DNA (DNA-PK), אשר עוסקים מנגנוני תיקון DNA כמו רקומבינציה הומולוגית (HR) או הצטרפות קצה לא הומולוגי (NHEJ). הפעלת כספומט על ידי נוכחות של DSBs מתרחשת על ידי גיוסו לאתרים של נזק על ידי MRN (MRE11-RAD50-NBS1) קומפלקס, גרימת תדלוק אוטומטי כספומט בכמה שאריות כולל Ser1981. בתורו, מופעל כספומט phosphorylates את הרכיבים של קומפלקס MRN וחלבונים אחרים כגון גרסה היסטון H2AX על Ser139 (שם pSer139-H2AX ידוע גם בשם γH2AX) כדי לקדם שינוי מבני הכרומטין פורש מן DSB המאפשר גיוס של גורמי DDR אחרים33. מחשבים מגיבים לקרינה מייננת למרות קצב התפשטות נמוך שלהם ושיטות ספקטרומטריית מסה אפשרו כימות של upregulation של phosphorylated Ser635 על RAD50 על ידי כספומט. זרחון זה מצטמצם בנוכחות מעכבי כספומט ו RAD50 pS635 קיבל תוקף נוסף כסמן ביולוגי פרמקודינמי לטיפולים מעכבי כספומט קליניים בגידולים על ידי אימונוהיסטוכימיה8. כדי להעריך את התגובה של מחשבים אישיים לקרינה, דם של מתנדבים בריאים היה נתון במינונים שונים IR ודגימות נאספו לאחר דגירה 1 שעות ב 37 °C(איור 4A). לשם כך, הדם הועבר לצינורות פלסטיק כדי למנוע הפחתת התשואה של בידוד PBMC עקב טמפרטורה גבוהה (שלב 6.2). ניתחנו כיצד כספומט הופעל לא רק על ידי התבוננות RAD50 pS635 שדווח בעבר, אלא גם כספומט pS1981 ו γH2AX. בשלושת המקרים שנבדקו נצפתה עלייה בשינויים שלאחר התרגום במינונים גבוהים יותר של IR (איור 4B). מעניין, זרחון של כספומט RAD50 היה משמעותי במינון הנמוך של 0.2 Gy, אשר מציע אלה שינויים שלאחר תרגום עשוי להיחקר באופן ריאלי כמו סמנים ביולוגיים PD לטיפולים מעורבים הדור של DSBs DNA עם טווח דינמי טוב, לא רק בדגימות גידול אלא בדם היקפי. זה מאפשר ניטור של תגובת PD לטיפול על ידי רכישת דגימות אורך במהלך הטיפול. העיתוי של משיכת הדם לעיבוד הדגימות הוא קריטי כדי להבטיח מפלים איתות אלה עדיין פעילים כמו עיכובים בעיבוד ישפיעו על הקינטיקה של מפלים כאלה ואפשר לפספס את אירועי זרחן המשמשים phosphomarkers.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/60776/60776fig04.jpg"> איור 4: מחשבים מבודדים מדם מוקרן ex vivo בעקבות הפרוטוקול הקליני הנוכחי להציג סמנים ביולוגיים כדי ליידע על היקף הנזק DNA שנגרם על ידי הטיפול. (A)סקירה סכמטית של הפרוטוקול להכנת מחשבים אישיים וניתוח של DDR על הקרנת דם שלם. *2 שלבי צנטריפוגה נוספים נדרשים לניתוח CTDNA/מטבולומיקה. (B)כתם מערבי המציג upregulation תלוי מינון של סמנים ביולוגיים DDR phospho ב- PBMCs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/60776/60776fig04large.jpg" target="_blank"></a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>לדוגמה</td>
			<td>מספר מחשבים אישיים / 8 מ"ל דם</td>
			<td>נפח מאגר RIPA בתוספת (μL)</td>
			<td>ריכוז סופי (מ"ג/מ"ל)</td>
		</tr>
<tr>
<td>א.1</td>
			<td>39100000</td>
			<td>70</td>
			<td>12.16</td>
		</tr>
<tr>
<td>א.2</td>
			<td>97400000</td>
			<td>100</td>
			<td>4.54</td>
		</tr>
<tr>
<td>א.3</td>
			<td>233000000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.63</td>
		</tr>
<tr>
<td>א.4</td>
			<td>316000000</td>
			<td>150</td>
			<td>16.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>א.5</td>
			<td>387000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.60</td>
		</tr>
<tr>
<td>א.ו. 6</td>
			<td>459000000</td>
			<td>150</td>
			<td>12.71</td>
		</tr>
<tr>
<td>א.7</td>
			<td>414000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>א.8</td>
			<td>253000000</td>
			<td>150</td>
			<td>14.56</td>
		</tr>
<tr>
<td>א.9</td>
			<td>509000000</td>
			<td>300</td>
			<td>10.67</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.1</td>
			<td>15200000</td>
			<td>70</td>
			<td>2.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.2</td>
			<td>10500000</td>
			<td>50</td>
			<td>4.59</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.3</td>
			<td>13200000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.99</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.4</td>
