Name: preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis
Uploaded: 2021-03-20T13:30:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis at JoVE.com

हम प्रोटोकॉल पर उनकी प्रतिक्रिया के लिए एस्ट्राजेनेका ऑन्कोलॉजी रिसर्च एंड अर्ली डेवलपमेंट में ट्रांसलेशनल मेडिसिन के सभी सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं, विशेष रूप से हेडली कैर, टैमी ये और नाथन स्टैंडीफर सीटीडीएनए विश्लेषण के लिए प्लाज्मा तैयारी पर सलाह के लिए, पीबीएमसी अलगाव पर, और पीबीएमसी क्रायोप्रिजर्वेशन और इम्यूनोफेनोटाइपिंग, क्रमशः।

सभी लेखक हैं या एस्ट्राजेनेका के कर्मचारी और हितधारक थे। वीएम Acerta फार्मा के एक कर्मचारी है, AstraZeneca और गिलाद विज्ञान में शेयर का मालिक है ।

दवा विकास का उद्देश्य अपूरित चिकित्सा जरूरतों और अधिक लक्षित, व्यक्तिगत चिकित्सा को संबोधित करते हुए नए चिकित्सीय प्रदान करना है । कई दवा तंत्र सक्रिय जांच के अधीन हैं, जिनमें किनेज़1,प्रोटीज2,या पॉली (एडीपी-रिबोज) पॉलीमरेज (एआरपी) अवरोधक3,प्रोटीन विक्टर्स4,चिकित्सीय एंटीबॉडी5,और एंटीबॉडी-कंजूस्ड दवाएं (एडीसी)6,कई अन्य लोगों के बीच शामिल हैं। ऑन्कोलॉजी में बेहतर उपचार प्राप्त करने के प्रयासों का एक उदाहरण कैंसर कोशिकाओं को1,7तक पहुंचाने वाले सिग्नलिंग कैस्केड को रोकने के लक्ष्य के साथ काइनेज अवरोधकों का उपयोग है । उन किनास के लिए विशिष्ट सब्सट्रेट फॉस्फोरिलेशन के स्तर को मापना सबसे अच्छा फार्माकोडायनामिक बायोमार्कर है जो इन अवरोधकों की कार्रवाई के तंत्र की मात्रा निर्धारित करता है8. अन्य दवाएं किसी दिए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति को संशोधित कर सकती हैं, और उस मामले में उपचार के दौरान देशांतर में अपने लक्ष्य प्रोटीन की एकाग्रता में परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम होने के नाते सर्वोपरि है। इसलिए, दवा या विकृति की विशेषताओं से स्वतंत्र, दवा जोखिम और लक्ष्य मॉड्यूलेशन के बीच फार्माकोकाइनेटिक्स (पीके)/फार्माकोडायनामिक्स (पीडी) संबंध स्थापित करने के लिए बायोमार्कर का मूल्यांकन प्रारंभिक नैदानिक विकास में सबसे अच्छा अभ्यास है और एक सुरक्षित और सहन की गई औषधीय रूप से सक्रिय खुराक/अनुसूची9के निर्धारण में सक्षम बनाता है ।
जबकि ऑन्कोलॉजी नैदानिक विकास में, बायोप्सी में बायोमार्कर विश्लेषण दवा के तंत्र का प्रमाण स्थापित करने के लिए सबसे अच्छी सेटिंग हो सकती है, परीक्षण में उपलब्ध बायोप्सी की संख्या आमतौर पर10,11तक सीमित होती है। वैकल्पिक रूप से, परिधीय रक्त के नमूने नैदानिक परीक्षणों के लिए अत्यधिक मूल्यवान हैं क्योंकि उनमें न्यूनतम आक्रामक प्रक्रिया शामिल है, अनुदैर्ध्य विश्लेषण को सुविधाजनक रूप से प्राप्त करने में त्वरित और आसान हैं, बायोप्सी की तुलना में कम महंगे हैं और उपचार के परिणाम की वास्तविक समय निगरानी के लिए विशाल जानकारी प्रदान करते हैं। परिधीय रक्त में पीडी बायोमार्कर का आकलन करने के लिए एक अतिरिक्त लाभ बायोसैंपल का उपयोग करने की क्षमता है ताकि पीके/पीडी मात्रात्मक संबंधों और बाद में पीके/पीडी मॉडलिंग12,13का निर्धारण करने में सटीकता की अनुमति देने के लिए भी पीके की मात्रा निर्धारित की जा सके । पूरे रक्त से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं (पीबीएमसी) को प्रोटीन मार्कर का अध्ययन करने के लिए अलग किया जा सकता है, जो या तो उनके अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन या उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों में अनुभव करते हैं। इसके अलावा, पीबीएमसी का उपयोग इम्यूनोफेनोटाइपिंग उद्देश्यों के लिए किया जा सकता है14,15,प्रतिरक्षा कार्यक्षमता के बारे में जैसे एंटीबॉडी-निर्भर सेलुलर साइटोटॉक्सिटी (एडीसीसी)16 और आरएनए अलगाव के माध्यम से एपिजेनेटिक विश्लेषण का आकलन करना। इसी तरह, पूरे रक्त से प्लाज्मा का उपयोग एक रोगी की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की विशेषता के लिए साइटोकिन्स को निर्धारित करने, मेटाबोलिक अध्ययन करने के लिए, और चिकित्सीय एजेंट से चयन के तहत रोग के क्लोनल विकास की निगरानी के लिए ट्यूमर डीएनए (सीटीडीएनए) को अलग और अनुक्रमित करने के लिए किया जा सकता है, अक्सर उपचार प्रतिरोध के लिए एक यंत्रवादी आधार प्रदान करता है17,18,19 चिकित्सीय20की बाद की पीढ़ियों के विकास को सक्षम करता है। अंत में, परिधीय रक्त से परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं (सीटीसी) के अलगाव देशांतर गणना, डीएनए/आरएनए अनुक्रमण और प्रोटीन-बायोमार्कर विश्लेषण21द्वारा रोग प्रगति के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है । यद्यपि यह अलगाव22में वर्णित प्रोटोकॉल के अनुकूल है , लेकिन कैंसर के कई प्रकारों और रोग के शुरुआती चरणों में सीटीसी की कम बहुतायत सीटीसी के क्षरण को कम करने के लिए विशेष ट्यूबों का उपयोग अधिक उपयुक्त बनाती है23.