			<td>34800000</td>
			<td>100</td>
			<td>10.41</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.5</td>
			<td>1620000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.11</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.6</td>
			<td>70200000</td>
			<td>100</td>
			<td>9.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.7</td>
			<td>65400000</td>
			<td>100</td>
			<td>12.10</td>
		</tr>
<tr>
<td>B.8</td>
			<td>91100000</td>
			<td>150</td>
			<td>11.82</td>
		</tr>
<tr>
<td>סי.1</td>
			<td>6330000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.2</td>
			<td>4400000</td>
			<td>150</td>
			<td>19.77</td>
		</tr>
<tr>
<td>C.3</td>
			<td>68000000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.96</td>
		</tr>
<tr>
<td>סי.4</td>
			<td>35100000</td>
			<td>50</td>
			<td>9.30</td>
		</tr>
<tr>
<td>סי.5</td>
			<td>35400000</td>
			<td>70</td>
			<td>10.55</td>
		</tr>
<tr>
<td>סי.6</td>
			<td>99200000</td>
			<td>100</td>
			<td>16.19</td>
		</tr>
<tr>
<td>ד.1</td>
			<td>402000000</td>
			<td>70</td>
			<td>7.23</td>
		</tr>
<tr>
<td>ד.2</td>
			<td>826000000</td>
			<td>300</td>
			<td>16.95</td>
		</tr>
<tr>
<td>ד.3</td>
			<td>1990000000</td>
			<td>300</td>
			<td>14.87</td>
		</tr>
<tr>
<td>ד.4</td>
			<td>1000000000</td>
			<td>300</td>
			<td>18.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>ד.5</td>
			<td>1160000000</td>
			<td>400</td>
			<td>16.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>ד.6</td>
			<td>806000000</td>
			<td>400</td>
			<td>19.40</td>
		</tr>
<tr>
<td>אי.1</td>
			<td>302000000</td>
			<td>300</td>
			<td>13.86</td>
		</tr>
<tr>
<td>אי.2</td>
			<td>990000000</td>
			<td>500</td>
			<td>19.04</td>
		</tr>
<tr>
<td>E.3</td>
			<td>1200000000</td>
			<td>400</td>
			<td>17.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.1</td>
			<td>4010000</td>
			<td>50</td>
			<td>1.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>פ.2</td>
			<td>5170000</td>
			<td>50</td>
			<td>2.84</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.3</td>
			<td>2810000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.69</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.4</td>
			<td>3700000</td>
			<td>75</td>
			<td>3.62</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.5</td>
			<td>3460000</td>
			<td>70</td>
			<td>4.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>F.6</td>
			<td>7060000</td>
			<td>50</td>
			<td>3.32</td>
		</tr>
<tr>
<td>ג.1</td>
			<td>60700000</td>
			<td>70</td>
			<td>6.57</td>
		</tr>
<tr>
<td>ג.2</td>
			<td>82100000</td>
			<td>150</td>
			<td>7.78</td>
		</tr>
<tr>
<td>ג.3</td>
			<td>30500000</td>
			<td>70</td>
			<td>8.28</td>
		</tr>
<tr>
<td>ג.4</td>
			<td>134000000</td>
			<td>100</td>
			<td>15.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>ג.5</td>
			<td>91900000</td>
			<td>100</td>
			<td>8.61</td>
		</tr>
<tr>
<td>ג.ו. 6</td>
			<td>372000000</td>
			<td>150</td>
			<td>15.88</td>
		</tr>
<tr>
<td>ג.7</td>
			<td>574000000</td>
			<td>200</td>
			<td>15.01</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="4">דגימות PBMC אורך המתאים 7 חולים</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מספר תא וריכוז חלבון של כדורי PBMC מחולי לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL). הנתונים המוצגים בטבלה זו תואמים 45 דגימות PBMC מ 7 חולי CLL המשתתפים במחקר NCT03328273 שנאספו צינורות הכנת תא מונונוקולרי. אלה הם נתונים מקוריים שנוצרו באמצעות דגימות מהמחקר המצוטט31.
קובץ משלים: אפשרויות פרוטוקול חלופיות. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/60776/SupplementaryFile_July2020.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

פרוטוקול זה מפרט הכנה קלינית ליישום של דגימות PBMC ופלזמה באיכות גבוהה באתר הניסוי הקליני שניתן להשתמש בהן לניתוח סמנים ביולוגיים תרגומיים.

הכנת כדורי תאים מונונוקולריים בדם היקפי ופלזמה מהגרלת דם אחת באתרי ניסוי קליני לניתוח סמנים ביולוגיים

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

PBMC ודגימות פלזמה הם פשוט לרכוש ואינפורמטיבי מאוד בפיתוח קליני מוקדם. פרוטוקול חזק זה ממזער את השונות הטרום-אנליטית שהוצגה באתרים קליניים. פרוטוקול זה הוא מהיר וקל, הדורש ציוד מעבדה בסיסי ומומחיות מפעיל מינימלית כדי לעבד את הדם לתוך PBMCs ופלזמה.זה תואם לימי מעבדה עמוסים בבתי חולים. ניתוח במורד הזרם של רכיבי דם הנובעים מפרוטוקול זה יכול ליידע יחסים פרמקוקינטיים ופרמקודינמיים, תזמון מינון תרופות והוכחת מעורבות היעד ולספק תובנות על מנגנוני פעולה של תרופות, התומכים הן בניתוח בזמן אמת והן בניתוח אינטרוספקטיבי. אנו משתמשים בפרוטוקול זה למחקרים אונקולוגיים, במיוחד כדי לנתח מנגנוני תגובה נזק DNA.עם זאת, חומרים שנאספו על ידי פרוטוקול זה יכולים להיות רלוונטיים על פני תחומי מחלה רבים ואפנים טיפוליות מרובות. לאחר קבלת שמונה מיליליטר של דם תורם לכל דגימה, להקליט את הזמן שבו הדם נמשך בעדינות להפוך כל צינור שמונה עד 10 פעמים לפני העברת דגימות דם מטופלים נוגדי קרישה לתוך כל אחד הצינורות שכותרתו קרינה. לדגימות קליניות, צנטריפוגה הצינורות מיד לאחר היפוך אותם.מניחים את 0.2 צינורות אפורים בארון רנטגן מחומם מראש, לסגור את הדלת ולהחיל מנה אפורה 0.2 על הצינורות. החלף את הצינורות המוקרנים במינון נמוך בשבעת הצינורות האפורים והתאם את המינון כדי להחיל מינון קרינה אפורה שבעה לדגימות הקרינה במינון גבוה. לאחר ששתי הדגימות הוקרנו, דגירו את כל שלושת הצינורות ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.העבר את הדגימות לצינורות הכנת תאים לפני הפרדת התאים עם צנטריפוגה במהירות גבוהה, הקפד להגדיר את היחידות כמו x g או שווה ערך RCF. לאחר הצנטריפוגה, להציג את הצינורות על רקע כהה כדי לזהות את הפלזמה, תא הדם האדום, ושכבות מעיל באפי. באמצעות פיפטה סרולוגית, להעביר כמחצית הפלזמה לתוך צנטריפוגה חרוט 15 מיליליטר שכותרתו מבלי להפריע שכבת מעיל באפי ולאחסן את הצינור של פלזמה על קרח רטוב.לאחר מכן, השתמש פיפטה מרעה להעביר את כל PBMC המכיל שכבת מעיל באפי לתוך צינור חדש 15 מיליליטר ולהוסיף PBS טמפרטורת החדר PBMC לנפח הסופי של 15 מיליליטר לכל מדגם. מערבבים בעדינות את התאים על ידי היפוך חמש פעמים ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה יותר, הקפד לבדוק את יחידות צנטריפוגה. לשאוף את כל אבל האחרון 500 microliters של supernatant מבלי להפריע כדורי.מוסיפים PBS טרי לנפח סופי של 10 מיליליטר לכל צינור ומחדשים על ידי היפוך עדין של הצינורות. השתמש 40 aliquots microliter של התאים לספירה. לאחר הספירה, לאסוף את התאים עם צנטריפוגה אחרת ולהסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר מבלי להפריע כדורי.כדי לאחסן את PBMC לעיבוד מאוחר יותר, resuspend כדורי ב 50 microliters של PBS טריים לכל מדגם עם צינור עדין ולהעביר כל השעיית תא שלם לתוך cryovial 1.5 מיליליטר שכותרתו על קרח רטוב. ואז פלאש להקפיא את התאים בשיטה המועדפת ומניחים אותם בתיבת הקפאה במינוס 80 מעלות. רשום את השעה שבה התאים הוקפאו.לחלופין, resuspend כדורי תערובת אחת מיליליטר או הקפאה לכל מדגם ולהעביר את המתלים התא בודדים שכותרתו cryovials. לאחר מכן הניחו את הצינורות ואת תיבות ההקפאה המצונן מראש עבור מינוס 80 מעלות צלזיוס אחסון. כדי להקפיא את הפלזמה, להוסיף עד aliquots מיליליטר אחד הרבה פלזמה עד כל אחד מחמשת microtubes שני מיליליטר מבלי להפריע גלולה שיורית ולתעד את הנפח הכולל של פלזמה בכל צינור.לאחר מכן, להקפיא מיד את aliquots פלזמה בכיוון זקוף במקפיא מינוס 80 מעלות צלזיוס. לניתוח כתם מערבי של הדגימות, resuspend גלולה בכל צינור עם נפח מתאים של מאגר תמוגה בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז שווה לזה של נפח גלולת התא עם צינור עדין דגירה דגימות התא במשך 10 דקות על הקרח. בסוף הדגירה, להעביר את הדגימות לצינורות 1.5 מיליליטר sonicate אותם עם שלוש 30 שניות על 30 שניות את מחזורי ב 4 מעלות צלזיוס.לאסוף את הדגימות על ידי צנטריפוגה ולהעביר את supernatants לצינורות 1.5 מיליליטר חדשים. לאחר מכן, מערבבים 40 מיקרוגרם לדגימה עם מאגר טעינה ומרתיחים את הדגימות במשך חמש דקות. טען 20 מיקרוגרם של כל דגימה לנתיב בכפילות בג'ל חלבון ביס-טריס של 4-12% והפעל SDS-PAGE.מספר התאים המתקבלים משמונה מיליליטר של דם משתנה בהתאם למטופל ולהגדרת המחלה. באופן כללי, גלולת התא הוא קטן בגודל לבן שקוף בצבע. לפעמים כדורי יכול להיות קצת זיהום תאי דם אדומים, אשר יש השפעה שלילית על איכות ההכנה.תשואה אופיינית מחולה לוקמיה לימפוציטית כרונית באמצעות פרוטוקול זה משתנה בין 1.62 פעמים 10 לרביעי עד 1.99 פעמים 10 לתאים התשיעיים לכל שמונה מיליליטר מונונוקלר הכנת תא עם ריכוז חלבון סופי הנע בין 1.62 ל 19.77 מיליגרם למיליליטר. בניתוח מייצג זה של שלוש דגימות חולים, נצפתה עלייה בשינויים שלאחר התרגום במינוני קרינה מייננת גבוהים יותר. מעניין, הזרחן של אטקסיה-telangiectasia מוטציה RAD50 היה משמעותי במינון הנמוך של 0.2 אפורים, אשר מציע אלה שינויים שלאחר תרגום עשוי להיחקר באופן ריאלי כמו סמנים ביולוגיים פרמקודינמיים לטיפולים מעורבים הדור של DNA כפול גדיל שובר עם טווח דינמי טוב בגידול, כמו גם דגימות דם היקפיות.להכנת מדגם אופטימלי, לעבד את הדם בתוך שעה אחת של איסוף בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה הדגימות כראוי, ולהציג את הצינור על רקע כהה כדי להיות מסוגל להבחין בין מעיל באפי.