हाल के वर्षों में, तरल बायोप्सी के उपयोग ने नैदानिक परीक्षणों में प्राप्त जानकारी में सुधार किया है और पीबीएमसी संग्रह को कई अध्ययनों में शामिल किया गया है ताकि कुछ प्रकार के हेमेटोलॉजिकल घातक के लिए ट्यूमर कोशिकाओं में सीधे लक्ष्य सगाई और तंत्र के प्रमाण की निगरानी की जा सके, या पीबीएमसी पर खुद को ट्यूमर कोशिकाओं के पीडी सरोगेट्स के रूप में24,25, 26। उच्च गुणवत्ता वाले नमूनों की तैयारी सकारात्मक प्रभावों को किसी दिए गए विकृति के लिए सबसे सुरक्षित और सबसे प्रभावोत्पादक उपचार का निर्धारण करती है लेकिन हमारे अनुभव में, विभिन्न नैदानिक साइटों से प्राप्त पीबीएमसी तैयारियों की गुणवत्ता गुणवत्ता में व्यापक परिवर्तनशीलता के अधीन रही है जिसके परिणामस्वरूप नमूने नीचे विश्लेषण के उद्देश्य के लिए उपयुक्त नहीं हैं। इससे उन अध्ययनों से एकत्र किए जा सकें पीडी डेटा की मात्रा प्रभावित हुई है ।
यहां हम विस्तार से प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए एक आसान वर्णन करते हैं जो दिखाता है कि नैदानिक सेटिंग में एक ही रक्त ड्रा से पीबीएमसी और प्लाज्मा दोनों नमूनों को कुशलतापूर्वक अलग किया जाए। प्रोटोकॉल मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों के निर्माता द्वारा प्रदान किए गए निर्देशों पर आधारित है, जिसमें संशोधनों को शामिल किया गया है जहां वास्तविक दुनिया के अनुभव ने नैदानिक साइटों द्वारा रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल निष्पादन में कठिनाइयों को उजागर किया है, जैसे कि अपकेंद्री मुद्दों, प्रसंस्करण में देरी और क्रायोविल्स को नमूना हस्तांतरण। पॉलीसैकराइड समाधानों के साथ या बिना किसी बाधा के उपयोग के घनत्व ढाल पृथक्करण के आधार पर मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों के उपयोग के लिए वैकल्पिक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध तरीके हैं जो समाधान को रक्तसेअलग करते हैं । यदि प्रासंगिक नैदानिक साइट पहले से ही इन वैकल्पिक पद्धतियों में अच्छी तरह से अनुभवी है, तो इस प्रोटोकॉल को इन के साथ स्वीकार्य रूप से प्रतिस्थापित किया जा सकता है। ऐसे मामलों में, दो कारकों पर विचार किया जा सकता है: कुछ वैकल्पिक तरीकों को एक संग्रह ट्यूब से एक अलग तैयारी ट्यूब में पूरे रक्त के हस्तांतरण की आवश्यकता होती है जहां मानव प्राथमिक जैविक सामग्री का एक अतिरिक्त हस्तांतरण थोड़ा बढ़ा हुआ सुरक्षा जोखिम पेश कर सकता है, और पॉलीसैकराइड समाधान से रक्त को अलग करने वाली बाधाओं के बिना तरीकों की सफलता महत्वपूर्ण कदमों पर निर्भर करती है जैसे कि घनत्व ढाल माध्यम पर रक्त को लेयरिंग करना, जिसमें तकनीकी विशेषज्ञता के परिष्कृत स्तर के विकास की आवश्यकता होती है। उपरोक्त बिंदुओं के बावजूद, समग्र व्यवहार्यता और सेल रिकवरी इन तकनीकों15,28केबीच तुलनीय है। इसलिए, कार्यप्रणाली का विकल्प कुछ हद तक पूर्व तकनीकी अनुभव पर निर्भर है, लेकिन हमारे हाथों में, मोनोन्यूक्लियर सेल तैयारी ट्यूबों का व्यापक नैदानिक संदर्भ में सफलतापूर्वक उपयोग किया जा सकता है और हमारी, अन्यथा, सिफारिश है।
जबकि इस प्रोटोकॉल का एक अंत बिंदु lysates में आगे प्रसंस्करण के लिए पीएमसी छर्रों का उत्पादन करना है, पीबीएमसी संग्रह के अन्य अंतिम अनुप्रयोगों को लागू किया जा सकता है, जैसे न्यूक्लिक एसिड का अलगाव, या इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) विधियों के लिए उपयुक्त पीबीएमसी स्मीयरों या पीबीएमसी ब्लॉकों का उत्पादन। महत्वपूर्ण बात यह है कि चूंकि रोगियों से लिया गया प्रत्येक बायोसैंपल कम से कम कुछ स्तर पर एक आक्रामक प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करता है, इसलिए यह प्रोटोकॉल प्लाज्मा को अलग करके प्रत्येक नमूने से उपयोगी सामग्री को अधिकतम करता है जिसका उपयोग साइटोकिन विश्लेषण, मेटाबोलॉमिक अध्ययन या सीटीडीएनए अनुक्रमण के लिए किया जा सकता है।
ऑन्कोलॉजी परीक्षणों में परिधीय बायोमार्कर का विश्लेषण पीबीएमसी के कई अनुप्रयोगों में से एक है। इसका एक उदाहरण कीमोथेरेपी, रेडियोथेरेपी या डीडीआर में शामिल एंजाइमों के अवरोधकों जैसे फॉस्फेटिडिलिनोसिटॉल-3 किनेस से संबंधित किनेसिस (पीआईकेके)7 और PARPs3, 13जैसे उपचारों में डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) का मूल्यांकन है। इन उपचारों का उद्देश्य कोशिकाओं के प्रसार में डीएनए क्षति को बढ़ाना है, जो बिगड़ा डीडीआर तंत्र और कोशिका चक्र चौकियों, जैसे कैंसर कोशिकाओं के साथ कोशिकाओं में उच्च विषाक्तता उत्पन्न करता है । यहां हम एक्स-रे के अधीन परिधीय रक्त में डीडीआर बायोमार्कर के अध्ययन के साथ एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL cryovial</td>
			<td>Nalgene, ThermoFisher</td>
			<td>5000-1020</td>
			<td>To store PBMC pellets and re-suspended PBMCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0990</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical sterile propylene centrifuge tube</td>
			<td>Nunc, ThermoFisher</td>
			<td>339651</td>
			<td>Other brands can be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL screw cap tube sterile, with attached cap</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>3463</td>
			<td>For plasma aliquoting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28358</td>
			<td>Final is 25 mM Tris, 0,15 M NaCl; pH 7,5. This is an example, you can prepare your own stock or use a different provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X TBS Tween 20 Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>28360</td>
			<td>Or supplement TBS with 0.05% to prepare TBST buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter or haemocytometer</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>AMQAX1000</td>
			<td>We use Countess device and slides but could be other methods.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adjustable micropipette allowing 50 &#181;L measurements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer CPT mononuclear cell preparation tube (Na-citrate or Na-heparin) 8 mL</td>
			<td>BD</td>
			<td>362761, 362753</td>
			<td>There are 4 mL tubes but if possible 8 mL tubes are recommended to obtain more PBMCs from a single blood draw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-freezing box</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>5100-0001</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation unit converter</td>
			<td>LabTools</td>
			<td></td>
			<td>http://www.labtools.us/centrifugation-speed-rpm-to-g-conversion/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL horseradish peroxidase substrate</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>34075</td>
			<td>Use your preferred reagent according to the sensitivity required to detect your biomarker by western blot. Other systems can be used such as IRDye secondary antibodies with imaging systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Faxitron MultiFocus X-ray cabinet</td>
			<td>Faxitron Bioptics</td>
			<td></td>
			<td>To irradiate blood. Other models/makers are available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), heat inactivated</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>102706</td>
			<td>Use your preferred provider. Ued for PBMC cryopreservation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine tip, sterile 1.5 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-018</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-angle rotor centrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Optional for preparation of plasma for ctDNA/metabolomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel doc imaging system</td>