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

פלזמה מהירה ובידוד של מרכיבי דם שלמים בדגימות שהתקבלה מהגדרה מבוססת-קהילה

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

ניטור נייד Orthotopic השרשה והיקפי חיסון במודל השני-45 syngeneic עכברוש מזותליומה

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System

חזר על איסוף דם של וריד הזנב של חולדות שאינם מרדימים עם מערכת איסוף דם ואקום

Blood can be collected from rats in a number of sampling locations. For instance, the tail vein is a superior location for blood sampling. However, the ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

השגרה הקרנת שיטה עבור Microparticles ב עירויי טסיות

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

ניתוח כמותי של הרכב הסלולר בנגעים טרשת עורקים מתקדמת של שריר חלק תא שושלת היוחסין-עקיבה עכברים

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

אפיון מרובה של סוגי תאים שאוחזרו ממוח העכבר/חוט השדרה דרך שיטות הומוקות שונות

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

ניטור PD-1-חסימת נוגדנים המאוגדים לתאי T נגזר טיפת דם היקפי

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Evaluation of a Point-of-Care Testing Analyzer for Measuring Peripheral Blood Leukocytes

הערכה של מנתח בדיקת נקודת טיפול למדידת לויקוציטים בדם היקפי

White blood cell (WBC) is an important indicator of inflammation in the body, and it can help distinguish between bacterial and viral infections. At ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

דגימת דם חוזרת מהווריד הסובקלבי של חולדה מודעת

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...