			<td>SYNGENE</td>
			<td></td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To denature lysates prior to run them in western blot, any maker equipped with suitable tube adaptors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horizontal rotor (swing-out head) centrifuge</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>Heraeus Megafuge 40R</td>
			<td>This is an example</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen/dry ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To flash-freeze samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marvel dried skimmed milk</td>
			<td>Premier Foods</td>
			<td></td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette tips for range 1-200 &#181;L</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To handle small volumes (i.e. western blot, transfer PBMC pellets to 1.5 mL tubes)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4-12% Bis-Tris protein gel, 1 mm, 10 wells</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0321BOX</td>
			<td>This is an example, cast your own or use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0007</td>
			<td>For imaging HRP developed membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE Sample Reducing Agent (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>NP0009</td>
			<td>This is an example.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>This is usually provided in the clinical kit.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P5726-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitor cocktail 3</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>P0044-1ML</td>
			<td>Optional for step 3.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti GAPDH</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2128</td>
			<td>1:1000 dilution in 5% milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti &#947;H2AX</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 2577, lot 11</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS1981 ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab81292</td>
			<td>1:2000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti pS635 RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 14223</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total ATM</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32420</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti total RAD50</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>CST 3427, lot 2</td>
			<td>1:1000 dilution in 5 % milk TBST</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MERK</td>
			<td>R0278-50ML</td>
			<td>For cell lysis. This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01060010</td>
			<td>Used for 3 cycles at 30 s on/ 30 s off, 4 oC. If using a different instrument, adjust number of cycles and intensity according to your sonicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 1.7 mL Pasteur pipettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-030</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile serological pipettes (5 and 10 mL volume)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>4101, 4051</td>
			<td>This is an example, use your preferred provider</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>ThermoScientific</td>
			<td>T10282</td>
			<td>This is for the automated cell counter listed above.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wet ice</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To keep plasma samples and lysates cold</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of peripheral blood mononuclear cell pellets and plasma from a single blood draw at clinical trial sites for biomarker analysis

परिधीय रक्त में बायोमार्कर का विश्लेषण नैदानिक परीक्षणों में तेजी से महत्वपूर्ण होता जा रहा है ताकि उपचार के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए तंत्र का प्रमाण स्थापित किया जा सके, और चिकित्सा विज्ञान की खुराक और अनुसूची सेटिंग में मदद मिल सके। एक रक्त ड्रा से, परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है और प्रोटीन मार्कर का विश्लेषण और मात्रा निर्धारित करने के लिए संसाधित किया जा सकता है, और प्लाज्मा नमूनों का उपयोग ट्यूमर डीएनए, साइटोकिन्स और प्लाज्मा मेटाबोलोमिक्स परिसंचारी के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। उपचार से देशांतर नमूने किसी दिए गए प्रोटीन मार्कर के विकास, उत्परिवर्तनीय स्थिति और रोगी के प्रतिरक्षा परिदृश्य के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। यह तभी प्राप्त किया जा सकता है जब परिधीय रक्त का प्रसंस्करण नैदानिक साइटों में प्रभावी ढंग से किया जाता है और नमूनों को बिस्तर से बेंच तक ठीक से संरक्षित किया जाता है। यहां, हम एक अनुकूलित सामान्य उद्देश्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जिसे बहु-केंद्र नैदानिक परीक्षणों में पीबीएमसी छर्रों और प्लाज्मा नमूनों को प्राप्त करने के लिए नैदानिक साइटों पर लागू किया जा सकता है, जो अस्पताल प्रयोगशालाओं में नैदानिक पेशेवरों को तकनीकी विशेषज्ञता के अपने स्तर की परवाह किए बिना उच्च गुणवत्ता वाले नमूने सफलतापूर्वक प्रदान करने में सक्षम बनाएगा। वैकल्पिक प्रोटोकॉल विविधताएं भी प्रस्तुत की जाती हैं जो अधिक विशिष्ट डाउनस्ट्रीम विश्लेषणात्मक तरीकों के लिए अनुकूलित होती हैं। हम एक्स-रे विकिरणित रक्त पर डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) के खिलाफ प्रोटीन बायोमार्कर का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल को लागू करते हैं ताकि ऑन्कोलॉजी सेटिंग्स में दृष्टिकोण की उपयुक्तता को प्रदर्शित किया जा सके जहां डीडीआर दवाओं और/या रेडियोथेरेपी का अभ्यास किया गया है और साथ ही प्रीक्लिनिकल चरणों में जहां मशीनी परिकल्पना परीक्षण की आवश्यकता है ।

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Preparation of Peripheral Blood Mononuclear Cell Pellets and Plasma from a Single Blood Draw at Clinical Trial Sites for Biomarker Analysis

यह प्रोटोकॉल नैदानिक परीक्षण स्थल पर उच्च गुणवत्ता वाले पीएमसी और प्लाज्मा बायोसैंपलों की नैदानिक रूप से कार्यान्वयन योग्य तैयारी का विवरण देता है जिसका उपयोग ट्रांसलेशनल बायोमार्कर विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।

बायोमार्कर विश्लेषण के लिए नैदानिक परीक्षण स्थलों पर एक एकल रक्त ड्रा से परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर सेल छर्रों और प्लाज्मा की तैयारी

Analysis of biomarkers in peripheral blood is becoming increasingly important in clinical trials to establish proof of mechanism to evaluate effects of ...

पीबीएमसी और प्लाज्मा नमूने प्रारंभिक नैदानिक विकास में प्राप्त करने और अत्यधिक जानकारीपूर्ण करने के लिए सरल हैं। यह मजबूत प्रोटोकॉल नैदानिक साइटों पर पेश किए गए प्री-एनालिटिकल परिवर्तनशीलता को कम करता है। यह प्रोटोकॉल तेज और आसान है, जिसके लिए बुनियादी प्रयोगशाला उपकरण और न्यूनतम ऑपरेटर विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है ताकि रक्त को पीबीएमसी और प्लाज्मा में संसाधित किया जा सके।यह अस्पतालों में व्यस्त प्रयोगशाला दिनों के साथ संगत है । इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप रक्त घटकों का डाउनस्ट्रीम विश्लेषण फार्माकोकाइनेटिक और फार्माकोडायनामिक संबंधों, दवा खुराक शेड्यूलिंग और लक्ष्य सगाई के सबूत को सूचित कर सकता है और वास्तविक समय और आत्मनिरीक्षण विश्लेषण दोनों का समर्थन करते हुए कार्रवाई के दवा तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। हम ऑन्कोलॉजी अध्ययन के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हैं, विशेष रूप से डीएनए क्षति प्रतिक्रिया तंत्र का विश्लेषण करने के लिए।हालांकि, इस प्रोटोकॉल द्वारा एकत्र की गई सामग्री कई रोग क्षेत्रों और कई चिकित्सीय तौर-तरीकों में प्रासंगिक हो सकती है। प्रति नमूना दाता रक्त के आठ मिलीलीटर प्राप्त करने के बाद, उस समय को रिकॉर्ड करें जिस पर रक्त खींचा गया था और विकिरण के लिए लेबल की गई प्रत्येक ट्यूब में रक्त के नमूनों का इलाज करने से पहले प्रत्येक ट्यूब को आठ से 10 बार धीरे से उलटा करता है। नैदानिक नमूनों के लिए, उन्हें उलटा करने के बाद ट्यूबों को अपकाइज करें।एक पूर्व गर्म एक्स-रे कैबिनेट में 0.2 ग्रे ट्यूब रखें, दरवाजा बंद करें और ट्यूबों पर 0.2 ग्रे खुराक लागू करें। सात ग्रे ट्यूबों के साथ कम खुराक विकिरणित ट्यूबों की जगह और उच्च खुराक विकिरण नमूनों के लिए एक सात ग्रे विकिरण खुराक लागू करने के लिए खुराक समायोजित करें । दोनों नमूनों को विकिरणित करने के बाद, एक घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर ट्यूबों के सभी तीन इनक्यूबेट ।उच्च गति अपकेंद्रित्र के साथ कोशिकाओं को अलग करने से पहले नमूनों को सेल तैयारी ट्यूबों में स्थानांतरित करें, जिससे इकाइयों को एक्स जी या समकक्ष आरसीएफ के रूप में सेट करना सुनिश्चित किया जा सके। अपकेंद्रित्र के बाद, प्लाज्मा, लाल रक्त कोशिका, और बफी कोट परतों की पहचान करने के लिए एक अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ ट्यूबों को देखें। एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, प्लाज्मा के लगभग आधे हिस्से को बफी कोट परत को परेशान किए बिना 15 मिलीलीटर शंकुकीय अपकेंद्रित्र में स्थानांतरित करें और गीली बर्फ पर प्लाज्मा की ट्यूब को स्टोर करें।फिर, एक चारागाह पिपेट का उपयोग करें ताकि बफी कोट परत वाले पूरे पीबीएमसी को एक नई 15 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित किया जा सके और पीबीएमसी में कमरे के तापमान पीबीएस को प्रति नमूना 15 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में जोड़ा जा सके। धीरे से पांच बार उलटा द्वारा कोशिकाओं मिश्रण और एक कम गति से अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा, अपकेंद्रित्र इकाइयों की जांच करने के लिए सुनिश्चित कर रही है । सभी लेकिन छर्रों परेशान बिना सुपरनैंट के अंतिम 500 माइक्रोलीटर आकांक्षी।प्रत्येक ट्यूब में 10 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में ताजा पीबीएस जोड़ें और धीरे-धीरे ट्यूबों को उलटा करके पुनर्निर्भर करें। गिनती के लिए कोशिकाओं के 40 माइक्रोलीटर एलिकोट्स का उपयोग करें। गिनती के बाद, कोशिकाओं को एक और अपकेंद्री के साथ इकट्ठा करें और छर्रों को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना सुपरनेट निकालें।बाद में प्रसंस्करण के लिए पीबीएमसी को स्टोर करने के लिए, कोमल पाइपिंग के साथ प्रति नमूना ताजा पीबीएस के 50 माइक्रोलीटर में छर्रों को फिर से खर्च करें और प्रत्येक पूरे सेल निलंबन को गीली बर्फ पर 1.5 मिलीलीटर क्रायोवियल लेबल में स्थानांतरित करें। फिर पसंदीदा विधि से कोशिकाओं को फ्लैश करें और उन्हें शून्य से 80 डिग्री पर फ्रीजिंग बॉक्स में रखें। उस समय को रिकॉर्ड करें जिस पर कोशिकाएं जम गई थीं।वैकल्पिक रूप से, प्रति नमूना एक मिलीलीटर या फ्रीजिंग मिश्रण में छर्रों को फिर से खर्च करें और सेल निलंबन को व्यक्तिगत लेबल वाले क्रायोविअल्स में स्थानांतरित करें। फिर ट्यूबों और पूर्व ठंडा ठंड बक्से शून्य से ८० डिग्री सेल्सियस भंडारण के लिए रखा । प्लाज्मा फ्रीज करने के लिए, अवशिष्ट गोली को परेशान किए बिना पांच दो मिलीलीटर माइक्रोट्यूब में से प्रत्येक तक प्लाज्मा के एक मिलीलीटर एलिकोट्स बहुत सारे जोड़ें और प्रत्येक ट्यूब में प्लाज्मा की कुल मात्रा रिकॉर्ड करें।फिर, तुरंत एक शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में एक ईमानदार अभिविन्यास में प्लाज्मा aliquots फ्रीज। नमूनों के पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए, प्रत्येक ट्यूब में गोली को लाइसिस बफर की उचित मात्रा के साथ फिर से खर्च करें, जो कोमल पिपटिंग के साथ सेल पेलेट की मात्रा के बराबर प्रोटीज और फॉस्फेटेस अवरोधकों के साथ पूरक है और बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेल नमूनों को इनक्यूबेट करता है। इनक्यूबेशन के अंत में, नमूनों को 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित करें और उन्हें चार डिग्री सेल्सियस पर चक्र से 30 सेकंड पर तीन 30 सेकंड के साथ सोनिकेट करें।अपकेंद्रित्र द्वारा नमूने ले लीजिए और नए 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए सुपरनेटेंट स्थानांतरित करें। फिर, लोडिंग बफर के साथ प्रति नमूना 40 माइक्रोग्राम मिलाएं और नमूनों को पांच मिनट के लिए उबालें। 4-12% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जेल में डुप्लिकेट में प्रति लेन प्रत्येक नमूने के 20 माइक्रोग्राम लोड करें और एक एसडीएस-पेज चलाएं।आठ मिलीलीटर रक्त से प्राप्त कोशिकाओं की संख्या रोगी और रोग सेटिंग के अनुसार भिन्न होती है। सामान्य तौर पर, सेल गोली आकार में छोटी और पारदर्शी सफेद रंग में होती है। कभी-कभी छर्रों में कुछ लाल रक्त कोशिका संदूषण हो सकता है, जिसका तैयारी की गुणवत्ता पर नकारात्मक प्रभाव पड़ता है।इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने वाले क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया रोगी से एक विशिष्ट उपज 1.62 गुना 10 से चौथे से 1.99 गुना 10 तक होती है, जो नौवीं कोशिकाओं को प्रति आठ मिलीलीटर मोनोन्यूक्लियर सेल तैयार करने के लिए होती है, जिसमें अंतिम प्रोटीन एकाग्रता 1.62 से 19.77 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर के बीच होती है। तीन रोगियों के नमूनों के इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, उच्च आयनीकरण विकिरण खुराक पर अनुवाद के बाद संशोधनों में वृद्धि देखी गई। दिलचस्प बात यह है कि एटैक्सिया-तेलंगिएकीय म्यूटेड और RAD50 का फॉस्फोरिलेशन 0.2 ग्रे की कम खुराक पर पर्याप्त था, जिससे पता चलता है कि इन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को ट्यूमर में एक अच्छी गतिशील रेंज के साथ डीएनए डबल स्ट्रैंड ब्रेक की पीढ़ी से जुड़े उपचारों के लिए फार्माकोडायनामिक बायोमार्कर के रूप में व्यावहारिक रूप से पूछताछ की जा सकती है।एक इष्टतम नमूना तैयारी के लिए, कमरे के तापमान पर संग्रह के एक घंटे के भीतर रक्त की प्रक्रिया, नमूनों को सही ढंग से अपकेंद्री, और बफी कोट को अलग करने में सक्षम होने के लिए अंधेरे पृष्ठभूमि के खिलाफ ट्यूब देखें।

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid Fractionation and Isolation of Whole Blood Components in Samples Obtained from a Community-based Setting

एक समुदाय आधारित सेटिंग से प्राप्त नमूनों में रैपिड fractionation और पूरे रक्त घटकों के अलगाव

Collection and processing of whole blood samples in a non-clinical setting offers a unique opportunity to evaluate community-dwelling individuals both ...

Orthotopic Implantation and Peripheral Immune Cell Monitoring in the II-45 Syngeneic Rat Mesothelioma Model

द्वितीय -45 syngeneic चूहा Mesothelioma के मॉडल में ओर्थोटोपिक आरोपण और परिधीय इम्यून सेल निगरानी

The enormous upsurge of interest in immune-based treatments for cancer such as vaccines and immune checkpoint inhibitors, and increased understanding of ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

रक्त मस्तिष्क की बाधा मेष की तरह पोत संरचना और व्यवधान का आकलन करने के लिए विट्रो एसेस में

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Repeated Blood Collection from Tail Vein of Non-Anesthetized Rats with a Vacuum Blood Collection System

एक वैक्यूम रक्त संग्रह प्रणाली के साथ गैर Anesthetized चूहों की पूंछ नस से दोहराया रक्त संग्रह

Blood can be collected from rats in a number of sampling locations. For instance, the tail vein is a superior location for blood sampling. However, the ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

प्लेटलेट आधान में Microparticles के लिए नियमित जांच विधि

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Quantitative Analysis of Cellular Composition in Advanced Atherosclerotic Lesions of Smooth Muscle Cell Lineage-Tracing Mice

चिकनी मांसपेशी कोशिका वंश के उन्नत atherosclerotic घावों में सेलुलर संरचना का मात्रात्मक विश्लेषण-चूहों अनुरेखण

Atherosclerosis remains the leading cause of death worldwide and, despite countless preclinical studies describing promising therapeutic targets, novel ...

Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods

माउस ब्रेन/स्पाइनल कॉर्ड से विभिन्न समरूपीकरण विधियों के माध्यम से प्राप्त कई सेल प्रकारों का एक साथ प्रवाह साइटोमेट्रिक लक्षण वर्णन

Recent advances in viral vector and nanomaterial sciences have opened the way for new cutting-edge approaches to investigate or manipulate the central ...

Monitoring PD-1-Blocking Antibodies Bound to T Cells Derived from a Drop of Peripheral Blood

निगरानी पीडी-1-अवरुद्ध एंटीबॉडी टी कोशिकाओं के लिए बाध्य परिधीय रक्त की एक बूंद से व्युत्पन्न

Immune checkpoint inhibitors, including PD-1&#8211;blocking antibodies, have significantly improved treatment outcomes in various types of cancer. The ...

Evaluation of a Point-of-Care Testing Analyzer for Measuring Peripheral Blood Leukocytes

परिधीय रक्त ल्यूकोसाइट्स को मापने के लिए एक पॉइंट-ऑफ-केयर परीक्षण विश्लेषक का मूल्यांकन

White blood cell (WBC) is an important indicator of inflammation in the body, and it can help distinguish between bacterial and viral infections. At ...

Repetitive Blood Sampling from the Subclavian Vein of Conscious Rat

सचेत चूहे के सबक्लेवियन नस से दोहराए जाने वाले रक्त नमूने

Rats are widely used in pharmacokinetics (PK) and toxicokinetic (TK) studies that need to collect a certain amount of blood at specific time points to ...